本发明涉及具有抗炎症活性的肽及其用途。
背景技术：
当组织或细胞受到损伤或被外部感染源(如细菌、霉菌、病毒及各种过敏诱发物质)感染时，炎症反应与局部血管和体液中的各种炎症介质和免疫细胞有关而呈现的酶激活、炎性介质物质分泌、体液浸润、细胞移动、组织破坏等一联的复合性生理反应和红斑、水肿、发热及疼症等外部症状。具体地，若外部细菌侵入特定组织而增殖，则生物体内的白细胞认知其来对所增殖的外部细菌活跃地进行攻击，在上述过程中产生的白细胞的死骸堆积在由菌受到侵入的组织，同时由白细胞凋亡的侵入菌的细胞破坏胃向受到侵入的组织内溶解，从而形成脓肿。在正常的情况下，炎症反应起到去除外部感染源，并且通过使损伤的组织再生，来起到生命体功能恢复作用，但是若未去除抗原或内部物质成为原因，来炎症反应过度或持续地发生，则作为威胁人体的生命的疾病呈现如急性炎症、类风湿关节炎等在关节内的疾病、以牛皮藓等的形态呈现的皮肤疾病及如支气管哮喘等的过敏性炎症疾病等，并且在输血、药物给药、器官移植等治疗过程中还成为障碍因素。肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α)为借助在对于细菌感染及肿瘤疾病的宿主免疫反应过程中被激活的巨噬细胞及多种细胞生成的细胞因子。上述细胞因子还是炎症反应的重要介质，上述细胞因子为在如类风湿性关节炎(ra)、银屑病关节炎、克罗恩氏病、银屑病、强直性脊柱炎(as)的炎症性疾病中担当重要因素的炎性细胞因子。例如，在类风湿性关节炎中，肿瘤坏死因子-α使滑膜炎持续并持续破坏骨和软骨。因此，需要抑制肿瘤坏死因子-α的特异性生物活性，因而，以将组织肿瘤坏死因子-α所参与的细胞反应并通过调节炎症前细胞因子的活性和通过肿瘤坏死因子-α调节的过程为目的，正在开发用于抑制肿瘤坏死因子-α的多种生物学制剂。目前，作为炎症治疗剂有利用肾上腺皮质激素的地塞米松、可的松等。虽然它们作为炎症治疗剂起到作用，但是毒性强，作为副作用还引起浮肿等症状。并且，针对于炎症原因不能选择性地起到作用，从而还存在诱发严重的免疫抑制的问题(checkw.a.andkalinerm.a.，am.rev.respir.dis.，141，p44～51.1990)。并且，现存的作为利用作为抗炎症剂的肾上腺皮质激素成分的类固醇药剂呈现如浮肿等严重的副作用，因而当前急需开发无副作用的非类固醇成分的药剂。本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的
技术领域：
的水平及本发明的内容。技术实现要素：要解决的问题本发明人努力开发生物学上具有有效的活性的优秀肽，结果，查明了由选自序列1或序列2及序列3的的氨基酸序列中的一种氨基酸序列组成的肽呈现抗炎症活性，由此完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供具有抗炎症活性的肽。本发明的另一目的在于提供抗炎用组合物。本发明的其他目的及优点通过以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图变得更加明确。解决问题的方案根据本发明的一实施方式，提供由序列1、序列2或序列3组成的具有抗炎症活性的肽。本发明人努力开发生物学上具有有效的活性的优秀的肽，结果，阐明了由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽呈现抗炎症活性。本发明的肽包含序列1、序列2或序列3的氨基酸序列，例如，可以由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成。作为细菌性内毒素的脂多糖(lps，lipopolysaccharide)在巨噬细胞中促进如诱导型一氧化氮合酶(inos)、环氧化酶-2(cox-2)、肿瘤坏死因子-α、细胞内活性氧及多种白细胞介素等炎症因子的生成(hinz，b.，brune，k.cyclooxygenase-2--10yearslater.jpharmacolexpther300(2)：367-375，2002.，在小鼠巨噬细胞中，血竭的抗氧化及抗炎症效果。大韩本草学会志23(2)：179-192，2008.)。因此，视为用于抑制通过脂多糖生成的炎症因子的物质可有效地使用于与巨噬细胞的活性相关的多种炎症疾病的治疗。根据本发明，由本发明的序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽抑制炎性细胞因子的表达，抑制作为与炎症相关因子的环氧化酶-2的表达，使活性氧的生成减少，抑制t细胞的激活，从而最终抑制炎症反应。根据本发明的一实例，由本发明的序列表的序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽抑制作为炎性细胞因子的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-2(il-2)、干扰素-γ(ifn-γ)、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-18(il-18)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(gm-csf)、干扰素-α(ifn-α)的表达。更优选地，本发明的肽抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-2、干扰素-γ的表达。根据本发明的另一实例本发明的肽通过刺激前列腺素(prostaglandin)的生物合成，来抑制作为对炎症反应调节起到重要的作用的酶的环氧化酶-2的表达。环氧化酶-2在正常状态下几乎未表达，通过炎症因子、细胞因子、内毒素、致瘤基因等丝裂原刺激快速表达。根据本发明的另一实例本发明的肽使在炎症反应中作为重要的因子的活性氧(ros，reactiveoxygenspecies)的生成减少。