一种有效抑制大曲中土味素形成的微生物菌剂的制作方法

本发明涉及一种有效抑制大曲中土味素形成的微生物菌剂，属于白酒酿造技术领域。

背景技术：

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，并深得消费者的喜爱。白酒香味成分复杂是众所周知的，每种白酒都是由几百种香味成分组分的集合体。而这些呈香物质的来源，与白酒的生产过程是离不开的。

土霉味物质土臭素(geosmin)，是白酒酿造或者大曲生产过程中存在的一种异味物质。在前期的研究中，已有报道从清香型白酒厂生产的大曲中筛选得到四株产geosmin的菌株，解决了清香型白酒中土霉味物质geosmin来源的问题。筛选得到的四株链霉菌可以作为模式菌，用于白酒生产中产geosmin菌株的检测及其产生机理的研究。

因此，开发一些能够抑制大曲中土味素形成的方法，对于提高白酒风味品质具有深远影响。

技术实现要素：

基于现有技术，本发明提供了一种能够有效抑制大曲中土味素形成的方法。本发明方法，通过使用组合菌剂，以方便有效地降低了大曲中土味素的含量，另一方面得到的大曲应用于白酒酿造时会白酒的风味成分、理化指标几无影响。

本发明的第一个目的是提供一种能够抑制土味素形成的微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有：发酵毕赤酵母、酿酒酵母、米曲霉、东方伊萨酵母、异常威克汉姆酵母、库德毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌。

在一种实施方式中，发酵毕赤酵母可以是cgmcc2.3679、cgmcc2.1838或cgmcc2.3995。

在一种实施方式中，酿酒酵母可以是cgmcc2.3852、cgmcc2.2679、cgmcc2.2078或cgmccm4744(已在申请公布号cn102226155a、申请公布日2011.10.26的专利申请文件中公开)。

在一种实施方式中，米曲霉可以是cgmcc3.4383、cgmcc3.2792或cgmcc3.765。

在一种实施方式中，东方伊萨酵母可以是cgmcc2.192、cgmcc2.2734或cgmccm4741。

在一种实施方式中，异常威克汉姆酵母可以是cgmccno.12416，已在申请公布号cn105861346a、申请公布日2016.08.17的专利申请文件中公开。

在一种实施方式中，库德毕赤酵母为cgmccno.12418，已在申请公布号cn105861345a、申请公布日2016.08.17的专利申请文件中公开。

在一种实施方式中，解淀粉芽孢杆菌可以是cgmccno.1.398、cgmccno.1.414或cgmccno.1.769。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂为发酵毕赤酵母cgmcc2.1838、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmccm4741、异常威克汉姆酵母cgmccno.12416、库德毕赤酵母cgmccno.12418、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.1.414。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂中各菌的含量依次为(10⁶～10¹⁰)cfu/g、(10⁶～10¹⁰)cfu/g、10⁶～10⁹个/g、(10⁶～10¹⁰)cfu/g、(10⁶～10¹⁰)cfu/g、(10⁶～10¹⁰)cfu/g、(10⁷～10⁹)cfu/g。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂是将各菌分别活化培养后，按照体积质量比为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)的比例混合得到的。

在一种实施方式中，酵母菌液制备方法：接一环酵母菌体于液体酵母菌剂培养基1或2中，30℃培养24h。其中液体酵母菌剂培养基1(g/l)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，蒸馏水配制，1×10⁵pa灭菌20min；液体酵母菌剂培养基2：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料选用高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮及其各种不同比例的混合配方制取液体种子培养基，制作方式为：原料样品经粉碎后，与水按1︰1～4(w/v)的比例混合后，蒸煮1～5h，冷却后加入糖化酶10～50单位/g原料，于40～80℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，调节。

在一种实施方式中，细菌菌剂的制作方法：接一环细菌菌体于液体细菌菌剂培养基1或2中，37℃培养24h。其中液体细菌菌剂培养基1(g/l)：牛肉膏5，蛋白胨10，nacl5，蒸馏水配制，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。液体细菌菌剂培养基2：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料选用高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮及其各种不同比例的混合配方制取液体种子培养基，制作方式为：原料样品经粉碎后，与水按1︰1～4(w/v)的比例混合后，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10～50单位/g原料，于40～80℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为10～15°bx，调节ph为4～7。液体细菌菌剂培养方法，。

