一种对镉具有高抗性的紫胞菌及提取方法和应用与流程

本发明属于抗镉菌种的筛选技术领域，具体涉及一种对镉具有高抗性的紫胞菌及提取方法和应用。

背景技术：

官方文件表明，我们耕地污染面积超过总耕地的19.4％，而镉是污染面积最广的污染物，约占总耕地的7％。同时，在“有河皆污”的大背景下，包括自然河流，湖泊，市内排污河流和工业污水渗坑在内的多种水体中，镉污染也不容忽视。耕地和工业污水中镉的生态修复已经成为世界性难题。以中国耕地污染为例，其污染多为面源污染且不易及时去除，休耕修复面临很大的经济压力，这使常规的移除重金属的治理策略面临诸多障碍。而污染耕地的安全利用体系可以在不移除或者缓慢移除重金属的前提下实现安全农产品的生产，因而成为了耕地重金属污染治理的热点手段之一。

在重金属镉污染耕地的安全利用体系中，基于镉抗性微生物的微生物固定剂具有重要的应用前景。它利用了抗镉微生物的代谢能力，原位降低土壤重金属镉有效性，减少农作物对重金属镉的吸收量，从而实现安全农产品的生产。微生物固定剂施用简单，无二次污染，成本低廉，有望替代传统化学固定剂。因此，如何获取一种对镉具有高抗性的菌种是亟需解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种对镉具有高抗性的紫胞菌及提取方法和应用，该菌种具有很强镉吸附能力，将其用于重金属镉污染的土壤中具有极大的应用潜力。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种对镉具有高抗性的紫胞菌，该菌株为紫胞菌属(purpureocilliumsp.)，属丝状真菌，命名为zyzx-yz1，该菌株于2017年09月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.14159，其its序列如序列表seq.id.no：1所示。

上述菌株的提取方法，包括以下步骤：

选取耕地土壤，然后向土壤中加入浓度为15-20mm的cdcl2溶液，室温放置20-23天，然后将土壤混匀，从中随机选取土壤，用水对其进行10倍梯度稀释，取每个稀释后的土壤悬液均匀涂布在含15-20mmcdcl2的马丁培养基中，置于26-28℃培养，然后经平板涂布法分离得到耐受性最高的单菌落，将该单菌落接种到不含cdcl2的马丁培养基中培养，获得菌株zyzx-yz1。

其中，马丁培养基含以下重量百分数的组分：1％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.1％kh2po4，0.05％mgso4·7h2o，1.5％琼脂，0.001％孟加拉红，其余为蒸馏水。

将上述提取得到的紫胞菌zyzx-yz1用于重金属镉污染的土壤或水体或其他镉污染环境的修复中，该紫胞菌zyzx-yz1还可用于制备镉吸附剂。

本发明提供的一种对镉具有高抗性的紫胞菌及提取方法和应用，具有以下有益效果：

(1)本发明从土壤中提取抗重金属镉的菌株，提取到的菌株对重金属镉的耐受性在液体培养基中最高可达100mm，显示了很强的抗镉特性。菌株来源易得且分离纯化方法简单便捷，成本低。

(2)提取的紫胞菌zyzx-yz1具有镉吸附功能，可以吸附土壤中镉，促进植物的生长。

附图说明

图1为菌株zyzx-yz1在马丁氏培养基平板中的生长情况。

图2为光学显微镜下菌丝及分生孢子的乳酸酚棉蓝染色形态图。

图3为菌株18srdna和its的pcr扩增结果。

图4为基于its序列的系统进化分析图。

图5为菌株在16mmcdcl2胁迫下菌丝直径变化结果。

图6为在不同镉浓度胁迫下培养3天后菌丝干重结果。

图7为在不同镉浓度胁迫下培养3天后镉移除率结果。

图8为菌株对烟草的镉耐受性结果的影响。

图9为菌株对烟草镉积累量的影响。

具体实施方式

实施例1菌株的分离

本试验土样采集选取在中科院栾城试验站，地理位置为北纬37°53'，东经114°41'，属暖温带半湿润季风气候，土壤类型以潮褐土为主，代表华北平原北部土壤类型。年平均气温为12.2℃，年平均降水量为530mm。采集3个点位的耕地土壤进行混样处理。

预先向各盛有20g土样的50ml离心管中加入5ml16mmcdcl2溶液，室温放置21天。取5g处理后的土样制成土壤悬液，按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5进行10倍比稀释。将稀释后土壤悬液200μl用涂布棒均匀涂布在含16mmcdcl2的马丁培养基(1％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.1％kh2po4，0.05％mgso4·7h2o，1.5％琼脂，0.001％孟加拉红)中，放于恒温箱28℃进行培养。

将筛选到的抗镉微生物在含16mmcdcl2的马丁培养基中进行划线，放于恒温箱28℃进行培养。重复划线培养两到三次，直至培养基中长出单菌落。将单菌落接种到不加cdcl2的培养皿中，培养出的菌株作为母种保存。

实施例2形态学鉴定

1、菌落形态学观察

将菌株接入马丁氏培养基平板中，置于28℃连续培养12天，观察菌落形态特征，结果见图1。

如图1所述，菌落有菌环，菌丝为白色，质地为绒状，分生孢子结构大量产生，分生孢子面颜色为浅粉灰色；表面无渗出液。

2、显微镜形态观察

将马丁氏培养基平板中培养的菌落用解剖针挑出一点菌落，放在中间滴有乳酸酚棉蓝染色液的载玻片上，然后用两只解剖针尽量的把菌落分散开并与乳酸酚棉蓝染色液混匀，加盖盖玻片，轻轻按压，并用吸水纸把盖玻片周围的水吸干，在显微镜下观察菌丝及分生孢子形态，结果见图2。