存在于细胞内的线粒体、黄嘌呤氧化酶(xod，过氧化物酶体(peroxisome)，xanthineoxidase)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化酶及cox等的酶持续生成活性氧，当进行炎症反应时，因中性粒细胞及其它免疫细胞的免疫反应大量生成活性氮(rns，reactivenitrogenspecies)，此时还同时生成活性氧(delanty，n.，dichter，m.a.oxidativeinjuryinthenervoussystem.actaneurolscand98：145-153，1998.，brune，b.，zhou，j.，vonknethen，a.nitricoxide，oxidativestress，andapoptosis.kidneyintsuppl84：22-24，2003.)。炎症反应以用于减少生物体内的恢复体系的增强及损伤的一联的活性机制，通过非常复杂的机制得到调节。重要的是若因反复的组织的损伤或再生炎症反应持续，则在与炎症相关的细胞中过多生成活性氧和活性氮，其结果引起永久性的基因的变形，从而诱发病态(kaplanski，g.，etal.，il-6：aregulatorofthetransitionfromneutrophiltomonocyterecruitmentduringinflammation.trendsimmunol24(1)：25-29，2003.)。根据本发明的另一实例，本发明的肽抑制t细胞的激活。本发明的肽在利用脂多糖诱导炎症反映的细胞中，抑制作为t细胞活性表达标记的cd3及cd25的表达。根据本发明的另一实例本发明的肽抑制炎症细胞增殖。在本说明书中，术语“肽”是指由肽键氨基酸残基相互结合而形成的线性分子。可通过本领域的公知的化学合成方法，尤其通过固相合成技术(solid-phasesynthesistechniques；merrifield，j.amer.chem.soc.85：2149-54(1963)；stewart，etal.，solidphasepeptidesynthesis，2nd.ed.，piercechem.co.：rockford，111(1984))或液相合成技术(us授权专利第5516891号)制备本发明的肽。根据本发明的一实例，上述肽的n-或c-末端可结合有选自乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基及硬脂酰基及聚乙二醇(peg)中的一种以上的保护基。上述肽的变形起到大大地改善本发明的肽的稳定性的作用。在本说明书中术语“稳定性”是不仅指体内稳定性而且还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。本发明的另一实施方式提供包含选自由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分的抗炎症用组合物。上述抗炎症用组合物包含由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽作为有效成分，为了避免本说明书的过度的负载性共同的内容省略其记载。上述由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽通过抑制炎性细胞因子的表达，抑制炎症细胞的增殖，来抑制炎症反应，从而对炎症性疾病的预防或治疗非常有效。可适用本发明的抗炎症用组合物的炎症性疾病，就炎症疾病而言包含特应性皮炎、脑炎(encephilitis)、炎症性肠炎、慢性阻塞性肺疾病、败血症性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎症性骨质溶解症、慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症性疾病、大肠炎、炎症性肠病、一型糖尿病、类风湿关节炎、反应性关节炎(reactivearthritis)、骨关节炎、牛皮藓、硬皮症、骨质疏松症、动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎、心包炎、囊性纤维病、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、麻风病、梅毒、莱姆病(lyme)、包柔氏螺旋体病(borreliosis)、神经性-包柔氏螺旋体病、结核、结节病(sarcoidosis)、狼疮、盘状狼疮、冻疮性狼疮、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、肠易激综合征、克罗恩病、干燥综合征、纤维肌痛、慢性疲劳综合症、慢性疲劳性免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病及多发性硬化症，但不限定于此。上述炎症疾病的预防或治疗用组合物可制备成药剂学组合物。在本发明的组合物制备成药剂学组合物的情况下，本发明的组合物可包含(a)上述的本发明的肽的药剂药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体，但不限定于此。在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指在实现上述的肽的功效或活性中充分的量。包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等，但并不限定于此。在remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)详细记载有适合的药剂学上接受的载体及制剂。本发明的药剂学组合物可以口服或非口服给药，优选地，能够以非口服的方式给药，在非口服的情况下，可利用静脉内注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、局部注入、经皮给药等给药，但不限定于此。本发明药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素开不同的处方。另一方面，本发明的药剂学组合物的优选给药量为1日0.001μg至1000μg。本发明的药剂学组合物通过本发明所属
