一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法。
背景技术：
：长期以来，饲料中添加抗生素类促生长剂给人类提供了大量而经济的畜禽产品，但也产生了耐药性和残留问题，严重影响到生态环境和食品安全。当前饲料业和养殖业发展中面临的一个重要难题是如何在不影响饲料产品应用效果和猪禽养殖生产效率的同时，减少饲料中抗生素的使用。寻找安全高效的饲料添加剂来替代饲用抗生素，是我国饲料业和养殖业迫切需要解决的重大科技问题。当前，饲料添加剂便捷的筛选方法比较缺乏，经常出现候选营养物质未经筛选就直接进行动物试验的情况，往往因试验效果不佳，造成人力物力的极大浪费。传统的筛选方法有体外抑菌试验、体外细胞生长试验等，缺乏实时监测和细胞相关功能的分析，不能准确评定候选营养物质的效果。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法，旨在提供一种对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法。为实现上述目的，本发明提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法，包括如下步骤：体外培养猪小肠细胞ipec-1；在猪小肠细胞ipec-1的培养基中添加候选营养物质，并观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标；根据细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标，从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。优选的，所述在猪小肠细胞ipec－1的培养基中添加候选营养物质，并观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标的步骤，具体包括如下步骤：在载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测细胞生长状态；在载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标。优选的，所述在载有猪小肠细胞系ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测细胞生长状态的步骤，具体包括如下步骤：将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液；在孔板的每孔中加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养；在每孔内加入所述细胞悬液进行培养，并观测细胞生长状态；在每孔内加入含候选营养物质的基础培养基进行培养，并观测细胞生长状态。优选的，所述将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液的步骤，具体包括：将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散；再加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；对终止消化后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基在室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟；将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除；用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液。优选的，所述在孔板的每孔中加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养的步骤，具体包括：在孔板的每孔中加入150μl含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，培养12h。优选的，所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养，并实时观测细胞生长状态的步骤中，所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养具体包括：在每孔内加入300μl所述细胞悬液进行培养，培养24h。优选的，所述在载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标的步骤，具体包括如下步骤：将猪小肠细胞的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液；在孔板的每孔中加入所述细胞悬液进行培养，确保猪小肠细胞ipec-1贴壁；在孔板的每孔吸出部分培养基并加入ph为7.4的检测液进行培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；加入候选营养物质培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；加入寡霉素a培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；加入解偶联剂fccp培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；加入鱼藤酮/抗霉素a培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；计算细胞线粒体呼吸功能指标值。优选的，所述将猪小肠细胞的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液的步骤，具体包括：将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散；再加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；对终止消化后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基在室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟；将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除；用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液。优选的，所述在孔板的每孔吸出部分培养基并加入ph为7.4的检测液进行培养，检测此时猪小肠细胞系ipec－1的呼吸耗养率的步骤中，所述检测液为含5mm葡萄糖、0mm谷氨酰胺、0mm丙酮酸钠的基础培养基。优选的，所述计算细胞线粒体呼吸功能指标值的步骤中，计算方法包括：基础呼吸率ocr＝加入候选营养物质后ocr的平均值；atp产生＝基础呼吸率ocr－加入寡霉素a后的ocr平均值；质子漏＝加入寡霉素a后的ocr平均值－加入鱼藤酮/抗霉素a后的ocr平均值；最大呼吸率＝加入fccp后的ocr平均值；备用呼吸率＝最大呼吸率ocr平均值－基础呼吸率ocr平均值。本发明提供的一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法，具有以下优点：通过体外培养猪小肠细胞ipec-1，监测猪小肠细胞ipec-1实时生长数据和线粒体呼吸功能，建立一种促进仔猪肠道细胞生长、改善肠道细胞线粒体呼吸功能的功能性饲料添加剂方法；对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法，具有速度快、准确性高、重复性好等特点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为实施例1中谷氨酰胺(gln)对猪小肠细胞ipec-1生长影响的实时分析结果图；图2为实施例2中谷氨酰胺(gln)对猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能的影响的分析结果图；图3为实施例1中链脂肪酸酯对猪小肠细胞ipec-1生长影响的实时分析结果图；图4为实施例2中链脂肪酸酯对猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能的影响的分析结果图。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法，所述仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法包括如下步骤：步骤s100，体外培养猪小肠细胞ipec-1。小肠上皮细胞(intestinalepithelialcells)是肠道主要的功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应，并与肠道的内、外分泌功能密切相关，机体内增殖最快的组织之一。本发明通过体外培养猪小肠细胞ipec-1来筛选对仔猪肠上皮细胞增殖作用效果好的饲料添加剂。步骤s200，在猪小肠细胞ipec-1的培养基中添加候选营养物质，并观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标；在具体实施时，所述步骤s200包括如下步骤：步骤s210，在载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测细胞生长状态。步骤s220，在载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中，加入候选营养物质培养，观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标。可选的，所述步骤s210包括如下步骤：步骤s211，将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液；步骤s212，在孔板的每孔中加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养；在具体实施时，所述步骤s212具体包括：在孔板的每孔中加入150μl含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，培养12h。步骤s213，在每孔内加入所述细胞悬液进行培养，并观测细胞生长状态；在具体实施时，所述步骤s213中所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养具体包括：在每孔内加入300μl所述细胞悬液进行培养，培养24h。步骤s214，在每孔内加入含候选营养物质的基础培养基进行培养，并观测细胞生长状态。具体的，步骤s211包括如下步骤：将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散；再加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；对终止消化后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基在室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟；将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除；用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液。可选的，所述步骤s220包括如下步骤：步骤s221，将猪小肠细胞的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液；步骤s222，在孔板的每孔中加入所述细胞悬液进行培养，确保猪小肠细胞ipec-1贴壁；步骤s223，在孔板的每孔吸出部分培养基并加入ph为7.4的检测液进行培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；所述步骤s223中ph为7.4的检测液为含5mm葡萄糖、0mm谷氨酰胺、0mm丙酮酸钠的基础培养基。步骤s224，加入候选营养物质培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；步骤s225，加入寡霉素a培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；步骤s226，加入解偶联剂fccp培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；步骤s227，加入鱼藤酮/抗霉素a培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；步骤s228，计算细胞线粒体呼吸功能指标值。其中，在具体实施时，所述步骤s221具体包括：将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散；再加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；对终止消化后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基在室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟；将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除；用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液。在具体实施时，所述步骤s228计算细胞线粒体呼吸功能指标值的步骤中，计算方法包括：基础呼吸率ocr＝加入候选营养物质后ocr的平均值；atp产生＝基础呼吸率ocr－加入寡霉素a后的ocr平均值；质子漏＝加入寡霉素a后的ocr平均值－加入鱼藤酮/抗霉素a后的ocr平均值；最大呼吸率＝加入fccp后的ocr平均值；备用呼吸率＝最大呼吸率ocr平均值－基础呼吸率ocr平均值。步骤s300，根据细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标，从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1实时监测猪小肠细胞ipec－1生长本实施例中，所有液体均通过0.2μm过滤器进行除菌。(1)体外培养猪小肠细胞ipec-1。(2)前期准备：将75cm2培养瓶中生长丰度为80％的ipec-1细胞用10mlpbs(phosphatebufferedsolution)即磷酸盐缓冲液洗2次，加入200μl胰蛋白酶trypsin(parenzyme)进行消化，消化时间5分钟，利用显微镜下观测细胞状态，消化至细胞分散，然后用10ml含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基转移至15ml离心管中，室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟。将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除，再次加入向离心管中加入1ml含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，混匀，测定培养基中猪小肠细胞ipec-1浓度，将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液。(3)使用实时细胞分析仪监测猪小肠细胞ipec-1生长：在孔板上确定对照组和处理组(加候选营养物质)对应的孔；在孔板对照组和处理组的每孔中加入150μl含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养，培养12h，观测每孔数据基线是否平稳；在对照组和处理组的每孔内加入300μl所述细胞悬液进行培养，培养24h，即每孔有3×104个猪小肠细胞ipec-1，培养24h，显微镜下观察细胞状态；对照组和处理组的每孔用450μlpbs洗2次后，向对照组对应的每孔加入450μl对照组培养液或向处理组对应的每孔内加入450μl含候选营养物质的基础培养液，培养96h。其中，该基础培养液中含生理水平的氨基酸、矿物元素、维生素、葡萄糖等。(4)获取显微镜观测的每孔的细胞生长数据与图像，进行分析比较。本发明提供的一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法，具有以下优点：通过体外培养猪小肠细胞ipec-1，监测猪小肠细胞ipec-1实时生长数据和线粒体呼吸功能，建立一种促进仔猪肠道细胞生长、改善肠道细胞线粒体呼吸功能的功能性饲料添加剂方法；对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法，具有速度快、准确性高、重复性好等特点。实施例2测定猪小肠细胞ipec－1线粒体呼吸功能(1)体外培养猪小肠细胞ipec-1。(2)前期准备：将75cm2培养瓶中生长丰度为80％-90％的ipec-1细胞用10mlpbs(phosphatebufferedsolution)即磷酸盐缓冲液洗2次，加入200μl胰蛋白酶trypsin(parenzyme)进行消化，消化时间5分钟，利用显微镜下观测细胞状态，消化至细胞分散，然后用10ml含10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化；将载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基转移至15ml离心管中，室温下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为5分钟。将离心后的载有猪小肠细胞ipec-1的dmem/f12培养基中的上清液吸除，再次加入向离心管中加入1ml含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，混匀，测定培养基中猪小肠细胞ipec-1浓度，将猪小肠细胞ipec-1的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液。(3)使用生物能量测定仪检测猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能：在孔板上确定对照组和处理组(加候选营养物质)对应的孔；在孔板对照组和处理组的每孔中加入1ml猪小肠细胞ipec-1(每孔1.2×105个猪小肠细胞ipec-1)，培养12h，确保猪小肠细胞ipec-1贴壁；用显微镜观察细胞状态，在孔板的每孔吸出部分出950μl培养基并加入ph为7.4的检测液进行培养，检测此时猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr；其中，ph为7.4的检测液为含5mm葡萄糖、0mm谷氨酰胺(gln)、0mm丙酮酸钠的基础培养液(成分如表1)，调整ph为7.4；用1ml检测液洗猪小肠细胞ipec-1两次，加入500μl检测液，用一次性注射器针头刺破孔中的气泡，培养24min，每隔8min检测一次猪小肠细胞ipec-1的呼吸耗氧率(oxygenconsumptionrate，ocr)，检测3次；在处理组对应的每孔中加入候选营养物质培养，培养48min，每隔8min检测一次猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr，检测6次；加入寡霉素a(1μm)培养，培养24min，每隔8min检测一次猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr，检测3次；加入解偶联剂fccp(1μm)培养，培养24min，每隔8min检测一次猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr，检测3次；加入鱼藤酮/抗霉素a(0.5μm)培养，培养24min，每隔8min检测一次猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗养率ocr，检测3次；计算细胞线粒体呼吸功能指标值。(4)分析比较对照组与处理组细胞线粒体呼吸功能指标，确定促进猪小肠细胞ipec-1生长、改善线粒体呼吸功能的饲料添加剂。表1基础培养基组成成分g/lcacl2·2h2o0.265fe(no3)3·9h2o0.0001mgso40.0978kcl0.400nahco33.700nacl6.400nah2po40.109l-arginine·hcl0.021l-cystine·2hcl0.024glycine0.019l-histidine·hcl·h2o(100μm)0.021l-isoleucine0.020l-leucine0.026l-lysine·hcl0.036l-methionine0.012l-phenylalanine0.017l-proline0.023l-serine0.021l-threonine0.016l-tryptophan0.020l-tyrosine·2na·2h2o0.026l-valine(250μm)0.030cholinechloride0.004folicacid0.004myo-inositol0.0072niacinamide0.004d-pantothenicacid·1/2ca0.004pyridoxine·hcl0.004riboflavin0.0004thiamine·hcl0.004d-glucose0.900phenolred·na0.003例1实施例1和实施例2以谷氨酰胺(gln)为例，作为功能性饲料添加剂的候选营养物质，来做具体分析。如图1所示，分为三组0mmgln组(对照组)、0.5mmgln组(处理组)、2mmgln组(处理组)，由图1可以看出，加入不同浓度的gln后，猪小肠细胞ipec-1的活力、数量显著提高，特别是2mmgln组比0.5mmgln组促进细胞生长、增强细胞活力的效果更好；如图2所示，分为2组对照组(0mmgln组)和处理组(2mmgln组)，从图2中可以看出，检测液中添加2mmgln后猪小肠细胞系ipec-1的呼吸耗氧率ocr很快提高(＜8min)，经过上述计算式计算细胞线粒体呼吸功能指标值的结果，如表2所示。从表2可以看出，处理组(2.0mmgln组)的猪小肠细胞ipec-1的基础呼吸率、atp生成(p＜0.05)以及最大呼吸率(p＜0.05)相较于对照组(0mmgln组)的猪小肠细胞ipec-1的基础呼吸率、atp生成以及最大呼吸率显著增加，表明添加2mmgln后猪小肠细胞ipec-1线粒体的呼吸功能得到显著改善。结合实施例1添加2mmgln作为候选营养物质促进细胞生长、增强细胞活力的效果好，而实施例2中添加2mmgln作为候选营养物质后猪小肠细胞ipec-1线粒体的呼吸功能得到显著改善，可以确定gln可作为一种功能性饲料添加剂。表2猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能指标值的计算结果1其中，注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。例2实施例1和实施例2以短链脂肪酸酯(三乳酸甘油酯、三己酸甘油酯、三丁酸甘油酯)为例，作为功能性饲料添加剂的候选营养物质，来做具体分析。如图3所示，研究短链脂肪酸酯对猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能的影响，分为四组00.5mm三乳酸甘油酯组(对照组)、0.5mm三己酸甘油酯组、0.5mm三丁酸甘油酯组，由图3可以看出，三乳酸甘油酯或三己酸甘油酯酯60h后，猪小肠细胞ipec-1的活力、数量均比对照组提高。加入三丁酸甘油酯可促进细胞生长，培养96h时效果最好，但随后三丁酸甘油酯对细胞生长的促进作用开始降低。从图4可以看出，检测液中添加三乳酸甘油酯和三丁酸甘油酯对ipec细胞的基础耗氧率(ocr值)有提高作用。经过统计分析后，线粒体功能指标的结果如表3。从表3中可以看出，与对照组相比，三乳酸甘油酯或三丁酸甘油酯均可提高对ipec细胞的基础呼吸率、atp生成、最大呼吸率、备用呼吸率、质子漏等指标(p<0.05)。与对照组相比，三己酸甘油酯可以提高细胞的最大呼吸率和备用呼吸率(p<0.05)，而对其他线粒体呼吸功能指标却没有影响(p>0.05)。因此，三乳酸甘油酯或三丁酸甘油酯可以显著改善肠道细胞线粒体的呼吸功能。结合实施例1中三乳酸甘油酯、三丁酸甘油酯以及三己酸甘油酯酯均可以促进细胞生长，而实施例2中三乳酸甘油酯或三丁酸甘油酯可以显著改善肠道细胞线粒体的呼吸功能，故，可以确定三乳酸甘油酯和三丁酸甘油酯可均作为一种功能性饲料添加剂。表2猪小肠细胞ipec-1线粒体呼吸功能指标值的计算结果2其中，注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。本发明通过体外培养猪小肠细胞ipec-1，监测猪小肠细胞ipec-1实时生长数据和线粒体呼吸功能，建立一种促进仔猪肠道细胞生长、改善肠道细胞线粒体呼吸功能的功能性饲料添加剂方法；对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法，具有速度快、准确性高、重复性好等特点。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12