在一种实施方式中，霉菌菌剂的制作方法：接一环霉菌菌体于固体霉菌菌剂培养基1或2中，30℃培养2～3h。其中固体霉菌菌剂培养基1：选用高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮及其各种不同比例的混合配方制取固体种子培养基，制作方式为：原料样品经粉碎后，与水w/v按1︰0.5～2的比例混合后，80～100℃蒸煮30min。固体霉菌菌剂培养基2：在新鲜酒糟加入0.1-1mol/lnaoh溶液调节酸度为0～5；

按照上述培养方法制作得到菌液或者菌剂，酵母总活菌数达到10⁶～10¹⁰cfu/g，细菌总活菌数达到10⁷－10⁹cfu/g，霉菌孢子总数10⁶～10⁹个/g。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂中还包括基质载体，比如小麦、大麦、高粱、麸皮等等。

本发明的第二个目的是提供所述微生物菌剂的应用。

在一种实施方式中，所述应用，是用于酿造技术领域中抑制土味素形成。

在一种实施方式中，所述应用是用于白酒酿造。

在一种实施方式中，所述应用是在白酒酿造过程中微生物菌剂。

在一种实施方式中，所述应用是在白酒大曲的制备原料中接种微生物菌剂进行大曲制备。

本发明的第三个目的是提供一种大曲的生产方法，所述方法是在白酒大曲的制备原料中接种微生物菌剂进行大曲制备。

在一种实施方式中，所述大曲为中高温大曲。

本发明的优点和效果：

本发明的微生物菌剂中，含有能够有效抑制产土味素的白色链霉菌菌株的抑制菌，有效地降低了大曲中土味素的形成；同时，这些抑制菌也是白酒生产过程中一些主要菌种，通过协同效应，有效地保证了大曲微生物的平衡，在不会对白酒生产产生不利影响，而且还能提高风味物质以及酒精产量。本发明的微生物菌剂，组分简单，配制简便，使用方法简单。

附图说明：

图1：土味素标准曲线；

图2：不同培养时期大曲中土味素含量；

图3：共培养示意图；

图4：试验曲块中土味素含量；其中同一培养天数下的柱状从左到右依次为实验组a、实验组b、空白。

具体实施方案

大曲中土味素的测定方法：

(1)样品处理：称取大曲样品10g于50ml离心管中，加入20ml煮沸10min的超纯水混匀，于30℃条件下超声30min，4000rpm离心10min,收集上清液。重复上述操作两次，加水量分别为10ml和5ml。收集3次超声后的上清液，混匀后备用。

分别取大曲的提取液8ml于顶空瓶，加入10μl浓度为4μg/ml的内标薄荷醇，使得终浓度为5μg/l，gc-ms分析检测。

(2)样品的检测：gc-ms检测条件:在60℃恒温萃取45分钟，样品通过上述气相毛细管柱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定。其中ms条件：ei电离源能量70ev，离子源温度：230℃，扫描离子范围30-350amu。检测获得质谱数据经过与nist05a.ldatabase(agilenttechnologiesinc.)进行比对。

(3)制备标准曲线

取土味素含量最低的培养阶段的大曲，制得大曲浸泡液。设置6个浓度梯度，分别为25μg/l、12.5μg/l、6.5μg/l、3.5μg/l、2μg/l、1μg/l，标样中分别加入10μl薄荷醇(终浓度5μg/l)和8ml大曲浸泡液，进行gc-ms检测，方法同(2)。

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1：不同时期传统凤香型大曲中土味素含量变化结果与分析

(1)通过gc-ms气质联用提特征离子112/95的方法检测样品中土味素含量，根据加入的土味素标准样出峰时间作为参照，确定土味素的保留时间在23.6min左右。加入的内标薄荷的保留时间19.7-19.8min左右。

以土味素和薄荷醇的峰面积比为横坐标s/s，以两者的浓度比c/c为纵坐标，制作标准曲线，得到拟合方程y＝0.3297x+0.2787，拟合系数r为0.9857。

土味素标准曲线如图1所示。

(2)如图2所示，为不同培养时期大曲中土味素含量

从图2可看出，大曲培养期间，土味素的含量在5μg/kg曲左右，曲皮中土味素含量略高于曲心，随着培养时间的延长，两者的土味素含量均呈现逐渐升高的趋势，以出房(30d)时期曲心中土味素含量达到最高。从出房到投产期间，曲皮中土味素含量不再呈大幅升高的趋势。刚入房的大曲曲皮微生物种类、数量均多于曲心，菌体代谢产物量多，因此入房初期的曲皮土味素含量会比曲心高，随着培养时间延长，微生物逐渐向曲心生长，土味素含量变化也符合微生物从曲皮到曲心生长的规律，入房25d后的曲心土味素含量明显高于曲皮，这是大曲后期曲皮中的水分减少，微生物生长集中至曲心，因此代谢产物在曲心中得到大量积累。

