一种马铃薯晚疫病菌的简单保存方法与流程

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种马铃薯晚疫病菌的简单保存方法。

背景技术：

马铃薯，属茄科多年生草本植物，块茎可供食用，是全球第四大重要的粮食作物；主要生产国有中国、俄罗斯、印度、乌克兰、美国等，中国是世界马铃薯总产最多的国家。马铃薯晚疫病菌(phytophthorainfestans)是引起马铃薯和西红柿晚疫病的致病菌，每年由马铃薯晚疫病菌引起的马铃薯减产带来的损失超过5亿美元。在中国马铃薯产地都有发生，西南地区较为严重，东北、华北与西北多雨潮湿的年份为害较重。马铃薯晚疫病可危害马铃薯叶片、叶柄、茎和块径。其危害程度、防治难度以及对社会造成的影响已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一作物病害。在叶片上，从叶尖或叶缘开始产生水渍状褐绿斑点，空气湿度大时，病斑迅速扩大，甚至扩展达整个叶片，并可沿叶脉侵入叶柄及茎部，形成褐色病斑，病斑边缘界限不明显。在暗褐色病斑边缘长出一圈白色霉层，叶片背面最为明显。发病严重时，叶片萎焉下垂，全株变黑呈湿腐状。薯块受害时，形成淡褐色不规则的小斑点，稍凹陷，病斑下面的薯肉变褐坏死，最后病薯腐烂。

马铃薯晚疫病(potatolateblight)由致病疫霉引起，导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性卵菌病害，是一种寄生专化性很强的真菌，分离纯化相当困难，一般在活的植株或薯块上才能生存，但在特定的培养基上可以生长，如在煮麦片、菜豆粉和v8等培养基上生长并形成孢子囊，主要以游动孢子形成的休止孢产生牙管，自气孔或皮孔直接侵入马铃薯。该菌种在离体条件下难以长期保存。实验室常用的保存方法，如培养基斜面保存方法，将待保存的菌种长满培养基后放置于4℃冰箱；这种保存方法保存时间短，需要定期移植，不仅增大了污染的概率，而且耗费大量的人力物力。冷冻真空干燥法、超低温冻结保藏法需要专门的设备，保存成本较高。对于这一世界病害之一，病原菌纯菌种的长期保存对于该病害的深入研究至关重要。因此，寻找一种较长期的保存方法是很有必要的。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种马铃薯晚疫病菌的中长期简易的保存方法，其操作简单，不需要专门的实验设备。且保存的菌种性状稳定、不易变异、不用定期移植，对提高菌种保存的效率和质量有显著效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种马铃薯晚疫病菌的简单保存方法，是用无菌水作为马铃薯晚疫病菌的保存载体对马铃薯晚疫病菌进行保存；其具体包括如下步骤：

步骤1：将培养基倒入培养皿平板中，待培养基冷却凝固后用手术刀切下一块待保存的马铃薯晚疫病菌菌块置于培养基中心处，使其菌丝面向上；

所述培养基为马铃薯晚疫病菌固体培养基，成分为：黑麦麦粒60-80g，番茄汁150ml，琼脂粉18-20g，caco31.2g，加水至1000ml，ph7.0；

所述马铃薯晚疫病菌固体培养基，按照包括如下步骤的方法得到：将黑麦麦粒放入300ml水中，浸泡36h，保存上清液，加入100ml水于膨胀的黑麦麦粒中搅拌2min后水浴3h，4层纱布过滤，滤液与上清合并；顺序加入琼脂、番茄汁和caco3，最后用水定容至1000ml；

所述水为自来水，黑麦麦粒为去壳后的黑麦麦粒；

步骤2：用封口膜将两个培养皿之间的缝隙封住；

步骤3：将培养皿平板放置于17℃恒温培养箱培养至菌种长满培养皿；

步骤4：用手术刀将马铃薯晚疫病菌菌块切成小菌块；

步骤5：用镊子将切好的菌块夹出放置于盛有无菌水的三角瓶中；

步骤6：用无菌透气封口膜封住瓶口，膜上加两层与封口膜大小的报纸，将瓶口用棉线扎紧；

步骤7：在报纸上标注菌种信息及保存日期；

步骤8：将三角瓶置于17℃的恒温培养箱中保存。

步骤1所述培养皿直径为90㎜，所取的马铃薯晚疫病菌块大小为10㎜×10㎜；

步骤2所用的封口膜宽为100㎜；

步骤4所取的马铃薯晚疫病菌菌块大小为5㎜×5㎜；

步骤5所用三角瓶容量为500ml；

步骤6封口所用透气封口膜为100㎜×100㎜。

上述步骤中，步骤1、步骤2、步骤4、步骤5、步骤6均须在无菌操作台进行无菌操作，且操作中所用到的培养基、水、培养皿、手术刀、镊子、三角瓶均需预先在121℃条件下灭菌处理15min。