技术领域：
的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液和/或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂和/或胶囊剂的形态，还可包含分散剂和/或或稳定剂。发明的效果本发明涉及由序列表的序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的具有抗炎症活性的肽。上述肽抑制炎性细胞因子的表达，抑制炎症细胞的增殖，从而最终呈现抗炎症活性，因而可有效地使用于炎症性疾病的预防或治疗。附图说明图1a为利用逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-2的表达变化进行确认的结果。图1b为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α的表达变化进行确认的图表。图1c为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的白细胞介素-2的表达变化进行确认的图表。图1d为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-2的表达变化进行确认的结果。图1e为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α的表达变化进行确认的图表。图1f为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的白细胞介素-2的表达变化进行确认的图表。图1g为利用逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-2的表达变化进行确认的结果。图1h为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的肿瘤坏死因子-α的表达变化进行确认的图表。图1i为利用逆转录-聚合酶链反应对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的白细胞介素-2的表达变化进行确认的图表。图2a为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的结果。图2b为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的图表。图2c为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的结果。图2d为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的图表。图2e为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的结果。图2f为利用免疫印迹对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的环氧化酶2的表达变化进行确认的图表。图3a为利用酶联免疫吸附测定(elisa)对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的在脾细胞中的肿瘤坏死因子-α及干扰素-γ分泌变化进行确认的结果。图3b为利用酶联免疫吸附测定(elisa)对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的在巨噬细胞中的肿瘤坏死因子-α分泌变化进行确认的结果。图3c为利用酶联免疫吸附测定对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的在脾细胞中的肿瘤坏死因子-α及干扰素-γ分泌变化进行确认的结果。图3d为利用酶联免疫吸附测定对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的在巨噬细胞中的肿瘤坏死因子-α及干扰素-γ分泌变化进行确认的结果。图3e为利用酶联免疫吸附测定对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的在巨噬细胞中的肿瘤坏死因子-α分泌变化进行确认的结果。图4a为对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的活性氧的生成减少进行测定的结果。图4b为基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的肽的增殖实验结果。图4c为对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的活性氧的生成减少进行测定的结果。图4d为基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的增殖实验结果。图4e为对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的活性氧的生成减少进行测定的结果。图4f为基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的增殖实验结果。图5a为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的结果。