由图2可知，营养菌丝细胞壁光滑，分生孢子梗光滑，直立于营养菌丝上；孢梗上具有数个轮生分枝，顶端渐细；分生孢子卵形，自顶向下链状排列。

3、分子生物学鉴定

按常规方法提取真菌菌株基因组dna，利用设计的引物its1(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')和its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')扩增18srdna和its，将18srdna和its产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。将扩增产物经胶回收纯化后与载体pmd19tvector进行连接，将阳性的重组质粒进行sanger测序来确定its序列。

its序列如序列表seq.id.no：1所示，具体序列为：

gaacctgcggagggatcattaccgagttatacaactcccaaacccactgtgaaccttacctcagttgcctcggcgggaacgccccggccgcctgcccccgcgccggcgccggacccaggcgcccgccgcagggaccccaaactctcttgcattacgcccagcgggcggaatttcttctctgagttgcacaagcaaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcgagccccccccgggggcctcggtgttgggggacggcacaccagccgcccccgaaatgcagtggcgaccccgccgcagcctcccctgcgtagtagcacacacctcgcaccggagcgcggaggcggtcacgccgtaaaacgcccaactttcttagagttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagg

将its序列输入在线blast软件进行序列比对，选取一致性和相似性最高的已登记its序列若干进行进化树构建，结果见图4。

经过its鉴定，初步确认该菌株为紫胞菌属，命名为purpureocilliumspstrainzyzx-yz1。

实施例3镉耐受和镉吸附实验

由于试验菌株筛选自16mmcdcl2预处理土壤，并纯化于16mmcdcl2浓度的马丁培养基平板中，因此该菌株能够在16mmcdcl2胁迫下生长良好。

在生长状态良好的菌落边缘上打孔，直径为0.7cm，并将打孔取出的含菌丝固体培养基块接种于16mmcdcl2浓度的马丁培养基平板中，每天记录菌丝直径，其结果见图5。

由图5可知，不含镉和含镉的培养基中菌丝直径均呈逐渐增大趋势，含16mmcdcl2浓度的马丁培养基中的菌丝直径与不含镉的菌株的菌丝直径相差不是很大，说明该菌株对镉具有很强的耐受能力。

在生长状态良好的菌落边缘上打孔，直径为0.7cm，并将打孔取出的含菌丝固体培养基块接种于100ml不同cdcl2浓度的马丁液体培养基中培养3天，然后离心收集菌体，称量菌体干重，结果见图6。取收集菌丝后的液体培养基测定镉含量，结果见图7。

由图6和图7可知，在一定的镉浓度下，菌丝对镉具有一定的吸附作用，当镉浓度为0.5mm时，菌丝干重最重，当镉浓度为0.05mm时对镉的吸附率最大，而当镉浓度超过一定值后，会抑制菌丝的生长。

实施例4盆栽实验

本试验选取烟草(nicotianabenthamiana)进行盆栽试验。盆尺寸为10cm长，10cm宽，10cm高；每盆种植一棵烟草。

选取生长状态良好且一致的两周龄烟草植株，分为两组，一组不接种真菌，一组接种真菌(每50g干重土壤接种1g鲜重菌丝)。从接种日起，每隔5天每盆浇不同浓度的镉溶液30ml，持续1个月，观察烟草生长情况，结果见图8。

由图8可知，接种了菌株zyzx-yz1的烟草植株在镉浓度为400mg/kg时，还能生长，叶片为正常绿色，但未接种菌株zyzx-yz1的烟草植株在此浓度下却变得干枯死亡，说明该菌株对含有镉的土壤进行修复，增加了烟草对镉的耐受能力。

分别采集烟草的根和地上部分，烘干并使用硝酸进行消解，随后采用火焰原子吸收法测定样品中镉元素的含量，结果见图9。

由图9可知，在镉浓度分别为100mg/kg和200mg/kg时，接种菌株zyzx-yz1的烟草植株根部镉积累量分别减少了52.3％和44.1％，地上部分也有不同程度地减少；在镉浓度为400mg/kg时，由于未接种菌株zyzx-yz1的烟草植株已经枯萎，其根部和地上部分镉积累量均大大高于种菌株zyzx-yz1的烟草植株。该试验结果进一步证明了菌株zyzx-yz1可以对含有镉的土壤进行修复，从而减少烟草对镉的吸收。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种对镉具有高抗性的淡紫紫胞菌及提取方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>587

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaacctgcggagggatcattaccgagttatacaactcccaaacccactgtgaaccttacc60

tcagttgcctcggcgggaacgccccggccgcctgcccccgcgccggcgccggacccaggc120

gcccgccgcagggaccccaaactctcttgcattacgcccagcgggcggaatttcttctct180

gagttgcacaagcaaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctgg240

catcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatc300

atcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagc360

gtcatttcaaccctcgagccccccccgggggcctcggtgttgggggacggcacaccagcc420

gcccccgaaatgcagtggcgaccccgccgcagcctcccctgcgtagtagcacacacctcg480

caccggagcgcggaggcggtcacgccgtaaaacgcccaactttcttagagttgacctcgg540

atcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagg587