本发明涉及一种免疫细胞培养基，具体涉及一种无血清免疫细胞培养基，本发明还涉及其制备方法。
背景技术：
树突细胞(dendriticcells，dc)，因其外形如神经细胞树突而得名，约占血液中白细胞总数的0.2％，但目前被认为是免疫系统中最具抗原呈递能力的细胞。2011年美国人布鲁斯·博伊特勒、法国人朱尔斯·霍夫曼和加拿大人拉尔夫·斯坦曼因为“发现免疫系统激活的关键原理，革命性地改变我们大家对免疫系统的理解”而赢得诺贝尔生理学或医学奖。其中，斯坦曼所作贡献是发现免疫系统中“树突细胞”及其在适应性免疫反应，即以自身调控方式适应并清除体内微生物过程中的作用。dc疫苗为代表的“细胞免疫疗法”，已经逐渐成为继手术、放疗、化疗后的第三种癌症治疗策略。
dc疫苗的临床应用需要dc数量达到一定的数量级，同时对dc中表型阳性细胞所占的比例也有要求，但是目前相关的研究缺乏，没有合适的培养基。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提出了一种无血清免疫细胞培养基，具体如下：
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量份原料：
l-丙氨酸5-30份、l-精氨酸盐酸盐30-200份、l-天冬氨酸10-40份、l-天冬氨酸水合物20-70份、l-胱氨酸盐酸盐20-100份、l-谷氨酸10-60份、l-谷氨酰胺50-600份、l-组氨酸盐酸盐15-60份、l-异亮氨酸20-150份、l-亮氨酸20-150份、l-赖氨酸盐酸盐10-200份、l-蛋氨酸5-50份、l-苯丙氨酸5-100份、l-脯氨酸5-100份、l-丝氨酸5-60份、l-苏氨酸10-80份、l-色氨酸1-20份、l-酪氨酸10-80份、l-缬氨酸1-100份、l-甘氨酸1-50份；矿物质：氯化钙50-200份、氯化钾250-500份、七水合硫酸镁50-300份、亚硒酸钠0.001-0.010份、氯化钠4000-8000份、磷酸二氢钠50-300份、碳酸氢钠1000-5000份；
生物素0.05-0.5份、氯化胆碱0.1-20份、d-泛酸钙0.005-10份、叶酸0.05-10份、肌醇1-50份、烟酰胺0.1-10份、核黄素0.1-0.5份、盐酸硫胺0.05-5份、维他命b120.1-3.0份、盐酸吡哆醛0.1-5份；
d-葡萄糖1500-5000份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2000-3500份、胰岛素1-20份、酚红5-30份、丙酮酸钠50-200份、转铁蛋白1-20份。
优选的，每升所述培养基主要包括：
l-丙氨酸8-20份、l-精氨酸盐酸盐50-175份、l-天冬氨酸13-30份、l-天冬氨酸水合物30-56.8份、l-胱氨酸盐酸盐36-70份、l-谷氨酸14.7-45份、l-谷氨酰胺100-484份、l-组氨酸盐酸盐21.88-45.8份、l-异亮氨酸30-105份、l-亮氨酸30-105份、l-赖氨酸盐酸盐29-146份、l-蛋氨酸10-30份、l-苯丙氨酸15-66份、l-脯氨酸11.5-69份、l-丝氨酸10.5-42份、l-苏氨酸16-55份、l-色氨酸3-12份、l-酪氨酸18-65份、l-缬氨酸5-55份、l-甘氨酸7-30份；
氯化钙60-180份、氯化钾285-400份、七水合硫酸镁100-260份、亚硒酸钠0.003-0.007份、氯化钠5200-7400份、磷酸二氢钠85-210份、碳酸氢钠1800-3300份；
生物素0.11-0.3份、氯化胆碱0.5-10份、d-泛酸钙0.01-4份、叶酸0.1-6份、肌醇5-25份、烟酰胺0.5-4份、核黄素0.15-0.4份、盐酸硫胺0.1-3份、维他命b120.5-1.4份、盐酸吡哆醛0.5-3份；
d-葡萄糖2000-4500份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2556-3158份、胰岛素6-15份、酚红7.2-20份、丙酮酸钠80-150份、转铁蛋白5-10份。
进一步优选的，每升所述培养基主要包括：
l-丙氨酸15份、l-精氨酸盐酸盐150份、l-天冬氨酸20份、l-天冬氨酸合物45份、l-胱氨酸盐酸盐50份、l-谷氨酸30份、l-谷氨酰胺250份、l-组氨酸盐酸盐30份、l-异亮氨酸65份、l-亮氨酸65份、l-赖氨酸盐酸盐90份、l-蛋氨酸20份、l-苯丙氨酸40份、l-脯氨酸40份、l-丝氨酸25份、l-苏氨酸35份、l-色氨酸8份、l-酪氨酸40份、l-缬氨酸30份、l-甘氨酸20份；
氯化钙120份、氯化钾350份、七水合硫酸镁180份、亚硒酸钠0.005份、氯化钠6300份、磷酸二氢钠150份、碳酸氢钠2500份；