图5b为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的图表。图5c为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的结果。图5d为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的图表。图5e为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的结果。图5f为对脾细胞处理由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽，并通过流式细胞荧光分选技术分析cd3+、cd25+的图表。。具体实施方式以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说是显而易见的。实施例合成例1：肽的合成将700mg的氯三苯甲基氯树脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反应容器中，并放入10ml的二氯甲烷(mc)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷溶液放入反应器中，并放入200mmol的fmoc-asp(otbu)-oh(bachem，swiss)及400mmol的二异丙基乙胺(diea)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷(dcm，dechloromethane)中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了asp(otbu)-ctlresin树脂。在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmol的fmoc-asp(otbu)-oh(瑞士巴亨(bachem，swiss))、200mmol的羟基苯并三唑(hobt)及200mmol的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmol的n，n-二异丙基乙胺(diea)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用凯撒测试(nihydrintest)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了arg(pbf)-asp(otbu)-ctlresin树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次凯撒测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。根据选定的氨基酸序列，按fmoc-met-oh、fmoc-thr(tbu)-oh的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐和n，n-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(hobt)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(phosphoruspentoxide，p2o5)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并维持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.8g的纯化前的有序列1的氨基酸序列组成的肽。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为521.6(理论值：521.5)。还与上述相同的方法进行了由序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽的合成。表1实施例1：肿瘤坏死因子-α&白细胞介素-2逆转录-聚合酶链反应通过牺牲6-7周龄的小鼠获得脾脏(spleen)，并利用细胞过滤器挤压脾脏，来与无血清rpmi1640培养基一同进行离心分离。去除上层，为了去除rbc(红细胞)使用了红血球溶解缓冲液。将红血球去除2次后，利用无血清rpmi1640培养基清洗细胞后，添加适量的无血清rpmi1640培养基。测量细胞数并接种到96孔板(1×106细胞/孔)、24孔板(1×107细胞/盘)中。第二天，处理每种肽样品(0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml)和作为刺激剂的脂多糖。此时，通过调整时间点进行了实验。使用easyblue(英斯特朗(intron))提取了总核糖核酸(rna)。为了从核糖核酸合成单链脱氧核糖核酸(dna)，通过使用rt预混合物(英斯特朗)，来加入3μg的核糖核酸，2μg的随机六聚体和处理焦碳酸二乙酯(depc)的水，从而成为总20μl，并在65℃的温度下反应5分钟，在42℃的温度下反应1小时。再次，在95℃的温度下加热5分钟，从而制备了脱氧核糖核酸。聚合酶链式反应(pcr)通过使用聚合酶链式反应预混合物(英斯特朗)，在聚合酶链式反应预混合物中混合3μl的脱氧核糖核酸、对cgi58基因具有特异性的10pmol的引物而执行。聚合酶链式反应条件为在94℃下进行30秒钟，在55℃至56℃下进行30秒，在72℃下进行30秒。循环数的基因而言，在聚合酶链式反应结果能够以指数方式扩增的的条件下进行分析。获得5μl的聚合酶链式反应产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，利用溴化乙锭染色进行确认，在图1a至图1i示出其结果。