堆肥腐殖质还原菌促进有机污染物定向降解的调控方法与流程

本发明涉及有机污染物生物降解领域，特别涉及一种堆肥腐殖质还原菌促进有机污染物定向降解的调控方法。

背景技术：

有机物的广泛使用已造成世界范围内的土壤及水体污染，有机物污染物的残留对人体健康和生态环境构成极大威胁，例如，自20世纪30年代以来，五氯苯酚(pcp)在全球范围内被广泛用作木材防腐剂、果蔬杀虫剂或杀真菌剂。pcp性质较稳定，在通常条件下不易被氧化，且难于水解，是最难降解的酚类物质。同时，pcp在酚类中毒性最大，具有很强的致癌、致畸、致突变效应。在富含有机质的土壤中，pcp更易被植物吸收，且挥发性很低，其生物危害性、降解性及其污染的生物修复等研究也一直是环境领域的研究热点。因此，研究pcp的生物降解具有重要意义。

氯酚类化合物降解过程的限制步骤是苯环上氯取代基的去除，其降解过程均为先脱氯转化为低氯化合物后再开环得到降解或矿化，因此脱氯就成为pcp降解的关键步骤。腐殖质还原菌作为一个庞大且复杂的生物类群，对重金属及有机污染物的降解起到重要作用。它的主要过程是在厌氧条件下，腐殖质还原菌利用碳源将电子传递给pcp，使其逐步脱氯。

综合以往研究报道表明，自然环境中分离出来的腐殖质还原菌可促进pcp还原脱氯。然而堆肥有别于自然环境，它是有机物被微生物降解利用并合成大量腐殖酸类物质的过程，在此过程会诱导腐殖质还原菌的产生。但由于堆肥过程中产生腐殖质还原菌数量及种类较多，识别其对pcp降解起显著作用的腐殖质还原菌如同大海捞针，且采用传统分离纯化培养技术获得关键腐殖质还原菌尤为困难。鉴于堆肥具有较强的可调控性，本发明提出一种通过调控堆肥过程理化因子从而促进腐殖质还原菌降解有机污染物的定向调控方法。

技术实现要素：

为了促进有机污染物的生物降解，本发明提供了一种关键腐殖质还原菌促进有机污染物定向降解的调控方法。

本发明的堆肥腐殖质还原菌促进有机污染物降解的定向调控方法包括以下步骤：

(1)采集堆肥过程中的样品，加入混合营养盐和电子受体，在厌氧条件下富集腐殖质还原菌，对其进行16srdna测序，并获取不同阶段堆肥微环境因子；

(2)在存在混合营养盐的条件下，利用不同类型堆肥中腐殖质还原菌对有机污染物进行厌氧降解，反应达到稳定后，利用典型对应分析判断腐殖质还原菌与反应终产物的响应关系，从而获得促进有机污染物降解的关键腐殖质还原菌；

(3)采用典型对应分析判断关键腐殖质还原菌与微环境因子的响应关系，筛选堆肥中腐殖质还原菌的关键微环境因子，并确定调控方案；

(4)按照确定后的调控方案，进行现场实施，对堆肥过程进行取样、分析，随时根据现场出现问题和情况决定是否需要进一步调控。

其中，所述步骤(1)与步骤(2)中的混合营养盐包括葡萄糖、丙酮酸盐、乙酸钠、乳酸钠、蔗糖、果糖及麦芽糖。优选地，混合营养盐各成分的浓度为0.1-10mmol·l^-1，优选为1mmol·l^-1。

所述电子受体为蒽醌-2，6-二磺酸盐aqds，aqds的浓度为1-10mmol·l^-1，优选为5mmol·l^-1。

优选地，堆肥过程中的样品至少包括升温期、高温期及降温期三个阶段的样品。

所述步骤(2)中获取的微环境因子包括ph、有机质含量、氨态氮、硝态氮、水溶性有机氮、水溶性有机碳及含水率中的至少5种。

步骤(3)中通过调控堆肥微环境因子间接改变功能微生物的代谢过程，从而向着目标方向进行。

所述有机污染物包括卤代物或硝代物，卤代物包括五氯苯酚(pcp)。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)适用范围广，所述方法不仅适用于pcp降解的微生物生态调控，同样适用于其它卤代或硝代等有机污染物降解的微生物生态调控，且进一步明确堆肥过程中微生物的调控重点；

(2)紧抓堆肥过程腐殖质还原菌、降解产物及环境因子间的响应关系，调控步骤清晰，可操作性强，可有针对性地调控微生物群落向着目标方向发展，并且明确筛选方式及调控因子等，进一步提高了可操作性；

(3)关键腐殖质还原菌的筛选方法针对性强，调控效果显著，调控手段包括筛选和调控两个程序，首先根据腐殖质还原菌群落结构与有机污染物降解产物的响应关系确定关键腐殖质还原菌，微生物群落分析与堆肥过程的理化因子的紧密结合，使调控手段更贴堆肥实际，提高了调控的准确性与实用性。