实施例2：产土味素菌株的筛选

(1)平板初筛

将大曲中分离纯化的菌种进行平板培养，培养结束后，由3位经过培训，熟知目的香气的闻香人员通过闻香检测，以闻香是否产生土霉味作为初筛依据。

(2)液体复筛

将初筛的菌株进行液体培养一周，发酵结束后，6000rpm离心15min，收集上清液。顶空固相微萃取(hs-spme-gc-ms)检测产物中的风味物质：20ml顶空瓶中加入8ml菌体发酵上清液，3gnacl，10μl4ppm的内标薄荷醇。gc条件：样品通过db-ffap(60m×0.25mm×0.25μm，j&wscientific)色谱柱进行分离，进样口温度250℃，载气he，流速2mlmin-1，不分流进样，程序升温为：50℃保持2min，以6℃min-1速率升温至230℃，并保持15min；ms条件：ei电离源，离子源温度230℃，电子能量70ev，扫描范围35.0～350.0amu。检测分析发酵产物中是否产生土味素。

(3)筛选结果

从大曲中筛选到的产土霉素菌株f5a-1菌落微小，表面白色粉末状，较干燥，在培养基上有浓烈的土霉气味。将分离得到的菌株f5a-1单菌落接种到ypd液体培养基上，30℃下培养48h后提取基因组。应用放线菌/链霉菌特异分类引物完成pcr反应。经凝胶电泳检测，克隆结果呈阳性。分子鉴定后，在ncbi上进行序列比对，其核酸序列与白色链霉菌相似度达到99％，结合碱性美兰染色法的显微镜观察，确定其为链霉菌属的白色链霉菌。

此外，在前期研究中，还得到了一株产土臭素的白色链霉菌lbg-fxj，保藏编号cgmccno.4206，已在cn102719375b中公开。

实施例3：产土味素菌株的抑制菌的效果确认

抑制菌与白色链霉菌f5a-1平板共培养：将液体培养好的各抑制菌的发酵液分别吸取100ul与100ul的白色链霉菌发酵液混合涂布平皿，30℃培养箱培养(如图3)。

空白对照1：分别吸取100ul的各抑制菌发酵液涂布平皿，30℃培养箱培养。

空白对照2：吸取100ul的白色链霉菌发酵液涂布于平皿上，30℃培养箱培养。

观察实验组与空白组，研究抑制菌抑菌情况。

结果如表1所示。采用白色链霉菌lbg-fxj替代f5a-1，结果类似。

表1菌株对传统凤型大曲中白色链霉菌的抑制

酿酒酵母在白酒发酵中起主要作用，主要代谢产生酒精，在酒醅发酵后期起主要作用。发酵毕赤酵母为白酒中既产生白酒香味物质又能够进行发酵的菌株，对白酒发酵中酯类产生具有一定贡献。异常威克汉姆酵母在白酒生产中既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求，特别是乙酸乙酯，兼具了酒精酵母和产酯酵母的双重特性。

实施例4：产土味素菌株的抑制菌的相互作用分析

(1)菌种的活化

将抑制菌(组合1：发酵毕赤酵母cgmcc2.1838、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmccm4741、库德毕赤酵母cgmccno.12418、枯草芽孢杆菌cgmcc1.629；组合2：发酵毕赤酵母cgmcc2.1838、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmccm4741、异常威克汉姆酵母cgmccno.12416、库德毕赤酵母cgmccno.12418、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.1.414)从甘油管转接至ypd培养基上，酵母30℃、芽孢杆菌37℃，培养箱培养。

(2)液体培养

将ypd平板上长好的菌株分别接至yped培养基中，酵母30℃、细菌37℃，200r/min条件下液体培养。

(3)单菌落的培养

将培养好的菌液进行稀释，酵母稀释10-3、10-4倍，细菌稀释10-6、10-7倍。将稀释液吸取100ul，涂布于ypd培养基上，酵母30℃、细菌37℃培养箱培养，至长出单菌落。

