本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种哈夫尼菌yybio-001及其制备方法、应用和菌剂。
背景技术：
食糖是国家重点保护的战略物质，甘蔗是我国最主要的产糖作物。探索对甘蔗生产有促进作用的新技术无疑对保障我国食用糖安全具有重大意义。高等植物体内常有内生微生物，其中一类内生菌具有生物固氮功能，可将空气中的氮气转化为氨，减轻植物对化学合成氮肥的依赖。虽然很多植物体内有内生固氮菌，但固氮效果强的只有含糖量高的甘蔗和甜菜，这是因为细菌固氮时需要植物提供充足的能量，蔗糖就是最合适的能量物质之一。
巴西种植甘蔗已有几十年甚至几百年的历史，蔗田施氮量一直不高但却能维持甘蔗持续高产，并且土壤氮储量也不下降，其中主要得益于甘蔗的生物固氮作用。debary于1886就发现植物内生菌，1977年bacon等人证实牛吃过量的高羊茅草后中毒是高羊茅的内生真菌引起，这引起了人们对内生菌研究的兴趣。大量研究表明，甘蔗体内有多种内生固氮菌，在适宜条件下这些固氮菌可在甘蔗根、茎、叶内进行固氮作用且不形成特异结构，为甘蔗生长提供氮源。70年代起，巴西、印度、南非、澳大利亚和中国等蔗糖生产大国对甘蔗联合固氮进行了大量研究。鉴于根际联合固氮受根际环境中其它微生物的干扰较大，固氮效果难以保证，因此科学家同时开展了对内生固氮菌的研究。由于生活在植株体内，几乎没有其它种类的微生物的干扰，内生固氮菌在植物体内通常能达到较高菌群密度，因此固氮效率远高于根际联合固氮。甘蔗是巴西的主要农作物，在巴西经济中占有重要地位，因此巴西有关甘蔗内生固氮菌的研究十分活跃。目前已有超过100种与甘蔗联合固氮的细菌被分离出来，它们的生理生化性状、固氮能力以及与甘蔗相互作用等方面都已做了系统的研究。甘蔗内生固氮菌gluconacetobacterdiatrophicuspal5的全基因组dna序列已于2009年发表，在此之前已有2种内生固氮菌的基因组序列被测定。由此可见国外对内生固氮菌研究的深度和广度。
植物内生固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，还同时具有分泌生长素、溶磷、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。因此，联合(内生)固氮菌是一类非常有发展前景的农业微生物资源，充分发挥联合固氮菌的固氮促生长性能，对农业可持续发展具有重要意义。目前已发现联合固氮菌的宿主植物大多为具有重要价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等不能自主固氮的禾本科植物。针对长期单一施用化学肥料带来的土壤肥力下降，农产品品质下降和农业环境污染加剧等一系列对农业可持续发展的负面影响，积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种具有高固氮效率的哈夫尼菌yybio-001。
本发明的哈夫尼菌yybio-001属于哈夫尼菌属(hafniasp.)细菌，该菌株于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14502。
本发明的哈夫尼菌yybio-001可用于固氮、产生固氮酶、促进植物生长以及制备相应的产品等。
本发明的另一个目的是提供一种生物菌剂，该生物菌剂的活性成分为所述的哈夫尼菌yybio-001cgmccno.14502。
该菌剂除包括含活性成分的哈夫尼菌yybio-001cgmccno.14502外，还可包括其他配合作用的菌株活性成分，和/或辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等，所述菌株活性成分可以为与哈夫尼菌具有配合作用的活性菌或活性菌的代谢产物。
本发明的另一个发明目的在于提供哈夫尼菌yybio-001的制备方法，所述哈夫尼菌yybio-001由甘蔗茎部或根部组织分离获得，通过无氮培养基分离筛选，根据其功能确定为甘蔗内生固氮菌，对其固氮酶活性测定、16srdna序列分析，确定其为哈夫尼菌。
本发明的有益效果在于：本发明的哈夫尼菌yybio-001形成菌剂或生物肥料等类型产品，可应用于作物或植物的苗期促生、提高固氮效率、协助生长，同时减少化肥等产品应用频率。
