本发明涉及一种重组vip3aa蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种诱导表达vip3aa/pet21b/bl21重组菌株制备vip3aa蛋白及其在德国小蠊和美洲大蠊防治中应用，属于生物防治领域。
背景技术
bt菌株可以在营养生长阶段合成一种杀虫蛋白，杀虫蛋白被称为营养性杀虫蛋白(vegetativeinsecticidalproteins，vip)。vips主要分为vip1，vip2和vip3，不同的vips蛋白具有不同的杀虫活性。vip3蛋白是目前研究最多的vip蛋白。vip3aa蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、烟夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾和小地老虎等农作物害虫具有较高的杀虫活性。作用过程为：vip3蛋白被中肠蛋白酶水解为活性蛋白，活性蛋白与上皮中肠细胞顶端特异性受体结合，形成孔道并破坏中肠细胞，导致昆虫死亡。vip3aa蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。vip3aa蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物(62kd)为vip3aa蛋白的毒性核心结构。vip3aa蛋白结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中肠上皮细胞的凋亡和溶解。
美洲大蠊和德国小蠊在全世界广泛分布的害虫，其可携带和传播多种疾病，如鼠疫杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌和脊椎灰质炎病毒等40多种病原体。目前，蜚蠊科昆虫的主要防治方法可分为物理防治、化学防治和生物防治。化学防治是使用最广泛的方法。化学杀虫剂可以在人体和动物器官和脂肪中积累，引起慢性中毒，同时蜚蠊对杀虫剂的抗性增强影响了化学杀虫剂的进一步使用。使用生物杀虫剂及其代谢物代替化学杀虫剂来预防蜚蠊是潜在的有希望的方法，如商业性绿僵菌杀虫剂(biopath)已经可用于预治蜚蠊，武汉大学开发了一种病毒杀虫剂用于蟑螂的防治。
中国专利申请2011104173078公开了一株对蔬菜鳞翅目害虫具有广谱高毒力的苏云金芽胞杆菌mb-15(bacillusthuringiensismb-15)，菌株保藏号为cgmcc№.5255。该菌株能形成菱形杀虫晶体蛋白，含有cry1i、cry1ac、cry2ac和vip3aa四种基因，对小菜蛾、菜粉蝶、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性。
中国专利申请2013102898486涉及一种杀虫基因及其用途，所述杀虫基因的核苷酸序列包括：(a)具有seqidno：4所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为seqidno：22；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，显著提高了vip3aa-02杀虫蛋白的表达量、稳定性和毒力；同时本发明通过植物体内产生能够杀死大螟的vip3aa蛋白来控制大螟害虫，对植物进行全生育期、全植株的保护以防治大螟害虫的侵害。经过检索，目前尚未见vip3aa蛋白蟑螂防治中的应用报道。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供重组vip3aa蛋白的制备方法。
一种重组vip3aa蛋白的制备方法，其具体包括下述步骤：
1)vip3aa基因的克隆及双酶切重组质粒的构建
以vip3aadna为模板，参考序列genbank：l48811.1，bacillusthuringienisstrainab88insecticidalprotein设计引物进行pcr反应，引入bamhi和xhoi酶切位。vip3aadna序列如seqidno.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。
其中pcr反应的正向引物如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。pcr反应的反应体系如表1所示。
表1pcr反应的反应体系
pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60退火反应30s，72℃扩增3min(1000bp每分钟)，30个循环，72℃延伸10min。
以bt基因组dna，pcr扩增获得一个2370bp左右基因，与理论结果符合。基因f端被引入一个bamhi酶切位点，r端被引入一个xhoi酶切位点。随后构建重组质粒vip3aa/pmd20-t，然后进行阳性转化子pcr鉴定。pet(2)vip3aa/pet21b表达载体的构建和鉴定
将pcr产物和原核表达质粒pet21b分别采用限制性内切酶bamhi和xhoi进行双酶切，采用dna纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度并计算酶切片段摩尔数，以目的基因：表达载体摩尔比为3：1，通过t4连接酶进行连接反应构建得到vip3aa/pet21b表达载体。其中配制的50μl酶切体系如表2所示：
表2限制性内切酶bamhi和xhoi进行双酶切的酶切体系
进行酶切反应时将组分充分混匀后，37℃反应1h，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离15min，小心切取目的条带，采用dna纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度，按照公式1pmol1000bpdna＝0.66μg计算酶切片段摩尔数，以目的基因：表达载体摩尔比为3：1，通过t4连接酶进行连接反应，配制反应体系如表3所示。
表3目的基因与表达载体连接反应体系组成
样品加好后，轻弹混匀，瞬时离心，4℃连接过夜。100μldh5α感受态加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上放置30min，金属浴42℃热击90s。冰上放置1min，加入900μllb培养基，37℃低速振荡培养(或水浴)1h-1.5h。5000rpm离心，去上清，保留200μl培养基吹打均匀沉淀，均匀涂布于氨苄筛选平板。16-18h后，挑取单菌落进行菌落pcr和酶切鉴定。挑取阳性克隆送英潍捷基公司测序。图1vip3aa/pet21b阳性转化子鉴定显示，菌落7有阳性条带，具有2370bp条带，提示已经正确导入vip3aa基因。故后续对菌落7进一步摇菌提取质粒双酶切。图2为阳性转化子酶切鉴定，vip3aa/pet21b阳性转化子鉴定，样品7提取质粒双酶切，可见双酶切后琼脂糖凝胶电泳分别获得5443bp载体和2400左右目的基因条带。具有2370bp条带，pet21b载体正确插入vip3aa基因。
(3)vip3aa/pet21b/bl21重组菌株的获得
提取鉴定为阳性的表达载体vip3aa/pet21b，100μle.coilbl21(de3)感受态加入10μlvip3aa/pet21b，轻弹混匀，冰上放置30min，金属浴42℃热击90s。冰上放置1min，加入900μllb，37℃低速振荡培养(或水浴)1h-1.5。5000rpm离心，去上清，保留200μl培养基吹打均匀沉淀，均匀涂布于氨苄筛选平板。16-18h后，挑取单菌落进行菌落pcr和酶切鉴定获得vip3aa/pet21b/bl21重组菌株。
(4)重组菌株的诱导表达
挑取vip3aa/pet21b/bl21重组菌株单菌落接种于5ml100μg/ml氨苄的lb液体培养基中，37℃，180rpm，震荡培养12-16h，将此菌液按1：100的比例接种于新鲜的lb液体培养基中，37℃，180rpm，震荡培养至od600值为0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg进行诱导，20℃，180rpm条件下震荡培养24h。图3vip3aa的western-blot鉴定，western-bolt鉴定显示诱导后vip3aa/pet21b/bl21可见88kda左右vip3aa蛋白表达。
取诱导前后的菌液各1ml，4℃10000rpm离心10min收集菌体，重悬于150μl去离子水中，加入50μl的4×sds上样缓冲液，沸水煮10min，进行10％的sds-page电泳鉴定。图4为纯化蛋白sds-page分析，可见88kda左右条带。
(5)vip3aa的分离纯化和冷冻干燥
将过夜培养的vip3aa/pet21b菌株按1：100接种到1l培养基中，培养2.5h至对数生长期，采用上述试验所测定最优条件进行诱导表达。12000rpm离心10min，收集菌体。pbs洗涤，离心。按每升培养液加入40ml的裂解缓冲液(25mmol·l-1tris-cl，300mmol·l-1nacl，5mmol·l-1β-巯基乙醇，ph8.0)悬浮菌体，加入pmsf和1％曲拉通x-100，采用超声细胞破碎仪破碎12min(功率250w，work6s，off6s)，细胞破碎后，12000rpm离心30min，取上清进行sds-page。
