水稻抽穗扬花期耐热主效QTL位点qHTF‑1的分子标记方法及应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及稻米重要抗逆性状耐热主效qtl位点qhtf-1的分子标记方法，同时还涉及该分子标记方法在选育耐热抗逆水稻品种中的应用。
背景技术：
：全球气候持续变暖，给中国水稻生产带来了非常严重的影响。水稻对温度最敏感的时期为抽穗扬花期，此时期如遇日平均气温高于35℃的高温，易诱发小花不育，造成受精障碍，导致不能结实而降低产量。抽穗扬花期遭遇高温热害造成结实率大幅度下降而减产，如2003年夏，南方部分稻区38℃以上高温持续20多天，仅湖北、安徽两省受灾面积80多万公顷，损失产量10亿公斤以上；2006年，川渝地区发生特大高温灾害，导致当年水稻减产25％以上；2013年、2016年和2017年，中国长江流域的重庆、湖北、湖南、安徽和浙江等省区多次遭受大范围持续38℃以上的高温危害，导致水稻等粮食作物大面积减产，严重的结实率下降50％。因此，高温热害是影响我国水稻安全生产的最主要气象灾害，如何快速、准确选育耐热的水稻品种是当前育种家的主要目标。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种水稻抽穗扬花期耐热主效qtl位点qhtf-1的分子标记方法，同时还提供该方法在选育耐热抗逆水稻品种中的应用。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种水稻抽穗扬花期耐热主效qtl位点qhtf-1的分子标记方法，该方法是利用分子标记rm23的引物对或分子标记rm562的引物对中的一对或两对引物，对待鉴定水稻材料的dna进行pcr扩增，如扩增出对应大小的dna片段，则标志着水稻抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1存在；其中，上述分子标记rm23的引物对序列为：上游引物5’-cattggagtggaggctgg-3’(seqidno.1)、下游引物5’-gtcaggcttctgccattctc-3’(seqidno.2)，进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种特青相同位置的条带，扩增产物大小为140-150bp；上述分子标记rm562的引物对序列为：上游引物5’-cacaacccacaaacagcaag(seqidno.3)、下游引物5’-cttcccccaaagttttagcc-3’(seqidno.4)，进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种特青相同位置的条带，扩增产物大小为185-195bp。上述提及的pcr扩增时的反应体系组成：2μmol/l引物0.4μl、dna模板1.0μl、2×easytaqsupermix5.0μl以及ddh2o3.6μl，共10μl；反应条件为：94℃预变性5min后进行35个循环扩增，循环条件为94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，最后在72℃终延伸5min。本发明同时提供所述的水稻抽穗扬花期耐热主效qtl位点qhtf-1的分子标记方法在选育耐热抗逆水稻品种中的应用。本发明采用qtl位点的分子标记方法，是应用筛选到的与在耐热水稻品种特青第1染色体上定位到的抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1紧密连锁的2个ssr标记，预测水稻材料的高温耐性，加快耐热水稻品种的选择进度。附图说明图1为本发明实施例水稻品种特青抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1在第1染色体的定位，水稻抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1定位于rm23和rm562之间500kb区域。图2为本发明实施例中ssr引物rm23在亲本(特青和粤晶丝苗2号)及特青/粤晶丝苗2号f10群体中扩增产生的电泳图。其中：m为dnamarker标记，泳道1-24为特青/粤晶丝苗2号f10群体不同株系带型，其中靠上带型为耐热水稻品种特青带型，靠下带型为热敏感水稻品种粤晶丝苗2号带型。图3为本发明实施例中ssr引物rm562在亲本(特青和粤晶丝苗2号)及特青/粤晶丝苗2号f10群体中扩增产生的电泳图。其中：m为dnamarker标记，泳道1-24为特青/粤晶丝苗2号f10群体不同株系，其中靠上带型为耐热水稻品种特青带型，靠下带型为热敏感水稻品种粤晶丝苗2号带型。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，但不用以限制本发明的范围。实施例1供试材料：以耐热籼稻品种特青为母本，以热敏感籼稻品种粤晶丝苗2号为父本杂交，以一粒传法构建了含182个株系的特青×粤晶丝苗2号rilsf8和f10群体。1.表型鉴定2015年、2016年分别于湖南农业大学试验基地种植特青、粤晶丝苗2号及特青/粤晶丝苗2号rilsf8(2015年)、f10(2016年)群体182个株系，分3期播种，分别于2015年、2016年的4月18日、5月1日、5月14日播种，每期隔13天，于2015年、2016年的5月13日、5月26日、6月8日移栽，单本植，每期每个材料各种植50株，每期每个材料于水稻抽穗前20d左右选生育期一致的3株移入盆钵中。