生物素0.2份、氯化胆碱5份、d-泛酸钙1份、叶酸2份、肌醇15份、烟酰胺2份、核黄素0.25份、盐酸硫胺1份、维他命b121.0份、盐酸吡哆醛1.5份；
d-葡萄糖3000份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2900份、胰岛素10份、酚红15份、丙酮酸钠100份、转铁蛋白7份。
优选的，制成1l所述培养基还包括1-100mg的辅助因子，所述辅助因子包括1-10重量份的红景天甙、1-10重量份的木犀草苷和0.1-1重量份的白藜芦醇。
进一步优选的，制成1l所述培养基包括10mg的辅助因子，所述辅助因子包括5重量份的红景天甙、5重量份的木犀草苷和0.5重量份的白藜芦醇。
优选的，制成1l所述培养基还包括0.1-10mg的激活剂，所述激活剂包括1-10重量份的乙酰辅酶a、1-10重量份的辅酶q10、1-10重量份的6-磷酸葡萄糖和0.1-1重量份的环磷酸腺苷。
进一步优选的，制成1l所述培养基包括1mg的激活剂，所述激活剂包括5重量份的乙酰辅酶a、5重量份的辅酶q10、5重量份的6-磷酸葡萄糖和0.2重量份的环磷酸腺苷。
本发明还公开了一种无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述各无机盐组分，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
本发明还公开了另一种无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述各无机盐组分，搅拌均匀；
c1依次加入红景天甙、木犀草苷和白藜芦醇，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
本发明还公开了又一种无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述各无机盐组分，搅拌均匀；
c1依次加入红景天甙、木犀草苷和白藜芦醇，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e1依次加入乙酰辅酶a、辅酶q10、6-磷酸葡萄糖和环磷酸腺苷，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
本发明的无血清免疫细胞培养基，各组分均为市售的产品，本发明的培养基可以根据需要用1mol/l的盐酸或氢氧化钠调节ph值。
本发明的无血清免疫细胞培养基的ph7.2±0.2，渗透压在290±15mosm/kg，内毒素<0.30eu/ml，无细菌和真菌生长，支原体检测呈阴性。
本发明的一部分实施例可以提高细胞表型阳性比例。
具体实施方式
为详细说明本发明之技术内容、构造特征、所达成目的及功效，以下兹例举实施例详予说明。
实施例1
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量原料：
l-丙氨酸5mg、l-精氨酸盐酸盐30mg、l-天冬氨酸10mg、l-天冬氨酸水合物20mg、l-胱氨酸盐酸盐20mg、l-谷氨酸10mg、l-谷氨酰胺50mg、l-组氨酸盐酸盐15mg、l-异亮氨酸20mg、l-亮氨酸20mg、l-赖氨酸盐酸盐10mg、l-蛋氨酸5mg、l-苯丙氨酸5mg、l-脯氨酸5mg、l-丝氨酸5mg、l-苏氨酸10mg、l-色氨酸1mg、l-酪氨酸10mg、l-缬氨酸1mg、l-甘氨酸1mg；
氯化钙50mg、氯化钾250mg、七水合硫酸镁50mg、亚硒酸钠0.001mg、氯化钠4000mg、磷酸二氢钠50mg、碳酸氢钠1000mg；
生物素0.05mg、氯化胆碱0.1mg、d-泛酸钙0.005mg、叶酸0.05mg、肌醇1mg、烟酰胺0.1mg、核黄素0.1mg、盐酸硫胺0.05mg、维他命b120.1mg、盐酸吡哆醛0.1mg；
d-葡萄糖1500mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2000mg、胰岛素1mg、酚红5mg、丙酮酸钠50mg、转铁蛋白1mg；
余量为去离子水。
实施例2
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量原料：
l-丙氨酸30mg、l-精氨酸盐酸盐200mg、l-天冬氨酸40mg、l-天冬氨酸水合物70mg、l-胱氨酸盐酸盐100mg、l-谷氨酸60mg、l-谷氨酰胺600mg、l-组氨酸盐酸盐60mg、l-异亮氨酸150mg、l-亮氨酸150mg、l-赖氨酸盐酸盐200mg、l-蛋氨酸50mg、l-苯丙氨酸100mg、l-脯氨酸100mg、l-丝氨酸60mg、l-苏氨酸80mg、l-色氨酸20mg、l-酪氨酸80mg、l-缬氨酸100mg、l-甘氨酸50mg；