本发明的哈夫尼菌属(hafniasp.)细菌菌株哈夫尼菌yybio-001，保藏号cgmccno.145028，能显著促进植物生长并且提高固氮作用，协助植物利用氮源。实验证明，利用本发明所述菌株接种甘蔗组培苗50d后植株干重和总氮含量分别比空白对照增加了53.12％和40.06％，固氮效率为13.76％；接种菌株yybio-001的玉米幼苗地上部分和根部干重比对照分别增加70.4％和121.4％，株高比对照增加26.7％，叶绿素含量增加了34.5％，氮含量增加了33.3％。本发明所述的hafniasp.菌株具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用，可应用于生产具有促进植物育苗生长、提升固氮效率的固氮微生物菌剂和微生物肥料产品，对于减少化肥的使用、保护生态环境具有重要意义，并有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明菌株所形成的菌落图；
图2为本发明菌株的细胞形态图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例和附图1-2对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1：本发明菌株哈夫尼菌yybio-001的分离
取新鲜甘蔗蔗茎，挑选无虫洞节，将表皮在清水中洗净，于超净工作台上先以70％酒精擦试，将切茎用刀用无水酒精浸泡后在火焰上点燃，在蔗茎中间用刀环切约2mm深。用手将蔗茎折断，以无菌切刀选取无刀痕处，取0.5-1g甘蔗茎样品，以止血钳挤压出甘蔗茎组织液，取其进行10倍系列稀释，分别取原液和稀释液100μl，涂布于lpi无氮培养基(培养基成份：k2hpo40.2g，kh2po40.6g，mgso4·7h2o0.2g，cacl2·2h2o0.02g，namoo4·2h2o0.002g，fecl3·6h2o0.01g，蔗糖100g，蒸馏水1000ml，琼脂15g)平板上，28℃培养3d，形成透明、凸起、表面光滑、边缘整齐菌落，菌株细胞呈杆状。所形成菌落及细胞性状具体见附图1及附图2。菌落长出后，在lpi无氮培养平板上用划线法进行菌种纯化，并通过镜检检查。纯化完成后制备成甘油管于超低温冰箱进行保存。
实施例2：本发明菌株哈夫尼菌yybio-001的固氮酶活性
采用乙炔还原乙烯法(acetylenereductionassay，ara)测定固氮酶活性。将yybio-001活化后在lpi液体培养基中生长72h(3d)，取1ml菌液接种于灭菌的含10mllpi液体培养基的60ml磨口小口瓶中，培养24h后从瓶内抽出5ml气体，然后再注入5ml乙炔气体，继续培养24h，用气相色谱仪检测乙烯生成量，以nmolc2h4/h·ml表示固氮酶活性。以模式菌株巴西甘蔗内生固氮菌g.diazotrophicuspal5为阳性对照，以接种1ml灭活菌液的处理作为空白对照。
实验结果表明，本发明菌株的固氮酶的乙炔还原乙烯活性约为2541nmolc2h4/h，而阳性对照巴西甘蔗内生固氮菌模式菌株g.diazotrophicuspal5的固氮酶活性1675nmolc2h4/h。本发明菌株yybio-001整体固氮酶活性相比应用模式菌株高约51.7％。
实施例3：本发明菌株哈夫尼菌yybio-001的形态学分析及biolog鉴定
通过实施例1的方法完成分离纯化本发明菌株yybio-001，接种获得纯培养斜面试管。分离纯化及纯培养中对菌落进行观察，可见透明、凸起、表面光滑、边缘整齐菌落。利用革兰氏染液对菌体进行染色，并应用显微镜进行观察，可见菌株革兰氏染色呈阴性，细胞形态为杆状。应用本菌株纯培养接种至液体lpi培养基，28℃下培养3d，随后对发酵液离心处理，并以无菌生理盐水清洗菌体，获得菌悬液。通过biolog进行生理生化特征测试及鉴定。所述菌株yybio-001的生理生化特征测定结果如表1所示：
表1甘蔗内生固氮菌yybio-001的形态和理化实验结果
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例4：本发明菌株哈夫尼菌yybio-001的16srdna序列同源性分析常规方法培养分离纯化的本发明菌株yybio-001，获得纯培养斜面试管，送测序机构进行测序。dna测序、序列拼接由中国科学院微生物研究所完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。本发明菌株yybio-001的16srdna的序列详见序列表中序列1。根据序列及比对结果，最终确定该菌株为哈夫尼菌。
实施例5：用salkowski比色法测定yybio-001菌株分泌iaa的能力
采用比色法测定根瘤菌分泌植物生长素(iaa)的能力，测定培养基采用lpi培养基。
配制s1比色液：将4.5gfecl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％h2so4，待冷却后定容至1l；
配置s2比色液：将4.5gfecl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％h2so4和10mgiaa，待冷却后定容至1l；
