一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法与流程

文档序号：14241843阅读：484来源：国知局

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法，特别涉及血清型为印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。

背景技术：

沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。世界卫生组织的调查表明全球每年有1.3×10⁸例人类胃肠炎是由沙门氏菌感染引起的，其中死亡病例高达300万。而根据国家食品安全风险评估中心的调查数据表明，我国每年沙门氏菌食物中毒的发病人数超过900万人次，其中因鸡肉导致的沙门氏菌食物中毒的发病人数即达到300万人。因而对畜禽肉品进行沙门氏菌检测，可以及时发现病原，从源头消除沙门氏菌对人的传播与危害，保障食品安全与社会公共卫生。

虽然目前已报道的沙门氏菌血清型总数超过2600种，但其中与临床人畜感染及食品安全相关的血清型仅占极少数，最新的研究表明(prevalenceandantimicrobialresistanceofsalmonellaentericaserovarindianainchina(1984–2016)，zoonosesandpublichealth，2017，64(4):239-251.doi:10.1111/zph.12328.)，中国目前流行率最高的三种血清型是肠炎沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。大量研究表明，肠炎沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌不仅可以感染畜禽引发疫病，还可通过污染食品，特别是肉品，进而传播给人类，造成严重的公共卫生问题。鉴于上述血清型沙门氏菌对食品安全与公共卫生的重要性，迫切需要建立一种快速、实用的方法进行特异性检测。

传统沙门氏菌检测技术存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时(需依次经过预增菌，选择性增菌，生化鉴定与血清学分型)，不能满足及时有效的病原监测和疾病防控需求；灵敏度较低，当样品中沙门氏菌含量较低时，易造成假阴性结果；准确度不高，尤其是加工后的肉品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门氏菌形成营养缺陷型，用传统方法不易检出。

目前以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一。其中，多重pcr技术在保留了pcr方法敏感、特异、简便、快速等优点的同时，以其高效性成为了多病原同时检测的重要技术之一。但由于多重pcr实验设计较单一pcr更为复杂，在建立多重pcr反应体系时需考虑引物间的相互干扰，还需对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化，因而限制了该方法的广泛运用。

本发明以筛选出的沙门氏菌属以及印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌三种血清型的特有基因序列，设计多重pcr引物，建立检测方法。该方法特别适用于肉品中肠炎沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测。

技术实现要素：

本发明针对传统技术在检测肉品沙门氏菌中存在的不足，特别是如何提高灵敏度和特异性，提供了一种特异性检测肉品沙门氏菌，同时可对三种重要肉品来源沙门氏菌血清型(印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)进行快速分型的分子试剂盒及其非诊断性检测方法。

本发明技术方案如下：

本发明提供了一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述肉品沙门氏菌分子检测试剂盒包括10×pcr缓冲液、2.5u/μltaqdna聚合酶、10mmdntps、多重pcr检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物包括印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028基因组dna；所述阴性对照为灭菌双蒸水。

进一步的，所述多重pcr检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×pcr缓冲液2.5μl、dntps2μl、taqdna聚合酶0.25μl、检测引物组8μl、dna模板1μl以及适量的灭菌双蒸水。

进一步的，所述多重pcr检测方法的操作程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸35s；共30个循环，最后72℃延伸10min。

进一步的，所述10×pcr缓冲液含有100mmkcl、80mm(nh4)so4、ph为9.0的100mmtris-hcl、15mmmgcl2和0.5％tergitol-typenp-40。

进一步的，所述沙门氏菌属的扩增引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，印第安纳沙门氏菌的扩增引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示，肠炎沙门氏菌的扩增引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示，鼠伤寒沙门氏菌的扩增引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

进一步的，所述沙门氏菌属、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的引物对浓度均为10μm，等体积混合后得到检测引物组。

进一步的，所述dntps包括dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm。

更进一步的，一种使用肉品沙门氏菌分子检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：

s1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组dna，得到检测模板。

s2：将10×pcr缓冲液、dntps、taqdna聚合酶、检测引物组以及dna模板加入灭菌pcr反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用pcr仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明根据沙门氏菌属及三种重要肉品来源沙门氏菌血清型(印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)含有的特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点，同时，本发明通过一次反应，不仅可以特异性检测肉品中是否含有沙门氏菌，同时可对三种重要肉品来源沙门氏菌血清型进行快速分型，相比传统的血清学分型方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。

附图说明

图1为实施例1中分子检测方法的凝胶电泳展示图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-3分别为印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，泳道4为阴性对照；