氯化钙200mg、氯化钾500mg、七水合硫酸镁300mg、亚硒酸钠0.010mg、氯化钠8000mg、磷酸二氢钠300mg、碳酸氢钠5000mg；
生物素0.5mg、氯化胆碱20mg、d-泛酸钙10mg、叶酸10mg、肌醇50mg、烟酰胺10mg、核黄素0.5mg、盐酸硫胺5mg、维他命b123.0mg、盐酸吡哆醛5mg；
d-葡萄糖5000mg、羟乙基哌嗪乙磺酸3500mg、胰岛素20mg、酚红30mg、丙酮酸钠200mg、转铁蛋白20mg；
余量为去离子水。
实施例3
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量原料：
l-丙氨酸8mg、l-精氨酸盐酸盐50mg、l-天冬氨酸13mg、l-天冬氨酸水合物30mg、l-胱氨酸盐酸盐36mg、l-谷氨酸14.7mg、l-谷氨酰胺100mg、l-组氨酸盐酸盐21.88mg、l-异亮氨酸30mg、l-亮氨酸30mg、l-赖氨酸盐酸盐29mg、l-蛋氨酸10mg、l-苯丙氨酸15mg、l-脯氨酸11.5mg、l-丝氨酸10.5mg、l-苏氨酸16mg、l-色氨酸3mg、l-酪氨酸18mg、l-缬氨酸5mg、l-甘氨酸7mg；
氯化钙60mg、氯化钾285mg、七水合硫酸镁100mg、亚硒酸钠0.003mg、氯化钠5200mg、磷酸二氢钠85mg、碳酸氢钠1800mg；
生物素0.11mg、氯化胆碱0.5mg、d-泛酸钙0.01mg、叶酸0.1mg、肌醇5mg、烟酰胺0.5mg、核黄素0.15mg、盐酸硫胺0.1mg、维他命b120.5mg、盐酸吡哆醛0.5mg；
d-葡萄糖2000mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2556mg、胰岛素6mg、酚红7.2mg、丙酮酸钠80mg、转铁蛋白5mg；
余量为去离子水。
实施例4
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量原料：
l-丙氨酸20mg、l-精氨酸盐酸盐175mg、l-天冬氨酸30mg、l-天冬氨酸合物56.8mg、l-胱氨酸盐酸盐70mg、l-谷氨酸45mg、l-谷氨酰胺484mg、l-组氨酸盐酸盐45.8mg、l-异亮氨酸105mg、l-亮氨酸105mg、l-赖氨酸盐酸盐146mg、l-蛋氨酸30mg、l-苯丙氨酸66mg、l-脯氨酸69mg、l-丝氨酸42mg、l-苏氨酸55mg、l-色氨酸12mg、l-酪氨酸65mg、l-缬氨酸55mg、l-甘氨酸30mg；
氯化钙180mg、氯化钾400mg、七水合硫酸镁260mg、亚硒酸钠0.007mg、氯化钠7400mg、磷酸二氢钠210mg、碳酸氢钠3300mg；
生物素0.3mg、氯化胆碱10mg、d-泛酸钙4mg、叶酸6mg、肌醇25mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺3mg、维他命b121.4mg、盐酸吡哆醛3mg；
d-葡萄糖4500mg、羟乙基哌嗪乙磺酸3158mg、胰岛素15mg、酚红20mg、丙酮酸钠150mg、转铁蛋白10mg；
余量为去离子水。
实施例5
一种无血清免疫细胞培养基，制成1l所述培养基主要包括如下重量原料：
l-丙氨酸15mg、l-精氨酸盐酸盐150mg、l-天冬氨酸20mg、l-天冬氨酸水合物45mg、l-胱氨酸盐酸盐50mg、l-谷氨酸30mg、l-谷氨酰胺250mg、l-组氨酸盐酸盐30mg、l-异亮氨酸65mg、l-亮氨酸65mg、l-赖氨酸盐酸盐90mg、l-蛋氨酸20mg、l-苯丙氨酸40mg、l-脯氨酸40mg、l-丝氨酸25mg、l-苏氨酸35mg、l-色氨酸8mg、l-酪氨酸40mg、l-缬氨酸30mg、l-甘氨酸20mg；
氯化钙120mg、氯化钾350mg、七水合硫酸镁180mg、亚硒酸钠0.005mg、氯化钠6300mg、磷酸二氢钠150mg、碳酸氢钠2500mg；
生物素0.2mg、氯化胆碱5mg、d-泛酸钙1mg、叶酸2mg、肌醇15mg、烟酰胺2mg、核黄素0.25mg、盐酸硫胺1mg、维他命b121.0mg、盐酸吡哆醛1.5mg；
d-葡萄糖3000mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2900mg、胰岛素10mg、酚红15mg、丙酮酸钠100mg、转铁蛋白7mg；
余量为去离子水。
实施例6
实施例1-5无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述各无机盐组分，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
实施例7
与实施例5的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括1mg的辅助因子，所述辅助因子包括1/11.1mg红景天甙、10/11.1mg木犀草苷和0.1/11.1mg白藜芦醇。
