快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法与流程

本发明涉及pcr检测试剂盒，具体地指一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr引物对及试剂盒和方法。

背景技术：

猪丹毒杆菌可引起猪的败血症、多发性关节炎和心内膜炎等，人对猪丹毒杆菌易感，表现为皮肤型或败血症，称为“类丹毒”。农业部2013年发布的全国生猪疫情报告显示，猪丹毒病例的发病数量远高于猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪囊虫病、炭疽、猪肺疫及布鲁氏菌病。猪链球菌是中国猪源链球菌病的最主要病原。

猪丹毒杆菌有25个血清型，我国流行的主要血清型是1a和2型。王雷等利用spaa基因设计pcr引物，能够快速鉴定猪丹毒杆菌，并能区分猪丹毒弱毒疫苗株和其他野生流行株。2003年okwumabuao利用猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)设计引物来检测猪链球菌，近年来，大量的临床检测表明gdh基因是猪链球菌的特异性基因，仅存在于猪链球菌中且广泛存在于猪链球菌所有血清型中。

临床常用pcr方法检测样品中猪丹毒杆菌和猪链球菌和存在，但多次单个的pcr反应会造成不必要的浪费，同时临床上有大量混合感染病例，对于猪丹毒杆菌和猪链球菌的混合感染样品，单个pcr反应很难进行全面、快速的检测。因此，迫切需要设计猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr检测的引物对及试剂盒及方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr引物对及试剂盒和方法。其在pcr基础上产生的双重pcr方法，以两对引物代替单一引物，能够更加快捷的扩增不同细菌的目的片段，大大缩短了鉴定时间；可以为两种致病菌的临床检测提供更加简便快捷的技术手段，对防控猪丹毒杆菌和猪链球菌具有重要的意义。

为实现上述目的，本发明提供的一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr引物对，所述二重pcr引物对为：

本发明还提供了一种猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr检测试剂盒，所述二重pcr试剂盒包括引物混合液，所述引物混合液中含有下述引物对：

进一步地，所述引物混合液中引物spaa-1f、spaa-1r、gdh-1f和gdh-1r浓度均为45～50μm。

再进一步地，所述二重pcr试剂盒还包括2×pcr反应缓冲液和ddh2o，其中2×pcr反应缓冲液中含有dna聚合酶easytaq、2.5mm的mg²⁺浓度氯化镁和dntps。

本发明还提供了一种利用上述二重pcr检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)采用煮沸法提取待检样品基因组dna，

2)使用上述试剂盒进行pcr，得到pcr产物，电泳完成后于凝胶成像系统下观察结果：

若片段长度为770bp，则说明待检样品为猪丹毒杆菌；

若片段长度为525bp，则说明待检样品为猪链球菌；

若凝胶成像系统下观察到有两条目的片段，且从上到下两条片段长度依次为770bp和525bp，则说明待检样品有猪丹毒杆菌和猪链球菌。

作为优选方案，所述步骤1)中，煮沸法提取方法：

1)首先将待检样品组织剪碎匀浆加入ddh2o混匀并经蛋白酶k消化处理，

2)再经沸水浴后立即冰浴，离心收集上清即为待检样品基因组dna。

作为优选方案，所述步骤2)中，：

a.pcr反应体系为：

b.pcr反应条件为：

(1)预变性：94℃2分钟；

(2)循环35次

变性：94℃30秒，

退火：55℃30秒，

延伸：72℃1分钟；

(3)终延伸：72℃2分钟。

本发明的有益效果在于：

本发明的二重pcr检测试剂盒可在同一pcr反应中同时检测两种细菌，可大幅节约检测成本和节省时间。本方法不需要复杂的试验仪器，不需要无菌操作环境，煮沸法提取基因组操作简单。

附图说明

图1为二重pcr的阳性对照和阴性对照图，

图中，m为dnamarker；孔1为二重pcr阳性对照；孔2、3分别为猪丹毒杆菌和猪链球菌各自的阳性对照，孔4为阴性对照；

图2为二重pcr检测试剂盒的特异性试验，

图中，m为dnamarker，孔1为阳性对照，孔2为阴性对照，孔3-11：猪丹毒杆菌、猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌；

图3为二重pcr检测试剂盒的敏感性试验，

m为dnamarker，孔1pcr产物模板为阳性对照；孔2pcr产物模板为阴性对照；3-8pcr产物模板为猪丹毒杆菌，细菌量分别为2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10、2cfu；孔9-14pcr产物模板为猪链球菌，细菌量分别为2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10、2cfu。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1二重pcr引物对和试剂盒的制备

使用primerpremier6软件分别对spaa基因和gdh基因(其序列如序列分别为seqidno.1和seqidno.2)设计pcr扩增引物，并委托武汉擎科生物工程有限公司合成引物。引物合成后用ddh2o稀释到50μm，引物序列如下：

每个试剂盒检测100个样品，按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)：

1、2×pcr反应缓冲液(含有dna聚合酶easytaq、2.5mm的mg2+浓度氯化镁、dntps)：1.25ml

2、引物混合液(含有spaa-1f、spaa-1r、gdh-1f和gdh-1r浓度均为50μm)：400μl

3、阳性对照溶液：100μl

4、ddh2o：1ml

a.pcr反应体系为：

b.pcr反应条件为：

(1)预变性：94℃2分钟；

(2)循环35次

变性：94℃30秒，

退火：55℃30秒，

延伸：72℃1分钟；

(3)终延伸：72℃2分钟。

实施例2：猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr检测试剂盒制备及其阳性对照的检测

分别取分离鉴定的猪丹毒杆菌se10和猪链球菌sc19，使用煮沸法提取两个细菌的基因组；按下述序列合成2对引物，稀释至50μm备用。

spaa-1f：5’-cagcaatgccactacaaacag-3’,

spaa-1r：5’-tacaacttgaatttggcgatt-3’,

gdh-1f：5’-aagcagtcaaagcccgc-3’,

gdh-1r：5’-ggaggcgtttgtattgacc-3’；

使用大连宝生物公司的dna聚合酶easytaq及其配套的10×buffer，反应体系为：引物混合液4μl(含spaa-1f、spaa-1r、gdh-1f、gdh-1r各1μl)，pcr缓冲液19.5μl(含dntps2μl，10×buffer2.5μl，ddh2o15μl)，easytaq(大连宝生物公司)0.5μl，标本dna1μl。使用微量移液器吹吸混匀，高速瞬时离心。

反应条件为：(1)预变性：94℃2分钟，(2)循环35次：变性：94℃30秒；退火：56℃30秒；延伸：72℃1分钟，(3)终延伸：72℃2分钟。pcr产物经10g/l琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

回收产物插入到载体pmd18-t上，转化进入大肠杆菌，使用含氨苄青霉素的培养基进行培养，并将阳性克隆送上海生工公司测序鉴定。测序结果表明目的片段已正确插入载体中。大肠杆菌即为含目的片段载体的细菌。使用上海生工公司质粒提取试剂盒提取大肠杆菌的质粒，两种重组质粒按1:1混合，使用ddh2o调整为100ng/μl即为本检测试剂盒中的阳性对照。

实施例3：猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr检测试剂盒对临床样品的检测

用本检测检测试剂盒从屠宰厂采集的511份心、肺、肾、肝、脾、脑及关节样品，检测步骤如下：

标本dna的提取：将10g病变的组织匀浆，于37℃培养5h，经蛋白酶k(25g/l)于64-65℃水浴2h。取1ml消化产物，沸水中加热5min并快速置于冰浴中5min，12000rpm离心2min，取上清即为样品dna。

pcr扩增：以提取的病料基因组为模板进行pcr反应，同时设置阳性对照和阴性对照。pcr反应体系和反应条件见实施例1。

pcr扩增产物分析：pcr反应扩增完成后，向产物中加入适量溴酚蓝上样缓冲液。使用电泳缓冲液配制10g/l的琼脂糖凝胶，凝胶中加入0.005％的goldview染料进行染色。使用微量移液器向每个凝固的胶孔中加5μl扩增产物，设置dnamarker孔。在恒定电压下电泳。电泳完成后使用凝胶成像系统观察并拍照，将待检样品孔与阳性对照和阴性对照孔进行比较，从而判定两种细菌标本的阳性和阴性。

用本检测试剂盒检测的511份临床样品中，有37份是猪丹毒杆菌阳性；63份是猪链球菌阳性；12份是猪丹毒杆菌和猪链球菌阳性。对112份阳性样品进行细菌分离鉴定全部为阳性，符合率为100％，说明本方法具有良好的敏感性。从399份阴性样品中随机抽取50份样品进行细菌分离鉴定，没有分离到猪丹毒杆菌和猪链球菌。

实施例4：猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr检测试剂盒的特异性试验和敏感性试验。

本实施例中细菌基因组提取、pcr反应体系和反应条件同实施例1。

特异性试验：利用本检测试剂盒分别对猪丹毒杆菌和猪链球菌进行pcr试验检测，均获得清晰的目的条带，对马链球菌兽疫亚种、大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌进行检测，结果均未见阳性条带。说明本检测试剂盒具有良好的特异性(图2)。

敏感性试验：将已知猪丹毒杆菌和猪链球菌细菌数的菌液使用细菌基因组试剂盒提取基因组，使用两种基因组模板的细菌量分别为2×10⁵至2×10cfu，进行pcr；

结果表明：使用本检测试剂盒检测猪丹毒杆菌和猪链球菌的最低检出量均为2×10²cfu。表明本检测试剂盒具有良好的敏感性(图3)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重pcr引物对及试剂盒和方法

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