一种用于速生刺参育种的遗传分子标记和应用的制作方法

本发明属于水产遗传育种领域，具体地涉及一种用于速生刺参育种的遗传分子标记和应用。

背景技术：

刺参属于棘皮动物门echinodermata、海参纲holothuroidea，是我国北方重要的海珍品之一。近年来，我国刺参养殖得以长足发展，规模拓展迅猛，直接经济产值约300亿元，是我国海水养殖产业中单一产值最大的物种，为沿海渔业经济结构的调整和渔民就业及增产增收提供了重要途径。但是随着刺参产业规模的不断拓展，种质退化、生长缓慢、养殖周期长、抵御环境变化能力差、病害频发等一系列制约或潜在制约产业发展的瓶颈问题也日益凸显。对刺参进行遗传改良，培育出具有生长速度快等优良性状的新品种，是刺参养殖业健康发展的重要保证。

刺参的良种选育工作相对于其他经济水产生物开展的较晚，目前的选育方式仍以选择育种和杂交育种为主，其他如分子辅助育种、基因组选择育种等核心育种技术研究尚处于初级阶段。

随着刺参研究热度的增加(孙国华等，2011)，目前对刺参性状相关snp发掘的越来越多，gao等(2013)开发了26个与刺参的防御机制相关的snp位点；dong等(2016)在对野生和人工养殖的刺参遗传多样性和种群结构的研究中利用hrm发掘了51个相关snp位点解释了遗传多样性降低的原因；li等(2016)克隆了刺参myostain基因并发现了与刺参干重相关的3个snp位点；董玉等(2016)在对snp与生长的关联分析中发现了10个生长性状显著相关的位点。但这些标记并未进行下一步的扩大验证和生产性验证，其应用的可行性和准确性有待进一步验证。

为了开发可用于实际选育生产实践的刺参生长性状相关分子标记，申请人构建了刺参高密度遗传连锁图谱，利用方差分析及复合区间作图对体重性状进行qtl定位，选择体重qtl区段且可适于引物设计的snp位点，应用所设计的引物在扩大的群体里进行snp标记验证，筛选出生长性状相关位点及位点的优势基因型，并在选育实践中进行了生产性验证，最终得到了可用于刺参生长性状分子标记辅助选择育种的标记及其优势基因型。利用该标记建立了刺参分子辅助育种方法，并将其应用到刺参良种选育过程，培育生长速度快的刺参新品种，将有效解决刺参养殖产业目前面临的种质退化问题，且有力推动刺参养殖良种化进程。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于速生刺参育种的遗传分子标记和应用，包括分子标记引物及相关标记的优势基因型和检测方法，并将其用于生长快刺参材料的选育。

本发明是按如下技术方案实现的：

一种用于速生刺参育种的遗传分子标记snp160,该标记用于生长性状辅助选育的优势基因型为aa。

进一步,扩增所述标记snp160的引物对为snp160f:5’-tcgcaggaaaccaaccttca-3’和snp160r:5’-aagggagggtcaaggaggat-3’。

进一步，该标记扩增检测用体系为：dna模板50ng/μl1μl，4.5μl2×estaqmastermix，上下游引物各0.5μl、10μmol/l，3.5μlddh2o；标记分型用pcr反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；分型采用高分辨率熔解曲线分析技术(hrm)方法进行。

进一步，利用该标记进行刺参生长性状辅助育种包括(1)亲本dna提取及分型；(2)亲本选择；(3)子代苗种繁育3个部分。

进一步，上一步所述的亲本dna提取及分型是以微创方法自候选亲本管足或者棘刺组织处提取dna，运用所述标记snp160对亲本相应位点的基因型进行分型。

进一步，所述的亲本选择中，选择的优势亲本为在该位点基因型为(aa)的个体。

进一步，所述的子代苗种繁育，是以上述方法筛选的个体为亲本育种群体进行子代苗种繁育。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明为速生刺参育种工作的分子标记辅助选育提供一个更加高效准确、简便易行的分子遗传标记，为提高刺参生长速度这一重要性状提供了有效的分子标记育种手段。利用相应标记及其组合同时在家系、扩大发育群体和育种实践中均进行了验证，用该标记组合对刺参生长进行标记辅助选择，可有效地缓解实际生产中的生长速度慢等问题，对提高养殖效益具有重要意义。

2、使用该分子标记组合进行分子选育，目标明确，选择效率高，选育后选育性状稳定。

3、本发明检测方法操作简单，费用较为低廉，准确度高，并可实现自动化程序化检测，将在刺参抗病育种中发挥巨大作用。

附图说明

图1为刺参高密度遗传连锁图谱及体重qtl；

图2为不同基因型亲本繁育子代苗种的生长情况。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1：刺参生长性状选育用遗传分子标记的获得及其在家系子代中的验证