配置s3比色液：将4.5gfecl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％h2so4和30mgiaa，待冷却后定容至1l；
配置s4比色液：将4.5gfecl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％h2so4和50mgiaa，待冷却后定容至1l；
将菌株接种于盛有50ml培养基的三角瓶中，置于转速125rpm/min，温度28℃的摇床培养，3次重复，培养12d后，取根瘤菌悬浮液100μl置于白色塑料比色板上，加100μl的s1比色液，15min后观察颜色变化。粉红色为阳性，表示菌株能够分泌iaa，粉红色颜色越深表示分泌iaa能力越大；无色为阴性，表示菌株不能分泌iaa。以s2、s3、s4比色液作阳性对照进行粉红色颜色深度的比较。结果表明，所述哈夫尼菌yybio-001的比色反应为粉红色，且粉红色深度介于两个阳性对照s3和s4之间，说明哈夫尼菌yybio-001分泌iaa的量介于30～50mg/l之间。
实施例6：本发明菌株哈夫尼菌yybio-001的接种促生效应试验
1、哈夫尼菌yybio-001对玉米幼苗的促进作用
将菌株yybio-001活化后在lpi液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2×108个细胞作为接种菌悬液。取大小均匀的玉米种子在2％naclo中浸泡30min，用无菌水洗数次至无naclo残留，置无菌培养皿内30℃下浸泡吸胀1d，倒去多余的水，再置于30℃下催芽。种子露白后播于无菌珍珠岩基质中发芽，当第二片真叶完全展开时蘸秧根并移栽(具体方法为：选取大小一致的秧苗置于菌株yybio-001菌悬液中，对照置于无菌水中浸根，分别浸泡20min后移栽)。将浸泡后的小苗移栽到装有灭菌蛭石的盆中(每盆加定量hoagland营养液)，每盆1株，各处理重复8盆。7d后再用同样浓度的菌株yybio-001菌悬液灌根接种1次(对照接等量无菌水)。30d后对玉米的生长情况进行记录、拍照和测定以下各项生理指标：株高、叶绿素含量、总氮含量和干物质积累(干重)。
接种试验测定结果见表2。菌株yybio-001对玉米具有显著的促生作用，主要表现在植物的干物质积累(干重)增加十分显著，增长率分别为：地上部分干重比对照增加70.4％，根部干重增加121.4％；接种菌株的玉米幼苗株高比对照增加26.7％，叶绿素含量增加了34.5％，含氮量增加了33.3％。
表2本发明菌株对玉米幼苗的接种效应
2、哈夫尼菌yybio-001对甘蔗组培苗的促进作用
供试菌株分别为yybio-001以及巴西甘蔗内生固氮菌g.diazotrophicuspal5菌株。以蛭石甘蔗组培苗移栽后的栽培基质，按比例每kg基质加入10mg(15nh4)2so4(15n原子百分超10.11％)，分装到塑料盆中。
将供试菌株分别活化后在lpi液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2×108个细胞。将炼苗后生长一致的甘蔗组培苗移栽到装有栽培基质的塑料盆中，每盆浇入上述供试菌株yybio-001的菌悬液100ml，置于28℃、光周期14h光-10h暗光照培养箱培养。10d后再以100ml同样浓度的菌悬液灌根接种，继续在限菌条件下培养。以接种等量同样浓度的pal5菌株菌悬液为阳性对照，空白对照接种等量无菌水。50d后对甘蔗组培苗的生长情况进行记录，收获植株并洗净栽培基质，冷冻干燥后测定植株干重、含氮量及15n含量，计算固氮效率。固氮效率根据公式ndfa＝100×[1-(atom％15n接种植株/atom％15n对照植株)]计算。
试验测定结果见表3：接种yybio-001能显著促进甘蔗组培苗的生长，甘蔗组培苗的干重和总氮含量分别比空白对照增加了53.12％和40.06％，植株从空气中获得氮的百分率(固氮效率)平均为13.76％；而接种pal5菌株的甘蔗组培苗的干重总氮含量增长率分别为28.12％和35.73％，固氮效率为11.93％。
表3本发明菌株对甘蔗组培苗的促进作用
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
<110>湖南豫园生物科技股份有限公司
<120>一种哈夫尼菌yybio-001及其制备方法、应用和菌剂
<160>1
<210>1
<211>1378
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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