本发明涉及微藻组分提取领域，更特别地，涉及一种使用尿素纯化藻油中的GLA的方法。
背景技术：
γ-亚麻酸(gamma linolenic acid，GLA)，属于n-6系列多不饱和脂肪酸中的一种，它的化学名称为全顺-Δ6、Δ9、Δ12－十八碳三烯酸，分子式为C18H28O2，为无色油状液体，在空气中极易被氧化。GLA是人体必需脂肪酸之一，它在生物体内经过复杂的代谢过程，产生多种次生代谢产物。主要形成二高-γ-亚麻酸或花生四烯酸，进而转化为前列腺素、白三烯和凝血恶烷等。GLA和其系列代谢物在免疫系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系统中都具有重要而广泛的生理作用。在临床上，GLA可用于某些老年性疾病如糖尿病、高血脂病、动脉粥样硬化、血栓性心脑血管疾病、癌症以及胃溃疡、肥胖症、精神分裂症、特应性湿疹、风湿性关节炎、脉管炎等，还可用于合成前列腺素的前体，有调节血压和胆固醇合成的作用，并可起到控制炎症和促进细胞增殖的功效。
一般植物中亚麻酸的含量比较少，而且往往还含有比较高浓度的α-亚麻酸，该物质是GLA的同分异构体，在GLA的提纯过程中不易分离。研究发现，一些藻类例如栅藻、螺旋藻等中，GLA占总脂肪酸的含量可达15-25％，经过藻种选择和培养条件优化，GLA的含量甚至可高达30-40％，远高于高等植物中的GLA含量。因此，可从这些藻类中提取GLA用于科学研究或临床用途。
尿素包合法是从动植物油脂中富集多不饱和脂肪酸的方法之一。尿素包合法的原理是尿素分子在结晶过程中与饱和脂肪酸或单不饱和脂酸形成较稳定的晶体包合物析出,而多价不饱和脂肪酸由于双键较多,碳链弯曲,具有一定的空间构型,不易被尿素包合。采用过滤的方法除去饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸与尿素形成的包合物,就可得到较高纯度的多价不饱和脂肪酸。
尿素包合技术具有投资少，工艺简单，操作温度低，能比较完全地保留不饱和脂肪酸的营养和生理活性等优点。但是，当藻油中存在DHA、EPA等多不饱和脂肪酸时，使用尿素包合法无法分离得到高纯度的GLA。其原因在于，使用该方法无法去除DHA、EPA，而保留GLA。因此，需要一种新的方法来纯化GLA。
技术实现要素：
我们在研究尿素包合法时，发现当包合温度降低到一定程度时，混合脂肪酸样品的GLA大量减少，而DHA和EPA的量几乎不变，这为我们纯化GLA提供了新的思路。
基于以上发现，本发明提供了一种纯化藻油中的GLA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：使用所述藻油制备游离脂肪酸样品；
S2：将所述游离脂肪酸样品加入尿素溶液中于0-4℃下进行第一包合反应，过滤，去除滤渣，用石油醚从滤液中萃取脂肪酸，得到不饱和脂肪酸样品；
S3：将所述不饱和脂肪酸样品加入尿素溶液中于-40--30℃下进行第二包合反应，过滤，收集滤渣；
S4：从所述滤渣中提取GLA。
在一个具体实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：将所述藻油加入0.5M的KOH甲醇溶液中，得到皂化反应体系；
S12：将所述皂化反应体系于55℃下回流，至油滴消失，得到反应产物；
S13：用石油醚从所述反应产物中萃取游离脂肪酸，蒸发石油醚后得到所述游离脂肪酸样品。
在一个具体实施方案中，S2包括以下步骤：
S21：于60℃下配制0.1g/ml的尿素乙醇溶液；
S22：将所述尿素乙醇溶液加入装有所述游离脂肪酸样品的容器中，搅拌至室温，得到第一包合反应溶液；
S23：将所述第一包合反应溶液于0-4℃下孵育12小时，进行包合反应；
S24：过滤，用石油醚从滤液萃取脂肪酸，得到所述不饱和脂肪酸样品。
在一个具体实施方案中，S3包括以下步骤：
S31：于60℃下配制0.1g/ml的尿素乙醇溶液；
S32：将所述尿素乙醇溶液加入装有所述不饱和脂肪酸样品的容器中，搅拌至室温，得到第二包合反应溶液；
S33：将所述第二包合反应溶液于-40--30℃下孵育12小时，进行包合反应；
S34：过滤，收集滤渣。
在一个具体实施方案中，S4包括以下步骤：
S41：将所述滤渣溶于乙醇溶液中，得到含有GLA和尿素的乙醇溶液；
S42：使用石油醚从所述含有GLA和尿素的乙醇溶液萃取，取石油醚层萃取物；
S43：用去离子水洗涤所述石油醚层萃取物后，干燥其中的水分，然后蒸干石油醚，得到GLA。
在一个优选实施方案中，S2中，所述游离脂肪酸样品与所述尿素乙醇溶液的重量体积比为0.2-0.4g/ml。
在一个优选实施方案中，S3中，所述不饱和脂肪酸样品与所述尿素乙醇溶液的重量体积比为0.05-0.1g/ml。
通过使用本发明的双重尿素包合法，可从原来GLA仅占15％油脂中提取纯度高达95％以上的GLA，实现了在低成本的条件下获得高纯度的GLA的目的。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.藻油
以下具体实施方式中使用的藻油为提取自栅藻的藻油，除了含有饱和脂肪酸外，还含有15％左右的GLA，并且还含有DHA、EPA。
2.游离脂肪酸样品的制备
将25g藻油加入250ml 0.5M的KOH甲醇溶液中，于55℃水浴下回流1h，至油滴消失，得到反应产物。加入20ml蒸馏水及100ml石油醚以萃取出不皂化物，静置分层。取下层溶液，滴加浓盐酸至≈1，分两次加入150ml石油醚，静置取醚层。将醚层旋蒸至无溶剂蒸出，得到游离脂肪酸，倒入磨口玻璃瓶中冷冻保存。
3.第一次尿素包合反应
取5g尿素于50ml乙醇中，60℃水浴加热搅拌至溶解。将上述实验中的游离脂肪酸于烧杯中(游离脂肪酸样品与尿素乙醇溶液的重量体积比为0.2-0.4g/ml)，将尿素乙醇溶液迅速加入含有游离脂肪酸的烧杯中，用玻璃棒搅拌直到室温，至入冰箱，在0-4℃下孵育12小时。后取出包合物，迅速抽滤，保留富集了不包合脂肪酸的滤液。将滤液蒸干，加入20ml水，滴加浓盐酸至pH为中性。加入20ml石油醚，静置分层，取醚层，用去离子水洗涤3次。5洗涤后的石油醚萃取物中加入无水硫酸钠，干燥5h，过滤、旋蒸得到多不饱和脂肪酸。通过液相色谱测定显示，GLA的含量为65％左右。
4.第二次尿素包合反应
取上述实验中的多不饱和脂肪酸于烧杯中，将尿素乙醇溶液迅速加入含有游离脂肪酸的烧杯中(多不饱和脂肪酸样品与尿素乙醇溶液的重量体积比为0.05-0.1g/ml)，用玻璃棒搅拌直到室温，冷却至-40--30℃下孵育20小时。过滤，取滤渣。将滤渣溶解于乙醇中，加入石油醚，静置分层，取醚层，用去离子水洗涤3次。5洗涤后的石油醚萃取物中加入无水硫酸钠，干燥5h，过滤、旋蒸得到多不饱和脂肪酸。通过液相色谱测定显示，GLA的含量为96.23％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。