图2为实施例2中分子检测方法特异性评价实验的凝胶电泳结果图。图中：m为dl-1000marker；泳道1-33为沙门氏菌标准株检测结果，分别为印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076、肠炎沙门氏菌cmcc50041、鼠伤寒沙门氏菌atcc14028、鼠伤寒沙门氏菌cmcc50015、德比沙门氏菌cmcc50112、纽波特沙门氏菌atcc6962、蒙特维的亚沙门氏菌atcc8387、山夫登堡沙门氏菌cmcc50050、海德尔堡沙门氏菌cmcc50111、肯塔基沙门氏菌cicc21488、婴儿沙门氏菌cmcc50348、汤卜逊沙门氏菌cmcc50023、阿贡纳沙门氏菌cicc21586、鸭沙门氏菌cmcc50774、圣保罗沙门氏菌cicc21486、波茨坦沙门氏菌cicc21500、布洛克利沙门氏菌cicc21489、猪霍乱沙门氏菌cicc21493、火鸡沙门氏菌cmcc50329、雷丁沙门氏菌cmcc50103、科特布斯沙门氏菌cmcc50123、都柏林沙门氏菌cmcc50042、甲型副伤寒沙门氏菌cmcc50001、埃森沙门氏菌cmcc50720、吉夫沙门氏菌cmcc50773、巴森海德沙门氏菌cicc21587、明尼苏达沙门氏菌cmcc50061、鸡白痢沙门氏菌atcc19945、鸡伤寒沙门氏菌atcc9184、邦戈尔沙门氏菌atcc43975、亚利桑那沙门氏菌atcc13314、双亚利桑那沙门氏菌atcc12325；泳道34-45为非沙门氏菌标准株检测结果，分别为大肠埃希氏菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc25923、铜绿假单胞菌atcc27853、奇异变形杆菌atcc12453、普通变形杆菌cmcc49027、粘质沙雷氏菌cmcc41002、表皮葡萄球菌cmcc12228、粪肠球菌atcc29212、屎肠球菌atcc35667、福氏志贺氏菌cmcc51572、肺炎克雷伯氏菌atcc700603、枯草芽孢杆菌atcc6633；泳道46为灭菌双蒸水。

图3为实施例3中分子检测方法检测印第安纳沙门氏菌灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为印第安纳沙门氏菌atcc51959菌液梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图4为实施例3中分子检测方法检测肠炎沙门氏菌灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为肠炎沙门氏菌atcc13076菌液梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图5为实施例3中分子检测方法检测鼠伤寒沙门氏菌灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028菌液梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图6为实施例3中分子检测方法检测印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌混合菌液灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028混合菌液梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图7为实施例3中分子检测方法检测印第安纳沙门氏菌基因组dna灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为印第安纳沙门氏菌atcc51959基因组dna梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图8为实施例3中分子检测方法检测肠炎沙门氏菌基因组dna灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为肠炎沙门氏菌atcc13076基因组dna梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图9为实施例3中分子检测方法检测鼠伤寒沙门氏菌基因组dna灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028基因组dna梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

图10为实施例3中分子检测方法检测印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌混合基因组dna灵敏度的电泳结果图。图中：m为dl-1000marker，泳道1-6为印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028混合基因组dna梯度稀释样品检测结果，泳道7为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1肉品沙门氏菌多重pcr检测方法的建立

引物的设计：根据genbank数据库中已有的沙门氏菌全基因组序列，通过分析比对后分别筛选出沙门氏菌属，以及印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌所特有的基因序列，再此基础上设计、优选得到本发明的特异性检测引物，如下表所示。

检测模板制备：印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028分别在tsb肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组dna抽提试剂盒提取上述沙门氏菌标准菌株基因组，作为待检模板。

多重pcr检测试剂的配制：沙门氏菌属、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的引物对用灭菌双蒸水分别稀释为10μm浓度，等体积混合后得到检测引物组；

多重pcr扩增试剂包括：10×pcr缓冲液(其组分包括100mmkcl、80mm(nh4)so4、ph为9.0的100mmtris-hcl、15mmmgcl2和0.5％tergitol-typenp-40)、dntps(包含dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm)、taqdna聚合酶(2.5u/μl)、检测引物组。

多重pcr检测体系及扩增程序：检测体系为25μl，具体包括：10×pcr缓冲液2.5μl，dntps2μl，taqdna聚合酶0.25μl，检测引物组8μl、dna模板1μl以及适量的灭菌双蒸水。扩增程序的步骤包括：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸35s；共30个循环，最后72℃延伸10min。

检测结果的判定：取5μl扩增产物，加1μl6×loadingbuffer混匀，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100v电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定。其中印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌不仅在653bp位置出现扩增条带，还分别在409bp、296bp和244bp处出现特异性条带。