构建刺参家系，以该家系的2个亲本和142个子代为作图群体，借助高通量测序平台，开发slaf标记，利用highmap软件构建了刺参高密度遗传连锁图谱。高通量测序后，共开发264,810个slaf标签，其中多态性的slaf标签112,322个。slaf标签亲本平均测序深度为23.67×，子代平均测序深度为5.44×。通经过生物信息学分析，可以用于遗传图谱构建的标签有50,905个，经过质量过滤后，得到测序深度、完整度高且没有偏分离的多态性标签4629个。将筛选出的4629个slaf标签，作连锁分析，计算两两标签之间的重组率和mlod值，得到23个连锁群，共上图4,002个，定位为上图标记，上图率86.45％。以连锁群为单位，采用highmap软件分析获得连锁群内marker的线性排列，并估算相邻marker间的遗传距离，构建高密度遗传图谱。其中，中性图谱包含4002个标记，总图距为3223.84cm；雄性图谱共包含2228个上图标记，总图距为3864.73cm；雌性图谱共包含2307个上图标记，总图距为2075.84cm。

根据142个子代体重的测定结果，结合23个连锁群的图谱和分型数据，对体重这一性状进行数量性状关联分析。采用软件mapqtl5的internalmapping方法进行qtl分析。结果显示，在lg19连锁群上存在1个与性状关联区域，如图1所示，共含有4个slaf标记。根据这4个slaf标记的测序序列筛选可用于设计snp扩增的引物序列的3个snp标记，其中包含位于marker34166上的snp160位点，对该位点在家系中不同基因型与体重性状的多重比较分析见表1。可以看出在构建家系所用子代个体中，snp160位点检测到(aa)、(ac)和(cc)3种基因型，不同基因型的子代个体体重存在显著差异，(aa)基因型的苗种体重显著高于(ac)和(ct)基因型个体体重，表明该位点的优势基因型分别为(aa)。

表1snp160位点在家系中不同基因型与体重性状的多重比较分析

实施例2：刺参生长相关snp分子标记在扩大群体中的验证

根据高通量测序获得的snp160位点的两侧侧翼序列，设计snp位点扩增检测用引物，相应的引物序列为snp160f:5’-tcgcaggaaaccaaccttca-3’和snp160r:5’-aagggagggtcaaggaggat-3’。利用相应序列在扩大群体中利用hrm小片段法对这该snp位点进行分型并结合扩大群体的相关性状数据进行了qtl位点验证。所用扩大群体为同一批次大规模育苗并同一养殖环境中培育的10月龄苗种，随机抽取106头个体，测定了个体的体重。利用hrm方法进行个体的基因型检测，该标记的扩增检测用体系为：dna模板1μl(50ng/μl)，4.5μl2×estaqmastermix，上下游引物各0.5μl(10μmol/l)，3.5μlddh2o；pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；标记的分型采用高分辨率熔解曲线分析技术(hrm)方法进行。对扩大群体刺参苗种体重性状与该标记相关性分析结果得出，snp160与体重性状极显著相关(p<0.01)。

对snp160位点的不同基因型与体重这一性状的多重比较分析结果见表2。可以看出基因型为(aa)的苗种平均体重显著高于(ac)和(cc)型苗种，表明该位点的优势基因型分别为(aa)。

表2snp160位点在扩大群体中不同基因型在关联性状的多重比较分析

实施例3：生长性状辅助选择育种的分子标记在刺参育种生产中的应用

在刺参春季育苗期，自所培育的亲参中随机选择100头亲参，利用hrm技术对100头亲参在snp160位点的基因型进行分型。所用的引物序列为snp160f:5’-tcgcaggaaaccaaccttca-3’和snp160r:5’-aagggagggtcaaggaggat-3’，扩增检测用体系为：dna模板1μl(50ng/μl)，4.5μl2×estaqmastermix，上下游引物各0.5μl(10μmol/l)，3.5μlddh2o；pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；标记的分型采用高分辨率熔解曲线分析技术(hrm)方法进行。根据分型结果，选取基因型在该位点表现为(aa)的个体10头(5雌5雄)、(ac)的个体10头(5雌5雄)和(cc)的个体10头(5雌5雄)进行子代苗种繁育。3批次苗种同期育苗，苗种培育过程中保证养殖管理和养殖环境的一致性，分别在苗种5月龄、6月龄、7月龄和8月龄时随机抽取苗种500头进行体重测定，绘制不同苗种的体重增长曲线图(见图2)。由图2可以看出，由基因型为(aa)的亲本繁育的子代在苗种培育期间的平均体重显著高于由(ac)和(cc)型亲本繁育的子代苗种。证明以snp160位点为(aa)的个体繁育的子代苗种生长速度更快。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种用于速生刺参育种的遗传分子标记和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工设计的引物序列snp160f(artifical)

<400>1

tcgcaggaaaccaaccttca20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工设计的引物序列snp160r(artifical)

<400>2

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