实施例8
与实施例5的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括100mg的辅助因子，所述辅助因子包括1000/12mg红景天甙、100/12mg木犀草苷和100/12mg白藜芦醇。
实施例9
与实施例5的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括10mg的辅助因子，所述辅助因子包括50/10.5mg红景天甙、50/10.5mg木犀草苷和5/10.5mg白藜芦醇。
实施例10
实施例7-9无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述个无机盐组分，搅拌均匀；
c1依次加入红景天甙、木犀草苷和白藜芦醇，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
实施例11
与实施例9的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括0.1mg的激活剂，所述激活剂包括1/22mg乙酰辅酶a、0.1/22mg辅酶q10、0.1/22mg6-磷酸葡萄糖和1/22mg重量份的环磷酸腺苷。
实施例12
与实施例9的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括10mg的激活剂，所述激活剂包括10/21.1mg乙酰辅酶a、100/21.1mg辅酶q10、100/21.1mg6-磷酸葡萄糖和1/21.1mg环磷酸腺苷。
实施例13
与实施例9的不同之处在于，制成1l所述培养基还包括1mg的激活剂，所述激活剂包括5/15.2mg乙酰辅酶a、5/15.2mg辅酶q10、5/15.2mg6-磷酸葡萄糖和0.2/15.2mg环磷酸腺苷。
实施例14
实施例11-13无血清免疫细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
a取二分之一目标体积的去离子水，加入所述各维生素组分，搅拌均匀；
b加入所述各无机盐组分，搅拌均匀；
c1依次加入红景天甙、木犀草苷和白藜芦醇，搅拌均匀；
c依次加入所述各氨基酸组分、胰岛素和转铁蛋白，搅拌均匀；
d依次加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酚红和丙酮酸钠，搅拌均匀；
e1依次加入乙酰辅酶a、辅酶q10、6-磷酸葡萄糖和环磷酸腺苷，搅拌均匀；
e加入葡萄糖，搅拌均匀后，用去离子水定容至目标体积。
对照例1
dmem培养基。
用dmem(h)粉末加碳酸氢钠配制而成。
对照例2
与实施例7的不同之处在于，制成1l所述培养基包括1mg的辅助因子，所述辅助因子包括1/11mg红景天甙和10/11mg木犀草苷。
对照例3
与实施例7的不同之处在于，制成1l所述培养基包括1mg的辅助因子，所述辅助因子包括1/1.1mg红景天甙和0.1/11mg白藜芦醇。
对照例4
与实施例11的不同之处在于，制成1l所述培养基包括0.1mg的激活剂，所述激活剂包括1/11mg乙酰辅酶a和0.1/11mg辅酶q10。
对照例5
与实施例11的不同之处在于，制成1l所述培养基包括0.1mg的激活剂，所述激活剂包括0.1/2mg6-磷酸葡萄糖和0.1/2mg环磷酸腺苷。
试验例1培养基对dc细胞表型阳性比例的影响
小鼠骨髓来源的dc，调整浓度为1×106/ml，按10ng/ml加入实施例或对照例的培养基，在37℃、饱和湿度、5％co2培养箱培养，每3d半量换液。
培养7d后，加入荧光标记大鼠抗小鼠cd40和cd86，室温避光孵育30min，pbs洗涤细胞后，用流式细胞仪进行细胞计数。
细胞表型阳性比例为表型阳性细胞所占的百分比。
表1培养基对dc细胞表型阳性比例的影响
*、#符号数目相同表示没有显著性差异，数目不同表示有显著性差异(p<0.05)
从表1可以看出，
实施例1-5的d40和cd86细胞表型阳性比例显著高于对照例1，较优的是实施例3-4，最优的是实施例5。说明本实施例1-5的培养基与对照例(常规的dmem)相比，具有明显效果，同时调节各组分的浓度可以进一步优化阳性比例。
实施例7-9的d40和cd86细胞表型阳性比例显著高于对照例2-3，说明辅助因子红景天甙、木犀草苷和白藜芦醇能够显著提高阳性比例，其中实施例9最优。
实施例11-13的cd40和cd86细胞表型阳性比例显著高于对照例3-4，其中实施例13最优。说明激活剂乙酰辅酶a、辅酶q10、、6-磷酸葡萄糖和环磷酸腺苷能够提高dc的cd40和cd86细胞表型阳性比例。
综上所述，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。