实施例2特异性评价实验

用实施例1的方法进行本发明分子检测方法的特异性评价，将试验菌株进行富集培养后，试剂盒提取基因组dna，按照实施例1所述方法进行多重pcr检测，结果如图2所示，只有印第安纳沙门氏菌(泳道1)、肠炎沙门氏菌(泳道2、3)和鼠伤寒沙门氏菌(泳道4、5)三种血清型菌株显示出两条特异性扩增条带，其它血清型沙门氏菌只出现一条特异性扩增条带，而非沙门氏菌菌株均无非特异性扩增条带。所用菌株及菌株编号如下表所示。

实施例3灵敏度评价实验

用实施例1的方法进行本发明分子检测方法的敏感性评价。将印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028分别在tsb肉汤培养基中增菌培养，将菌液进行细菌计数后10倍梯度稀释，取不同浓度细菌进行pcr扩增；同时使用商品化的细菌基因组dna抽提试剂盒提取细菌基因组，测定其原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度细菌基因组dna进行pcr扩增。pcr扩增结束后取取5μl扩增产物，加1μl6×loadingbuffer混匀，使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测。图3为印第安纳沙门氏菌atcc51959菌液灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²和1×10¹cfu/反应，泳道7为阴性对照；图4为肠炎沙门氏菌atcc13076菌液灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²和1×10¹cfu/反应，泳道7为阴性对照；图5为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028菌液灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²和1×10¹cfu/反应，泳道7为阴性对照；图6为印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028混合菌液灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6对应的每种血清型沙门氏菌的反应浓度依次为1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²和1×10¹cfu/反应，泳道7为阴性对照；图7为印第安纳沙门氏菌atcc51959基因组dna灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg/反应，泳道7为阴性对照；图8为肠炎沙门氏菌atcc13076基因组dna灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg/反应，泳道7为阴性对照；图9为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028基因组dna灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6反应浓度依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg/反应，泳道7为阴性对照；图10为印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028混合基因组dna灵敏度检测结果，图中m为dl-1000marker，泳道1-6对应的每种血清型沙门氏菌的反应浓度依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg/反应，泳道7为阴性对照；从图3-10所示，本发明的分子检测方法对印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌菌液的检测灵敏度均为1×10²cfu/反应，对基因组dna的检测灵敏度均为10pg/反应，具有较高的检测灵敏度。

实施例4多重pcr检测试剂盒的组装

使用细菌基因组dna抽提试剂盒提取沙门氏菌标准株基因组dna(印第安纳沙门氏菌atcc51959、肠炎沙门氏菌atcc13076和鼠伤寒沙门氏菌atcc14028)，得到本发明的阳性对照；根据实施例1表中的序列合成3对特异性检测引物，用灭菌双蒸水稀释为10μm浓度，等体积混合后得到检测引物组；多重pcr扩增试剂：10×pcr缓冲液(其组分包括100mmkcl、80mm(nh4)so4、ph为9.0的100mmtris-hcl、15mmmgcl2和0.5％tergitol-typenp-40)、dntps(包含dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm)、taqdna聚合酶(2.5u/μl)、检测引物组、阳性对照(沙门氏菌标准菌株dna模板)以及阴性对照(灭菌双蒸水)。

将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的禽源沙门氏菌多重pcr检测试剂盒。

实施例5临床样品检测

从超市采集各类生鲜畜禽肉品，分别接种于sbg增菌液中37℃培养24h，使用商品化试剂盒提取细菌基因组dna，按照实施例1中的方法进行多重pcr检测，并设置阳性对照和阴性对照。同时按照沙门氏菌检验国家标准(gb4789.4-2016)中的方法进行沙门氏菌分离鉴定与血清学分型。结果见下表所示，表中，“sal”代表沙门氏菌，“si”代表印第安纳沙门氏菌，“se”代表肠炎沙门氏菌，“st”代表鼠伤寒沙门氏菌。由表可见在采集的351份畜禽肉品中，本发明方法检出65例沙门氏菌阳性样品，印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌阳性数分别为27、20和7，在国标检测方法共检出60例阳性，印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌阳性数分别为26、17和7，说明本发明试剂盒所建立的检测方法在临床实际检测中的灵敏度高于传统细菌学检测方法。此外本发明的多重pcr方法中检测为沙门氏菌，或分子分型结果为印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的样品，与国标方法检测结果一致，说明本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好的准确性。此外沙门氏菌国标检测方法(gb4789.4–2016)所需时间为4-5天，采用本发明试剂盒检测全程所用时间约为4小时。

以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏省家禽科学研究所

<120>一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法

<141>2018-01-11

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna