检测IL7R基因全外显子的方法和引物与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与急性t淋巴细胞白血病有关的il7r基因突变的引物和方法。

背景技术：

小儿急性淋巴细胞性白血病(acutelymphoblasticleukemia,all)是最常见的儿童肿瘤性疾病，是指前体b、t或成熟b淋巴细胞发生克隆性异常增殖所致的恶性疾病，占儿童急性白血病的80％以上。小儿t细胞型急性淋巴细胞白血病(t-cellacutelymphoblasticleukemia,t-all)是一种高危型all，约占all的15％-25％，患儿复发率高，预后极差，严重影响患儿的生命健康。近年来的研究报道发现在儿童急性t淋巴细胞白血病中白介素7受体(interleukin-7receptor,il7r)基因突变的发生率高达10％以上，可能是影响小儿t-all发生发展的关键因素之一。

il7r属于ⅰ型细胞因子受体家族成员的跨膜受体，生理情况下是淋巴细胞增殖和分化过程中的必需因子。病理情况下，il7r与人类多种免疫性疾病有关，如il7r缺失会造成重症联合免疫缺陷病，il7r功能获得型突变可引起急性t淋巴细胞白血病等。il7r可通过jak通路及其下游转录因子stat5、ser激酶、pi3k等激活b细胞和t细胞发育中多种下游基因，并可能通过改变染色质结构促进基因重排，影响细胞外基质重塑、b细胞和t细胞的发育及内稳态。此外，il7r对胸腺t细胞发育、记忆性t细胞、初始性t细胞、辅助性t细胞的存活和增殖不可或缺，动物研究发现在il7r敲除小鼠中上调抗凋亡基因bcl-2的表达以抑制细胞凋亡，只对t细胞有效，但不能阻止早期b细胞的凋亡，这表明il7r对维持t细胞系的存活有重要意义。在小鼠和人类，il7或il7r缺失会导致t细胞发育和功能的严重缺陷。目前的研究发现在小儿t-all中il7r存在多个位点的突变，例如s185c、v253g及外显子的插入和缺失等，il7r的这些突变可通过il7r/jak通路影响小儿t-all的治疗，有研究报道il7r/jak轴的基因突变可削弱类固醇激素治疗的效果；也有报道指出jak抑制剂或可用于il7r/jak突变的t-all治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测il7r基因全外显子的引物，采用pcr技术，可用于快速检测急性t淋巴细胞白血病患者体内il7r基因突变情况。所述检测il7r基因全外显子突变情况的引物，包括：

扩增il7r基因全外显子的引物，其碱基序列为：

il7r-exon1-ftgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg

il7r-exon1-raacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg

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il7r-exon4-raacagctatgaccatgtgcctgatttgcctatgaaagtg

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il7r-exon5-raacagctatgaccatgctctcacttgctcccacactt

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il7r-exon6-raacagctatgaccatgactgtggaaattcgctgaggat

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il7r-exon7-raacagctatgaccatgggacctggaagaggagagaatag

il7r-exon8-ftgtaaaacgacggccagtcaagctagagatgaagtggaaggt

il7r-exon8-raacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt。

其中，引物序列il7r-exon1-f和il7r-exon1-r是扩增il7r基因第1外显子序列的引物，引物序列il7r-exon2-f和il7r-exon2-r是扩增il7r基因第2外显子序列的引物，以此类推，引物序列il7r-exon8-f和il7r-exon8-r是扩增il7r基因第8外显子序列的引物。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测il7r基因全外显子的测序引物碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

进一步地，引物序列il7r-exon1-f和il7r-exon1-r是扩增il7r基因第1外显子序列的引物，引物序列il7r-exon2-f和il7r-exon2-r是扩增il7r基因第2外显子序列的引物，以此类推，引物序列il7r-exon8-f和il7r-exon8-r是扩增il7r基因第8外显子序列的引物。

本发明还提供了检测凝血因子xi(f11)基因全外显子突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提骨髓或外周血中的基因组dna；

(2)用pcr扩增步骤1中提取的dna；

(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(4)将测序结果与标准序列进行比对，确定il7r基因是否发生突变。

其中pcr扩增引物为：

il7r-exon1-ftgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg

il7r-exon1-raacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg

il7r-exon2-ftgtaaaacgacggccagtgtctgccacagagtctgctatt

il7r-exon2-raacagctatgaccatggctgaaccgtgagaggagatt

il7r-exon3-ftgtaaaacgacggccagtttcctgaacatgcctccactc

il7r-exon3-raacagctatgaccatgtaacctacagaatgtccagacaca

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il7r-exon4-raacagctatgaccatgtgcctgatttgcctatgaaagtg

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il7r-exon8-ftgtaaaacgacggccagtcaagctagagatgaagtggaaggt

il7r-exon8-raacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

进一步地，pcr扩增方法采用touch-down扩增法。

本发明还提供了一种检测il7r基因多态突变位点的试剂盒，包括：

(i)全血基因组dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中pcr扩增反应液引物为：

扩增il7r基因全外显子的引物，其碱基序列为：

il7r-exon1-ftgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg

il7r-exon1-raacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg

il7r-exon2-ftgtaaaacgacggccagtgtctgccacagagtctgctatt

il7r-exon2-raacagctatgaccatggctgaaccgtgagaggagatt

il7r-exon3-ftgtaaaacgacggccagtttcctgaacatgcctccactc

il7r-exon3-raacagctatgaccatgtaacctacagaatgtccagacaca

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il7r-exon8-ftgtaaaacgacggccagtcaagctagagatgaagtggaaggt

il7r-exon8-raacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt。

进一步地，测序引物碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

有益效果：本发明设计了扩增il7r基因8个外显子序列的引物。通过加接头，使所有8对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。il7r基因的突变类型种类多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述il7r全部外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。本发明的8对引物涵盖了il7r基因全部外显子区域，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。