附图说明

图1是本发明的调控方法的流程图；

图2是实施例1不同堆肥阶段腐殖质还原菌与pcp降解产物的响应关系图；

图3是实施例1中关键腐殖质还原菌与微环境因子的响应关系图；

图4是实施例2中不同堆肥阶段腐殖质还原菌与pcp降解产物的响应关系图；

图5是实施例2中关键腐殖质还原菌与微环境因子的响应关系图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明的堆肥腐殖质还原菌促进有机污染物降解的定向调控方法包括以下步骤：

(1)采集样品进行堆肥，采集堆肥过程中的样品，加入混合营养盐，蒽醌-2，6-二磺酸盐aqds作为电子受体，厌氧条件下富集腐殖质还原菌，对其进行16srdna测序，并获取不同阶段堆肥微环境因子；

(2)添加混合营养盐，利用不同类型堆肥中腐殖质还原菌对有机污染物进行厌氧降解，反应达到稳定后，利用典型对应分析判断腐殖质还原菌与反应终产物的响应关系，从而获得促进有机污染物降解的关键腐殖质还原菌；

(3)采用典型对应分析判断关键腐殖质还原菌与微环境因子的响应关系，筛选堆肥中腐殖质还原菌的关键微环境因子，并确定调控方案；

(4)按照确定后的调控方案，进行现场实施，对堆肥过程进行取样、分析，随时根据现场出现问题和情况决定是否需要进一步调控。

本发明中腐殖质还原菌的培养基中混合营养盐为葡萄糖(1mmol·l^-1)、丙酮酸盐(1mmol·l^-1)、乙酸钠(1mmol·l^-1)、乳酸钠(1mmol·l^-1)、蔗糖(1mmol·l^-1)、果糖(1mmol·l^-1)及麦芽糖(1mmol·l^-1)，以0.5mmol·l^-1aqds作电子受体，维生素溶液、无机盐溶液均采用常规配方。

实施例1

取鸡粪(cm)、杂草(ww)、枯枝(gw)等堆肥原料进行堆肥，分别采集堆肥在升温期、高温期及腐熟期三个阶段的样品，富集培养腐殖质还原菌并利用16srdna测序检测其菌群结构，测试结果见表1(其中cm1、cm2和cm3分别表示鸡粪堆肥在升温期、高温期及腐熟期三个阶段的样品，其余与之类似)和表2。不同理化指标如表3所示，包括温度、含水率、氨态氮(nh4⁺-n)、硝态氮(no3^--n)、水溶性有机氮(don)、水溶性有机碳(doc)、c/n、有机物(om)及ph。

表1不同物料堆肥过程中腐殖质还原菌在属水平上的序列数总和

表2otu在属水平的分类名称

表3鸡粪、杂草、枯枝堆肥过程中微环境因子的变化

分别以不同堆肥阶段富集的腐殖质还原菌作电子供体，以葡萄糖(1mmol·l^-1)、丙酮酸盐(1mmol·l^-1)、乙酸钠(1mmol·l^-1)、乳酸钠(1mmol·l^-1)、蔗糖(1mmol·l^-1)、果糖(1mmol·l^-1)及麦芽糖(1mmol·l^-1)作为营养盐，pcp作电子受体(浓度为6mg/l)，培养至40天，检测反应液最终浓度，其中cm中检出产物包括pcp(2.612mg/l)、2，4，5-三氯苯酚(2，4，5-tcp，0.002mg/l)、2，6-二氯苯酚(2，6-dcp，0.152mg/l)、2，4-二氯苯酚(2，4-dcp，3.782mg/l)、4-氯苯酚(4-cp，0.915mg/l)；ww中检出产物包括pcp(1.559mg/l)、2，4，5-tcp(3.010mg/l)、2，6-dcp(0.233mg/l)、2，4-dcp(3.442mg/l)、4-cp(1.731mg/l)；gw中检出产物包括pcp(2.257mg/l)、2，4，5-tcp(0.384mg/l)、2，6-dcp(0.391mg/l)、2，4-dcp(3.499mg/l)、4-cp(1.034mg/l)。

本实施例对腐殖质还原菌与环境因子进行典型对应分析，为筛选可促进pcp向低氯产物形成的关键腐殖质还原菌，如图2所示。其中主要包括otu5、otu30、otu66、otu67、otu74、otu78及otu132。

基于关键腐殖质还原菌与微环境子的响应关系图(图3)，可确定不同关键腐殖质还原菌的显著理化因子，其中调控nh4⁺-n可促进otu5、otu30、otu66、otu67、otu132的生长，调控增加ph促进otu74、otu78的生长。