在每钵至少有3个分蘖穗抽出剑叶1cm左右的时候将材料分别移入人工气候室进行适温[24℃(06:00-8:00；19:00-23:00)/26℃(08:00-10:00；16:00-19:00)/30℃(10:00-16:00)/22℃(23:00-06:00)]和高温[34℃(06:00-8:00；19:00-23:00)/36℃(08:00-10:00；16:00-19:00)/38℃(10:00-16:00)/32℃(23:00-06:00)]处理，光照强度为29000lx，每天照光14小时，相对湿度为75％。标记同时抽穗的稻穗，其中特青×粤晶丝苗2号rils群体只选择生育期相近的141个株系进行适温或高温处理；连续处理7d后，将处理材料移到室外让其自然生长。成熟后考查标记穗的平均结实率，计算结实率下降值、热敏感指数。结实率下降值＝适温处理下的结实率－高温处理下的结实率；热敏感指数＝(结实率下降值÷适温处理结实率)×100％。2.遗传连锁图谱的构建选取水稻12条染色体上均匀分布，覆盖全基因组的516对ssr引物对耐热水稻品种特青和热敏感水稻品种粤晶丝苗2号两个亲本材料进行多态性筛选。其中174对引物在两亲本间表现出多态，多态性引物的比例为33.71％。选取两亲本间多态明显的174对共显性ssr标记，用含有141个株系的特青×粤晶丝苗2号rilf8群体，构建全基因组12条染色体的分子连锁图谱。该连锁图的总长度为1710.36cm，标记间平均距离为9.83cm，标记较均匀地分布在12条染色体上。3.抽穗扬花期耐热qtl的定位通过windowsqtlcartographer2.5定位软件进行复合区间作图进行抽穗扬花期耐热qtl分析，在第1染色体rm23～rm5385区间检测到主效的qhtf-1，其lod值为6.15，表型解释率为17.43％，加性效应为9.38，加性效应增效等位基因作用来自耐热亲本特青的等位基因。构建的遗传图谱中水稻第1条染色体水稻抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1的位置示意图见图1，部分电泳图见图2-图3。为精细定位这个区段的主效qtl，在这个区段又筛选到2个两亲本间有多态的ssr标记rm7075和rm562，用以加密此区段的标记数。以特青×粤晶丝苗2号rilf10群体的热敏感指数为表型指标对qhtf-1进行进一步定位，将其定位于分子标记rm23与rm562间，这两个标记间的距离为500kb，结合参见下表1。表1抽穗扬花期耐热主效qtl位点的分子标记4.分子标记r23、rm562对该主效qtl的分子标记辅助选择。利用rm23、rm562对特青、9311和日本晴等36个耐热性水稻品种进行抽穗扬花期耐热性鉴定(结果见表2)和水稻基因组dna进行pcr扩增，其中，本实施例中耐热性鉴定同上面表型鉴定方法，本实施例中pcr反应体系为：2μmol/l引物0.4μl、dna模板1.0μl、2×easytaqsupermix5.0μl以及ddh2o3.6μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min后进行35个循环扩增，循环条件为94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，最后在72℃终延伸5min。扩增产物进行电泳检测，结果表明，9311、不落稻等17个品种扩增出与特青对应大小的dna片段，即标志着该些水稻品种为水稻抽穗扬花期耐热主效qtlqhtf-1存在的水稻品种，均表现出耐热。表236个代表性水稻品种抽穗扬花期耐热性鉴定水稻品种耐热级别(耐热r/敏感s)水稻品种耐热级别(耐热r/敏感s)特青r日本晴s9311r05p30s不落稻r蒋庄1号s桃花米r落粒饭来稻s长芒早稻rirat109s密阳55号rpadi.ampirsita147rita216s98p202r水原330slemontr中粳83-dsnp980237r镇88stistar珍籼97bsnp980384r2954s浙174r尚州12号s云峰7号r黄寸谷s长毛谷r云峰3号s津糯10号r南阳6号s中籼91499r老光头s落粒小白芒r辽盐9号s虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>湖南农业大学<120>水稻抽穗扬花期耐热主效qtl位点qhtf-1的分子标记方法及应用<130>012<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列()<400>1cattggagtggaggctgg18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>2gtcaggcttctgccattctc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>3cacaacccacaaacagcaag20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>4cttcccccaaagttttagcc20当前第1页12