(4)抑制菌相互关系研究

将其中一株菌以适宜的浓度(可以覆盖培养基)接种于ypd培养基上，1h后接入另一株菌的单菌落的菌饼，共培养并观察有无抑制现象，每组两个平行试验。

结果显示，主要抑制剂之间相互没有抑制关系，可以相互组合。

实施例5：低土味素大曲的制备

设置两组抑制菌组合，组合1：抑制白色链霉菌f5a-1效果好，高产异戊醇；组合2：抑制白色链霉菌f5a-1效果较好，相对低产异戊醇、高产乙酸乙酯，且能够水解蛋白质和淀粉。

组合1：发酵毕赤酵母cgmcc2.1838、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmccm4741、库德毕赤酵母cgmccno.12418、枯草芽孢杆菌cgmcc1.629。

组合2：发酵毕赤酵母cgmcc2.1838、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmccm4741、异常威克汉姆酵母cgmccno.12416、库德毕赤酵母cgmccno.12418、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.1.414。

(1)抑制菌组合的发酵液配制

将以上各单菌株摇瓶培养或者制备孢子悬液，使其浓度达到10⁸～10⁹后停止培养，然后按照各菌按照等浓度混合，得到组合菌剂。

(2)白色链霉菌f5a-1孢子悬液的制备

将白色链霉菌f5a-1涂布于平板上培养，待长出孢子且较多时停止培养，将孢子从培养基表面轻轻刮于适量的无菌生理盐水中，混合均匀后用无菌脱脂棉塞住漏斗口进行过滤，得到孢子悬液，血球计数板计数，按表2进行稀释。

(3)制做试验曲块

按表2配菌液组合，然后与30g大曲原料及水，使得曲块含水量为43％，混合均匀后转入模型中，制作试验曲块。

表2抑制菌组合浓度配比

(4)试验曲块的培养

将制好的试验曲块放入铺有纱布的平皿中，盖上扎了孔的保鲜膜，置于培养箱进行模拟传统凤型大曲培养过程，适时调节温度及湿度，培养30天。

(5)取样

在曲块培养0、4、8、12、16、20、30天时取样，前20天每隔3天取一次样，后10天取一次样。每次取不同组合、不同浓度比例的曲块，2个平行。

(6)gc-ms检测大曲培养过程中土味素变化情况

①样品的处理

称取不同培养时期的试验曲10g于50ml离心管中，加入20ml煮沸10min的超纯水混匀，于30℃条件下超声30min，4000rpm离心10min,收集上清液。重复上述操作两次，加水量分别为10ml和5ml。收集3次超声后的上清液，混匀后备用。

②样品的检测

分别取不同培养时期试验曲的提取液8ml于顶空瓶，加3gnacl，10μl浓度为4μg/ml的内标薄荷醇，使得终浓度为5μg/l，gc-ms分析检测。

gc-ms检测条件:在60℃恒温萃取45分钟，样品通过上述气相毛细管柱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定。其中ms条件：ei电离源能量70ev，离子源温度：230℃，扫描离子范围30-350amu。检测获得质谱数据经过与nist05a.ldatabase(agilenttechnologiesinc.)进行比对。

结果如图4所示。由图4可以看出，白色链霉菌空白对照的曲块在培养过程中土味素含量逐渐升高，到后期趋于稳定，约14ug/kg。菌株组合1在大曲培养过程中土味素含量也是逐渐升高的，但在16天前比空白对照中土味素含量低很多，20天至30天阶段比对照稍低，约为13ug/kg。组合2中土味素含量呈现先增加后减少的趋势，在16天含量达到最高13.9ug/kg，20天至30天逐渐降低至9.2ug/kg。

由现有的数据可以看出，组合1和组合2均有抑制白色链霉菌的效果，不过相比之下，组合1最终降低土味素约7.14％，组合2最终降低土味素约34.28％，组合2比组合1的效果要好。

此外，发明人还大量实验了其他微生物组合，比如：

组合3：发酵毕赤酵母cgmcc2.3679、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.2792、东方伊萨酵母cgmcc2.192、异常威克汉姆酵母cgmccno.12416、库德毕赤酵母cgmccno.12418、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.1.398。结果显示，培养30d后最终降低了土味素24％左右。

组合4：发酵毕赤酵母cgmcc2.3995、酿酒酵母cgmccm4744、米曲霉cgmcc3.765、东方伊萨酵母cgmccm4741、异常威克汉姆酵母cgmccno.12416、库德毕赤酵母cgmccno.12418、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.1.769。结果显示，培养30d后最终降低了土味素15％左右。