本发明的显著优点在于：

(1)本发明以无菌自来水作为保存载体对马铃薯晚疫病菌进行保存，为马铃薯晚疫病的生长提供一定的环境，可以避免营养过剩引起马铃薯晚疫病菌种的退化，保存的马铃薯晚疫病菌菌种生长良好，且性状稳定。因此，本发明方法为马铃薯晚疫病菌的研究工作提供了保障，具有一定的实际应用价值；

(2)按本发明进行保存，可使菌种周期延长，且保存周期内不用定期移植，节省了保存成本；

(3)该保存方法简单快速，操作简单，对仪器要求相对较低，任何一个实验室均可以对菌种进行保存；

(4)按照本发明保存的菌种活化方便，即将封口膜撕开，用镊子夹出菌丝或者菌块放在马铃薯晚疫病菌固体培养基上就可以进行活化培养，而将三角瓶再次封口放入恒温培养箱仍可继续保存，同时可将一个菌种再分装多个小三角瓶，每次使用一个三角瓶，可避免多次活化菌种造成的污染；另外活化菌种的同时又可进行菌种的保存，只需有无菌水即可，省时省力。

附图说明

图1为待保存的马铃薯晚疫病菌菌种，

图2为无菌自来水保存菌种示意图，

图3为菌种缺氮培养基活化示意图，

图4为菌种完全培养基活化示意图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

操作中所用培养基、培养皿、手术刀、镊子、三角瓶(水500ml)均需预先在121℃条件下灭菌处理15min；且所述步骤中步骤1、步骤2、步骤4、步骤5、步骤6均须在无菌操作台进行无菌操作。

实施例

一种马铃薯晚疫病菌的简单保存方法，具体包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台上将灭菌的马铃薯晚疫病菌固体培养基倒入灭菌的直径为90㎜的培养皿平板中，待其冷却；所述马铃薯晚疫病菌固体培养基的成分为：黑麦60-80g，番茄汁150ml，琼脂粉18-20g，caco31.2g，加水至1000ml，ph7.0；

所述马铃薯晚疫病菌固体培养基，按照包括如下步骤的方法得到：将黑麦麦粒放入300ml水中，浸泡36h，保存上清液，加入100ml水于膨胀的黑麦麦粒中搅拌2min后水浴3h，4层纱布过滤，滤液与上清合并；顺序加入琼脂、番茄汁和caco3，最后用水定容至1000ml；

所述水为自来水，黑麦麦粒为去壳后的黑麦麦粒；

步骤2：在超净工作台上用灭菌的手术刀挑取一块待保存的、大小为10㎜×10㎜的菌块，将其置于马铃薯晚疫病菌固体培养基中心处，使其菌丝面朝上；用封口膜将两个培养皿之间的缝隙封住；

步骤3：将培养皿平板放置于17℃恒温培养箱培养至菌种长满培养皿；

步骤4：在超净工作台上用灭菌手术刀将培养好的马铃薯晚疫病菌菌块切成小菌块，大小为5㎜×5㎜；

步骤5：在超净工作台上用灭菌镊子将切好的菌块夹出放置于盛有无菌水三角瓶中；

步骤6：在超净工作台上用10㎜×10㎜无菌透气封口膜封住瓶口，膜上加两层与封口膜大小的报纸，将瓶口用棉线扎紧；

步骤7：在报纸上标注菌种信息及保存日期；

步骤8：将三角瓶置于17℃的恒温培养箱中保存。

保存菌种的存活率实验

在实施案例中，所保存的菌种分别存放6个月、12个月时进行活化，测定其存活情况，结果见表1。

表1保存不同时间后菌种的存活情况

由表1可见，本发明方法保存马铃薯晚疫病菌6个月、12个月后，马铃薯晚疫病菌均存活良好，生长性状稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。