表2序列号引物序列(5’-3’)4肿瘤坏死因子-α正向cgtcagccgattrtgctatct5肿瘤坏死因子-α反向cggactccgcaaagtctaag6白细胞介素-2正向ctcgcttcctgtgtcacatt7白细胞介素-2反向atcctggggagtttcaggtt如从图1至图1i可确认，当处理由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽时，呈现肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-2的表达减少的倾向。实施例2：免疫印迹利用在实施例1中获得的脾细胞以1×107细胞/孔的细胞密度接种于24孔板。然后，培养一宿后按浓度(0.2～20μg/ml)处理序列表的序列1、序列2及序列3的肽，在37℃的培养基中培养24小时后，处理细胞溶解缓冲液来确保溶解物，然后定量了蛋白质。然后，执行与作为炎症诱导因子的7℃相关的免疫印迹，并在图2a至图2f示出其结果。如从图2a至图2f可确认，当处理由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽时，环氧化酶2的表达减少。实施例3：酶联免疫吸附测定3-1：酶联免疫吸附测定(脾细胞)将在实施例1中处理肽样品和作为刺激剂的脂多糖的脾细胞培养48小时后，收取培养培养基，就获得的培养基而言，通过使用细胞因子(肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ(inf-γ)的酶联免疫吸附测定试剂盒(r&dsystem)来实施实验。3-2：酶联免疫吸附测定(raw264.7细胞)以1×106细胞/48孔的方式接种raw264.7细胞，并培养了一宿，针对于所要确认的试样对细胞预处理0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml，30分钟后处理的作为刺激剂的脂多糖。根据已计划的时间点进行了培养。培养24小时后，收取培养培养基，就所获得的培养基而言，通过使用细胞因子(肿瘤坏死因子-α)的酶联免疫吸附测定试剂盒(r&dsystem)执行实验，并在图3a至图3f示出其结果。如从图3a至图3d可确认，当处理由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽时，呈现在脾细胞中肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ的分泌减少，在raw264.7中，肿瘤坏死因子-α的分泌减少的倾向。并且，如从图3e可确认，当处理由序列3的氨基酸序列组成的肽时，在raw264.7中肿瘤坏死因子-α的分泌减少。实施例4：增殖实验及流式细胞荧光分选技术(facs)4-1.增殖实验(脾细胞)如实施例1所记载，处理肽样品和作为刺激剂的脂多糖，24小时后利用ez-cytox试剂盒实施了实验。4-2.流式细胞荧光分选技术(细胞内的活性氧实验(dcf-da))以1×106细胞/6孔的方式接种raw264.7细胞，并培养了一宿，针对于所要确认的试样对细胞预处理1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml，30分钟后处理的作为刺激剂的脂多糖。根据已计划的时间点进行培养后。将dcf-dh处理30分钟后，利用流式细胞荧光分选技术以荧光的程度测定氧化活性，并在图4a至图4f示出其结果。如从图4a至图4f可确认，当处理由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽时，活性氧的生成减少。并且，当处理上述肽时，脾细胞生存率减少。实施例5：激活t细胞分析(流式细胞荧光分选技术系统)如实施例1所记载，处理肽样品和作为刺激剂的脂多糖，24小时后将抗体(cd3、cd25)激活t细胞标记处理30分钟后，利用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗2次，来实施流式细胞荧光分选技术分析，并在图5a至图5f示出其结果。如从图5a至图5f可确认，当处理由序列1、序列2或序列3的氨基酸序列组成的肽时，cd3+、cd25+细胞减少。以上，详细说明了本发明的特定部分，但可以明确的是，对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，这些具体说明只属于一个优选实例，本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。产业上的可利用性本发明涉及具有抗炎症活性的肽及其用途。序列表<110>caregenco.,ltd.<120>具有抗炎症活性的肽及其用途<130>pp170019<160>7<170>kopatentin2.0<210>1<211>4<212>prt<213>肽1<400>1thrmetargasp1<210>2<211>5<212>prt<213>肽2<400>2aspasncysleuarg15<210>3<211>9<212>prt<213>肽3<400>3glyvalglnhisglnalaserprotyr15<210>4<211>21<212>dna<213>tnf-α正向引物<400>4cgtcagccgattrtgctatct21<210>5<211>20<212>dna<213>tnf-α反向引物<400>5cggactccgcaaagtctaag20<210>6<211>20<212>dna<213>il-2正向引物<400>6ctcgcttcctgtgtcacatt20<210>7<211>20<212>dna<213>il-2反向引物<400>7atcctggggagtttcaggtt20当前第1页12