莱茵衣藻g3148.t1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域和环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻g3148.t1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

背景技术：

镉、汞、铅、铬、砷及其化合物，被称为“五毒”。作为五毒之一的镉，在自然界通常以化合物状态存在，一般含量较低，且对人体是非必需元素，但是当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集后经由食物链进入人体引起慢性中毒。镉被人体吸收后，会作用于肾脏等靶器官，从而引起尿糖，尿蛋白等，最终形成软骨病和自发性骨折。

近年来引发的镉污染不断加剧，人类和动植物由此引发的疾病也层出不穷。镉污染主要来源于工业上镉矿床的开采、玻璃、陶瓷、有色金属的冶炼等。大气中镉尘的迁移沉降及工业含镉废水排放后雨水的冲刷，导致水体中镉含量超标，在植物生长过程中，使得植物生长量下降，植物生长状况变差；而人和动物生长过程中，通过水、食物、空气的利用进入体内，由于自然排泄的缓慢，在体内影响健康。目前常用中和法、金属还原法等物理化学修复技术和一些能够大量吸收、积累镉离子的植物、微生物来减轻水体镉离子中等污染问题。利用草履虫等生物监测水体环境，可以便于分析水体污染程度并且可以预防污染加重。

莱茵衣藻是单细胞、光能自养型真核生物，具有鞭毛，有一个或者多个液泡，以及大型杯状叶绿体。具有培养条件简单，生长周期短，环境适应性强的特点，有“光合酵母”之称，且基因组测序已全部完成，是研究光合作用、纤毛的常用模式生物，同时因其更容易获得突变体，环境适应性强，也是水体污染监控和治理的一种理想的模式生物。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻g3148.t1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于g3148.t1基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻g3148.t1基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅷ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅷ片段插入到g3148.t1基因第3个内含子中造成的。g3148.t1基因在jgi莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是cre03.g154500.t1.2，位于衣藻的第3号染色体的1828472至1833563区域，其cds序列如seqidno:1所示。

基于上述发现，本发明的目的之一是提供莱茵衣藻g3148.t1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

所述g3148.t1基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：

(1)包含如seqidno:1所示2367bp的核苷酸序列；

(2)包含编码seqidno:2所示蛋白质的核苷酸序列；

(3)包含与seqidno:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述g3148.t1基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：

(1)包含如seqidno:2所示氨基酸序列；

(2)包含由seqidno:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与seqidno:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。

本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻g3148.t1基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻g3148.t1基因的表达、使g3148.t1基因失活或缺失g3148.t1基因从而降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻g3148.t1基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻g3148.t1基因的表达、使g3148.t1基因失活或缺失g3148.t1基因来降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述敏感型藻株为不含g3148.t1基因活性的g3148.t1基因突变株或g3148.t1基因缺失株，或g3148.t1基因表达下降的g3148.t1基因表达缺陷株。

本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻g3148.t1基因突变株，通过构建crispr载体进而获得莱茵衣藻g3148.t1基因缺失株，通过构建rnai干涉载体进而获得莱茵衣藻g3148.t1基因表达缺陷株。

本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测、检测中的应用。根据莱茵衣藻的g3148.t1基因表达缺陷株、g3148.t1基因突变株或g3148.t1基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在水体环境中重金属镉污染情况监测上具有重要应用价值，可应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究g3148.t1基因在衣藻重金属镉代谢调控网络中的作用机制，可进一步为生物法治理污水提供理论基础。

本发明的有益效果是：

(1)本发明发现的g3148.t1基因及其编码蛋白是一种莱茵衣藻中新的与重金属镉调控相关的基因和蛋白，目前没有相关的研究报道。

(2)本发明中采用的0.4mm氯化镉敏感型突变体和鉴定插入突变基因的方法简单有效，可以应用于其他模式生物。

(3)本发明获得的g3148.t1基因突变体是通过将aphⅷ插入野生型莱茵衣藻获得，在0.4mm氯化镉上表型十分敏感，有利于进一步研究该基因在衣藻重金属镉代谢调控中的作用机制。

(4)本发明中获得的g3148.t1基因突变体相对于野生型衣藻对重金属镉表现敏感，可以应用于镉污染水域的监控与治理中。

附图说明

图1为pjmg-aphⅷ质粒ecori酶酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图2为野生型莱茵衣藻21gr和镉敏感型衣藻突变体ky2在0.4mm氯化镉平板上的生长对比图。

图3为衣藻插入突变体ky2基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为镉敏感型衣藻突变体ky2经resda-pcr后琼脂糖凝胶电泳图。

图5为镉敏感型衣藻突变体ky2的插入突变基因g3148.t1的结构和插入突变位点示意图。

具体实施方式

为了让该领域或者相关人员能够更好的了解这个发明，下面结合以下几个实施例进行说明，这些方法只是为了更好的阐述该发明，并不限制本发明。以下实施例中，没有特殊说明的均为常规方法。

下述实施例中所用培养基配方如下：

tap培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、solutionⅱ(磷酸盐)0.188ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。

tagp培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、甘油磷酸钠(1m)0.376ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。若要配制固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。

实施例1、电击转化法获得插入突变藻株

(1)通过ecorⅰ-hf酶酶切pjmg-aphⅷ质粒(zhangfenghu,yinwenliang,weihe,junminpan^*,ciliadisassemblywithtwodistinctphasesofregulation,cellreports,2015,10(11):1803-1810)，得到aphⅷ片段(序列seqidno:3所示)，该片段含有巴龙霉抗性基因。通过琼脂糖凝胶电泳，回收aphⅷ片段。如图1所示，m为bm5000dnamarker，1为pjmg-aphⅷ经ecorⅰ-hf酶酶切后的样品，2k-3k间的条带即为需要进行胶回收的aphⅷ片段。