选取cm、fvw、sw原样进行堆肥并添加nh4⁺-n至3000-3500mg·l^-1，且ph调至8.0-8.5。重复步骤(1)-(4)，反应35天达到稳定，其中cm中检出产物包括pcp(1.954mg/l)、2，4，5-tcp(0.002mg/l)、2，6-dcp(0.143mg/l)、2，4-dcp(1.583mg/l)、4-cp(1.943mg/l)；ww中检出产物包括pcp(1.346mg/l)、2，4，5-tcp(1.510mg/l)、2，6-dcp(0.233mg/l)、2，4-dcp(2.632mg/l)、4-cp(2.745mg/l)；

gw中检出产物包括pcp(1.347mg/l)、2，4，5-tcp(0.384mg/l)、2，6-dcp(0.391mg/l)、2，4-dcp(1.365mg/l)、4-cp(2.453mg/l)。

实施例2

取牛粪(dcm)、果蔬(fvw)、秸秆(sw)及污泥(ss)等堆肥原料进行堆肥，分别采集堆肥在升温期、高温期及腐熟期三个阶段的样品，富集培养腐殖质还原菌并利用16srdna测序检测其菌群结构，测试结果见表2和表4。不同理化指标如表5所示，包括温度、含水率、nh4⁺-n、no3^--n、don、doc、c/n、om及ph。

表4不同物料堆肥过程中腐殖质还原菌在属水平上的序列数总和

表5牛粪、果蔬、秸秆及污泥堆肥过程中微环境因子的变化

分别以不同堆肥阶段富集的腐殖质还原菌作电子供体，以葡萄糖(1mmol·l^-1)、丙酮酸盐(1mmol·l^-1)、乙酸钠(1mmol·l^-1)、乳酸钠(1mmol·l^-1)、蔗糖(1mmol·l^-1)、果糖(1mmol·l^-1)及麦芽糖(1mmol·l^-1)作为营养盐，pcp作电子受体(浓度为6mg/l)，其中dcm中检出产物包括pcp(2.966mg/l)、2，4，5-tcp(0.002mg/l)、2，6-dcp(0.077mg/l)、2，4-dcp(2.883mg/l)、4-cp(0.954mg/l)；fvw中检出产物包括pcp(1.901mg/l)、2，4，5-tcp(0.002mg/l)、2，6-dcp(0.106mg/l)、2，4-dcp(3.725mg/l)、4-cp(1.795mg/l)；sw中检出产物包括pcp(2.289mg/l)、2，4，5-tcp(0.230mg/l)、2，6-dcp(0.120mg/l)、2，4-dcp(3.416mg/l)、4-cp(1.544mg/l)；sw中检出产物包括pcp(2.289mg/l)、2，4，5-tcp(0.230mg/l)、2，6-dcp(0.120mg/l)、2，4-dcp(3.416mg/l)、4-cp(1.544mg/l)；ss中检出产物包括pcp(2.281mg/l)、2，4，5-tcp(3.855mg/l)、2，6-dcp(0.235mg/l)、2，4-dcp(4.565mg/l)、4-cp(1.106mg/l)。

本实施例对腐殖质还原菌与环境因子进行典型对应分析，为筛选可促进pcp向低氯产物形成的关键腐殖质还原菌，如图4所示。主要包括otu30、otu31、otu36、otu42、otu62、otu96、otu121、otu128、otu132、otu145和otu152。

基于关键腐殖质还原菌与微环境子的响应关系图(图5)，可确定不同关键腐殖质还原菌的显著理化因子，其中调控nh4⁺-n可促进otu42、otu121的生长，调控增加don可促进otu30、otu31、otu36、otu62、otu96、otu128、otu132、otu145和otu152的生长。

采集dcm、fvw、sw及ss等堆肥原料进行堆肥，并添加nh4⁺-n至3000-3600mg·l^-1，且don调至1.0-1.5g/kg。重复步骤(1)-(4)，反应37天达到稳定，其中dcm中检出产物包括pcp(1.954mg/l)、2，4，5-tcp(0.002mg/l)、2，6-dcp(0.197mg/l)、2，4-dcp(1.890mg/l)、4-cp(1.183mg/l)；fvw中检出产物包括pcp(1.085mg/l)、2，4，5-tcp(0.079mg/l)、2，6-dcp(0.123mg/l)、2，4-dcp(1.632mg/l)、4-cp(2.068mg/l)；sw中检出产物包括pcp(1.987mg/l)、2，4，5-tcp(0.875mg/l)、2，6-dcp(0.391mg/l)、2，4-dcp(1.345mg/l)、4-cp(1.953mg/l)：ss中检出产物包括pcp(2.547mg/l)、2，4，5-tcp(0.384mg/l)、2，6-dcp(0.543mg/l)、2，4-dcp(1.424mg/l)、4-cp(1.942mg/l)。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。