附图说明

图1-a为经il7r-exon1-f和il7r-exon1-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-b为经il7r-exon2-f和il7r-exon2-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-c为经il7r-exon3-f和il7r-exon3-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-d为经il7r-exon4-f和il7r-exon4-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-e为经il7r-exon5-f和il7r-exon5-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-f为经il7r-exon6-f和il7r-exon6-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-g为经il7r-exon7-f和il7r-exon7-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图1-h为经il7r-exon8-f和il7r-exon8-r扩增引物扩增的电泳图，m为markerdl2000，1-16为送检的临床样本，引物扩增有效，且条带单一。

图2为il7r基因部分野生型测序截图结果。其中(a)为第5外显子测序截图；(b)为第6外显子测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测il7r基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对il7r全外显子设计的扩增引物，包括：

扩增il7r基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：

il7r-exon1-ftgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg

il7r-exon1-raacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg

il7r-exon2-ftgtaaaacgacggccagtgtctgccacagagtctgctatt

il7r-exon2-raacagctatgaccatggctgaaccgtgagaggagatt

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il7r-exon3-raacagctatgaccatgtaacctacagaatgtccagacaca

il7r-exon4-ftgtaaaacgacggccagtctggagaatgcggactggat

il7r-exon4-raacagctatgaccatgtgcctgatttgcctatgaaagtg

il7r-exon5-ftgtaaaacgacggccagtcactctcctccttgaccactc

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il7r-exon7-ftgtaaaacgacggccagtaagactcagtgtgcctgtgc

il7r-exon7-raacagctatgaccatgggacctggaagaggagagaatag

il7r-exon8-ftgtaaaacgacggccagtcaagctagagatgaagtggaaggt

il7r-exon8-raacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt

一种检测il7r基因全外显子的试剂盒，包括

(i)基因组dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，基因组dna提取所用试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供；pcr扩增反应液所用kodfox由toyobo公司提供；引物由上海英潍捷基公司合成。

检测体系pcr扩增反应液包括：

pcr反应程序如下：

实施例2

骨髓/血液/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl骨髓或血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心去除管盖内的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30s，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12，000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μldna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)touch-downpcr扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

il7r-exon1-ftgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg

il7r-exon1-raacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg

il7r-exon2-ftgtaaaacgacggccagtgtctgccacagagtctgctatt

il7r-exon2-raacagctatgaccatggctgaaccgtgagaggagatt

il7r-exon3-ftgtaaaacgacggccagtttcctgaacatgcctccactc

il7r-exon3-raacagctatgaccatgtaacctacagaatgtccagacaca

il7r-exon4-ftgtaaaacgacggccagtctggagaatgcggactggat

il7r-exon4-raacagctatgaccatgtgcctgatttgcctatgaaagtg

il7r-exon5-ftgtaaaacgacggccagtcactctcctccttgaccactc

il7r-exon5-raacagctatgaccatgctctcacttgctcccacactt

il7r-exon6-ftgtaaaacgacggccagtcaaagcaccctgagaccctac

il7r-exon6-raacagctatgaccatgactgtggaaattcgctgaggat

il7r-exon7-ftgtaaaacgacggccagtaagactcagtgtgcctgtgc

il7r-exon7-raacagctatgaccatgggacctggaagaggagagaatag

il7r-exon8-ftgtaaaacgacggccagtcaagctagagatgaagtggaaggt

il7r-exon8-raacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，35min，凝胶成像系统观察。

如图1-a至图1-h所示，即为16例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。

(6)sanger测序：

取9pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与il7r基因参考序列(genbank：ng_009567.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取16例临床样本(按引物编号为ex1-ex8)，按实施例1和例2的试剂和方法提取基因组dna、配制试剂、扩增和测序。样本加入检测体系pcr反应液中1μl。电泳结果如图1-a至图1-h所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本的部分测序结果如图2所示：(a)显示是1号样本il7r基因第5号外显子野生型测序截图，说明样本的il7r第5号外显子未发生突变；(b)显示是1号样本il7r基因第6号外显子野生型测序截图，说明样本的il7r第6号外显子未发生突变；

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩增il7r基因全部外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增il7r基因全外显子，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110>福州艾迪康医学检验所有限公司

<120>检测il7r基因全外显子的方法和引物

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtaaaacgacggccagtggctctgtctcttcatgtccttg41

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacagctatgaccatgtgactcaggtctgttagggaactg40

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtaaaacgacggccagtgtctgccacagagtctgctatt40

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aacagctatgaccatggctgaaccgtgagaggagatt37

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgtaaaacgacggccagtttcctgaacatgcctccactc39

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aacagctatgaccatgtaacctacagaatgtccagacaca40

<210>7

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tgtaaaacgacggccagtctggagaatgcggactggat38

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aacagctatgaccatgtgcctgatttgcctatgaaagtg39

<210>9

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgtaaaacgacggccagtcactctcctccttgaccactc39

<210>10

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

aacagctatgaccatgctctcacttgctcccacactt37

<210>11

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tgtaaaacgacggccagtcaaagcaccctgagaccctac39

<210>12

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

aacagctatgaccatgactgtggaaattcgctgaggat38

<210>13

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tgtaaaacgacggccagtaagactcagtgtgcctgtgc38

<210>14

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

aacagctatgaccatgggacctggaagaggagagaatag39

<210>15

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

aacagctatgaccatgggacctggaagaggagagaatag39

<210>16

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

aacagctatgaccatgtcaggatggagtgagacaaggt38

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

tgtaaaacgacggccagt18

<210>18

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

aacagctatgaccatg16