(2)将野生型莱茵衣藻21gr在tap固体平板上培养3天左右至生长状态良好，将其接种在tap液体吹气瓶中，连续光照下通气培养至细胞浓度达到1×10⁷细胞/ml，转接至含100mltap培养基的锥形瓶中，调整浓度为1×10⁶细胞/ml，在连续光照下摇床培养过夜，至终浓度为5×10⁶细胞/ml。

(3)于超净台内取上述浓度为5×10⁶细胞/ml的衣藻细胞20ml至50ml无菌离心管中，2500rpm/min离心3min，在超净台内倒掉上清，并用提前-20℃预冷的tap+60mm山梨醇(含60mm山梨醇的tap液体培养基)重悬，再次离心(2500rpm/min离心3min)后加入500μltap+60mm山梨醇重悬。

(4)取两个电击杯，在超净台内用无水乙醇洗一次，tap+60mm山梨醇洗两次后，放于-20℃进行预冷。取遇冷后的电击杯加入250μl重悬液和10ng的aphⅷ片段，冰上放置10min。调整电击仪(型号btxecm630)的参数为电压800v，电阻1575ω，电容50μf，电击10-14s，电击完成后再次放于冰上10min，再转移至50ml离心管中加入tap+60mm山梨醇定容至10ml，锡纸包好，摇床上慢速(100r/min)修复过夜。

(5)配20％的淀粉溶液：根据所做转化数计算所需的淀粉溶液用量，称取相应的淀粉于50ml离心管。先用无水乙醇洗涤1次，1000rpm/min离心2min，再用无菌双蒸水洗涤2次，1000rpm/min离心2min，最后用70％乙醇重悬至终浓度为20％。涂板前1000rpm/min离心1min，弃上清，加入无菌的tap+60mm山梨醇溶液洗涤4次，最后加入适量的tap+60mm山梨醇溶液进行重悬。

(6)2500rpm/min离心3min，收集过夜修复的电转后衣藻细胞，加入1ml20％的淀粉溶液进行重悬，均匀涂布在含有巴龙霉抗生素(10μg/ml)的tap固体培养基上，于超净台中吹干液体，封口膜封口，光周期下倒置培养5-7天可长出转化子。挑取转化子到tagp固体平板上，并进行编号，在光周期(14h光照/10h黑暗)培养3-4天至衣藻细胞活力最佳。

实施例2、氯化镉敏感型突变藻株的性状鉴定

(1)根据申请人前期的研究结果表明0.4mm氯化镉为筛选镉敏感型突变体藻株的最佳筛选浓度(具体见专利201611022254.9)。将tagp固体平板上的转化子在光周期培养3-4天至状态最佳时，一一对应编号涂在0.4mm氯化镉的tagp固体平板上，光周期下倒置培养，观察并记录转化子的生长状态。如果转化子在0.4mm氯化镉培养基上不能够正常生长而野生型能够正常生长，则初步认为是该突变体为氯化镉敏感型突变藻株。

(2)重复筛选几次，在0.4mm氯化镉的tagp平板上接种近乎等量的野生型衣藻21gr和初步认定的氯化镉敏感型的突变藻株，对比观察和记录两者的生长状态。如果在野生型能够正常生长的情况下，突变体生长受到抑制或者直接死亡，则可以确定该突变体为氯化镉敏感型突变藻株。如图2所示，所筛选到的突变体(ky2)为氯化镉敏感型突变体，与野生型衣藻21gr相比，21gr能够在0.4mm氯化镉的tagp平板上正常生长，而ky2突变体在接种1天后逐步开始死亡，基本上不能够生长，说明ky2突变体具有显著的氯化镉敏感性。

实施例3、敏感型突变藻株ky2的插入突变基因及突变位点的鉴定

(1)将tap固体培养基上生长状态良好的突变藻株ky2接种到含tap液体培养基的吹气瓶中，光周期下吹气培养至细胞浓度为4×10⁶细胞/ml时，收集细胞，液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)ctab法提取收集的ky2藻株的基因组dna，琼脂糖凝胶电泳检测提取的dna质量。如图3所示，m为dl5000dnamarker，1为ky2藻株的基因组dna。

(3)根据插入片段aphⅷ的核酸序列设计特异引物f-z2和f-z8，根据衣藻基因组特点设计引物q0和由q0与alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物degalui、degpsti、degsacii、degtaqi。以ky2藻株的基因组dna做模板，进行resdapcr，得到四种pcr产物，如图4所示，m为dl5000marker，a、p、s、t分别代表包含alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶的扩增产物。切500bp以上条带送测序。

所用引物序列见下表所示：

(4)将测序结果序列与aphⅷ片段序列进行比对，获得已知插入片段aphⅷ的部分序列及其侧翼序列。在phytozome网站上莱茵衣藻数据库中进行序列比对，即可获得插入突变基因的核酸序列、编码蛋白序列、aphⅷ片段插入位点及插入方向等信息。

(5)对氯化镉敏感型突变体ky2的插入突变基因的鉴定结果显示，突变体ky2是由于aphⅷ片段正向插入到g3148.t1基因的第3个内含子中造成的。图5为g3148.t1基因的结构示意图及具体的插入突变位点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>江汉大学

<120>莱茵衣藻g3148.t1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2367

<212>dna

<213>chlamydomonasreinhardti

<400>1

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770775780

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<210>3

<211>2118

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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