一种β₂-受体激动剂酶联免疫试剂盒及其使用方法和应用的制作方法

专利名称：一种β₂-受体激动剂酶联免疫试剂盒及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于检测试剂盒领域，涉及瘦肉精检测试剂盒，尤其是一种β 2-受体激动剂酶联免疫试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术：
近年来，随着畜牧业的发展，兽药的使用也日益广泛，已逐渐成为不可缺少的物质基础之一。包括β2_受体激动剂在内的兽药在促生长、提高饲料转化率和利用率以及改善产品品质等方面确实起到了十分显著的作用。然而，在促进畜牧业发展的同时，兽药的使用无疑会导致药物本身及其代谢产物在动物体内的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统，从而造成危害。动物源性食品安全问题，特别是滥用或非法使用兽药及违禁药品，使畜禽类产品残留兽药的问题日益突出，给人民健康造成了很大的威胁，并且已成为畜牧业发展的一个主要矛盾。随着我国加入世界贸易组织，今后发达国家低价格、低残留的动物源性食品势必大量涌入我国。如果不积极采取有效措施，不但我国的动物源性食品出口不畅，而且连在国内市场的地位也会受到严重冲击，将非常不利于养殖业的健康发展。β 2-受体激动剂，又称为β 2-兴奋剂，是一类人工合成苯乙胺类药物，常见的有克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、拉贝特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁等。β 2-受体激动剂具有促进肌肉生长、减少脂肪沉积、改善肉质作用，因此有一些饲料生产商与家畜生产者违禁使用该药品于家畜养殖中。由于β2-受体激动剂在动物体内有较长的残留时间和短期内产生较大的残留量，特别是内脏中蓄积残留，通过食物链进入人体，会使一些易感人群，如老人、孕妇、心脏机能较差者产生较明显的中毒症状，严重危害人类健康，欧美等国立法禁止在家禽生产上使用，我国农业部也于1997年作出相同的规定。但在经济利益的驱使下，各国违法滥用现象仍较普遍。1990年至1995年间意大利、法国和西班牙因食品克伦特罗污染发生的中毒事件超过500余起，我国也发生过中毒事件。为了保障我国动物 食品的安全性，保护公众健康安全，建立有效快速的定量确证方法十分必要。1.1β2-受体激动剂的结构β 2-受体激动剂具有苯乙醇胺结构母核，苯环上连接有碱性的β -羟胺(仲胺)侧链，侧链的取代基通常为N-叔丁基、N-异丙基或N-烷基苯，能与无机酸或有机酸成盐。常见的有克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、拉贝特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁。其基本结构为:
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按照苯环上取代基的差异，可将β2_受体激动剂分为苯胺型和苯酚型。苯胺型结构中具有芳伯胺基，中等极性，芳伯胺基常被用于衍生化分析。典型的药有克伦特罗，其结构为:
权利要求
1.一种β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒，其特征在于:其组成成分及比例如下: 包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液，浓缩提取液； 所述包被板为孔底包被有抗沙丁胺醇多克隆抗体；包被量为5 μ g/mL,包被温度4°C过夜； 所述校准品为不同浓度的盐酸克伦特罗系列校准品；浓度为0，0.lppb，0.3ppb，0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb ； 所述酶标记物工作液为含有标记辣根过氧化物酶的沙丁胺醇半抗原，为过碘酸钠法将辣根过氧化物酶同沙丁胺醇半抗原结合；酶标记物用酶稀释液稀释； 所述底物液A为重量百分比为0.07%的过氧化氢脲溶液； 所述底物液B为重量百分比为0.04%的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液； 所述终止液为2M硫酸； 所述的浓缩提取液为0.2mol/L PH为7.4的磷酸盐缓冲液； 所述的浓缩洗涤液为含质量浓度为1%的吐温20，0.2mol/l pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的β2_受体激动剂酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述酶标记物工作液为:用酶稀释液将标记辣根过氧化物酶的沙丁胺醇半抗原稀释，至沙丁胺醇半抗原:酶稀释液的体积比为1 :1000 ;酶稀释液为含质量浓度为1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的β2_受体激动剂酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述底物液A使用0.1M的醋酸-柠檬酸缓冲液稀释；所述底物液B使用0.1M的醋酸-柠檬酸缓冲液将3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺稀释至3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的质量浓度为0.04%。
4.根据权利要求1所述的β2_受体激动剂酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述浓缩洗涤液为20Χ浓缩洗涤液，使用前按照0.2Μ磷酸盐吐温缓冲液:蒸馏水的体积比为1:19的比例稀释，混匀后使用；所述浓缩提取液20Χ浓缩提取液，使用前按照0.2Μ PBS磷酸盐缓冲液:蒸馏水的体积比为1:19的比例稀释，混匀后使用。
5.根据权利要求1所述的β2_受体激动剂酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述包被板的包被步骤如下: ⑴抗体包被:用抗沙丁胺醇多克隆抗体最佳包被浓度包被酶标板，IOOuL/孔，4°C过夜，最佳包被量为5μ g/mL，0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液作为稀释液用于包被固相载体；⑵洗板:将孔内液体甩干，用洗涤液250 μ L/孔洗涤4飞次，每次间隔10s，用吸水纸拍干; ⑶封闭:将由质量分数为1%的牛血清白蛋白和质量分数为10%的蔗糖的磷酸盐缓冲液组成的封闭液加入酶标板，200UL/孔，37°C温育2小时，将孔内液体甩干，拍干，真空干燥，加铝箔袋真空封装。
6.如权利要求1至5任一项权利要求所述的β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒在快速定量检测β2-受体激动剂残留量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述β2-受体激动剂来源于尿液、血清、肌肉组织、饲料或牛奶中。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所述检测β2-受体激动剂的最低检测限为0.1ng/mL。
9.一种如权利要求1至5任一项所述的β 2-受体激动剂酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于:步骤如下: ⑴将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，摇匀； ⑵取出微孔板，将不用的微孔板放入铝钼袋，保存于2-8°C ； ⑶浓缩洗涤液在使用前回复到室温； ⑷编号:将样本和校准品对应微孔按序编号，每个样本和校准品做平行，并记录校准孔和样本孔所在的位置； (5)加校准品/样本:加入校准品及样本各50μ L到对应的微孔中，随即加入酶标记物工作液50 μ L/孔,振荡混匀,用封板膜封板后置25°C避光环境中反应30min ； (6)洗板:揭开封板膜，将孔内液体甩干，用浓缩洗涤液250μL/孔洗涤4飞次，每次间隔IOs,拍干； ⑴显色:底物A液和底物B液按体积比1:1混匀，100 μ L/孔加入微孔板中，振荡混匀，用封板膜封板后，置25°C避光环境中反应15min ； ⑶测定:加入终止液50 μ L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值； ⑶结果:所获得的校准品和样品吸光度值的平均值除以第一个校准的吸光度值再乘以·100,即可检测得出β2-受体激动剂剂量。
全文摘要
本发明涉及本发明涉及一种β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒，其组成成分及比例如下包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液，浓缩提取液。本发明试剂盒的灵敏度为0.1ppb，精密度批内变异系数(CV%)，CV%<5%；批间变异系数(CV%)，CV%<10%；准确度以回收率表示准确度，回收率应在80%—110%之间。IC50范围在0.3-0.5ppb之间，线性相关系数|r|不小于0.9900，具有使用范围广、使用方便、检测准确的优点。
文档编号G01N33/53GK103235117SQ201310128270
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者钟凯 申请人:天津康利缘生物工程有限公司