vip3aa/pet21b菌株破碎后上清采用0.22μm滤器过滤。采用a泵吸取10mlvip3aa/pet21b菌株破碎后上清，采用五倍柱体积的2％咪唑的blindingbuffer对层析柱进行平衡，进行线性梯度洗脱。
脱盐：将脱盐柱和层析系统相连，以4ml/min去离子水冲洗5个柱体积。5倍柱体积的0.15mnacl缓冲液对层析柱进行平衡。采用2ml上样环上样，采用脱盐程序脱盐：
收集脱盐的样品溶液，置于-80℃冷冻2h。冷冻干燥仪预冷至-40℃，将冷冻样品放入真空腔内，盖好真空腔盖子，开启真空泵。冷冻干燥48h即可达到样本蛋白粉。
本发明另一目的是请求保护按照上述制备方法制备得到的vip3aa蛋白。
本发明再一目的是请求保护vip3aa蛋白在防治美洲大蠊或德国小蠊中的应用。
本发明所述的vip3aa蛋白的制备方法制备得到的vip3aa纯度较高，生产效率大大提升，制备得到的vip3aa蛋白具有较好的防治美洲大蠊或德国小蠊的效果，具有较好的农业应用前景。
附图说明
图1为阳性转化子pcr鉴定。
图2阳性转化子酶切鉴定。
图3vip3aa的western-blot鉴定，其中m，proteinmarker；1、vip3aa/pet21b/bl21诱导前；2、vip3aa/pet21b/bl21诱导后全菌。
图4纯化蛋白sds-page分析。
图5vip3aa蛋白对美洲大蠊杀虫活性。
图6vip3aa蛋白对德国小蠊杀虫活性。
图7vip3aa蛋白对美洲大蠊美洲大蠊消化道的影响，其中a：a，对照组；b，给药组；b：给药组；c：对照组。
图8vip3aa蛋白对美洲大蠊嗉囊的影响，其中a：对照组嗉囊(×200)；b：对照组嗉囊(×400)；c：给药组嗉囊(×200)；d：给药组嗉囊(×400)。
图9vip3aa蛋白对美洲大蠊中肠的影响，其中a：对照组中肠(×200)；b：对照组中肠(×400)；c：给药组中肠(×200)；d：给药组中肠(×400)。
图10vip3aa蛋白对美洲大蠊柱状结肠的影响，其中a：对照组柱状结肠(×200)；b：对照组柱状结肠(×400)；c：给药组柱状结肠(×200)；d：给药组柱状结肠(×400)。
图11vip3aa蛋白对美洲大蠊嗉囊的影响(扫描电镜图)，其中a：对照组嗉囊(×500)；b：对照组嗉囊(×1000)；c：给药组嗉囊(×500)；d：给药组嗉囊(×1000)
图12vip3aa蛋白对美洲大蠊中肠的影响(扫描电镜图)，其中a：对照组中肠(×500)；b：对照组中肠(×1000)；c：给药组中肠(×500)；d：给药组中肠(×1000)。
图13vip3aa蛋白对美洲大蠊柱状结肠的影响(扫描电镜图)，其中a：对照组中肠(×500)；b：对照组中肠(×1000)；c：给药组中肠(×500)；d：给药组中肠(×1000)。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实验例1本发明vip3aa蛋白对美洲大蠊和德国小蠊的杀虫活性
取2mg/ml、0.5mg/ml、0.125mg/ml和0.03125mg/ml浓度vip3aa蛋白配制成1ml溶液，分成5组，每组15只德国小蠊，将德国小蠊放入细菌培养皿内，加入1ml药品溶液，自由饮水，分别于12h、24h和36h和48h，观察德国小蠊死亡率。
取2mg/ml、0.5mg/ml、0.125mg/ml和0.03125mg/m浓度vip3aa蛋白配制成1ml溶液，分成5组，每组10只美洲大蠊，将美洲大蠊放入锥形瓶内，加入1ml药品溶液，自由饮水，分别于12h、24h和36h，观察美洲大蠊死亡率。
3.3.1vip3aa蛋白杀蜚蠊活性分析
vip3aa对美洲大蠊的12h、24h和36hld50分别为0.70302mg/ml、0.15906mg/ml和0.15906mg/ml；vip3aa对德国小蠊的12h、24h和36hld50分别为0.54077mg/ml、0.27321mg/ml和0.17914mg/ml。见表3-1和表3-2或图5和图6。
表3-1vip3aa蛋白对美洲大蠊杀虫活性(mg/ml)
表3-2vip3aa蛋白对德国小蠊杀虫活性
实验例2vip3aa蛋白对美洲大蠊消化系统的影响
(a)he染色
(1)麻醉和解剖：将蜚蠊置于冰上麻醉，采用昆虫针插入蜚蠊颈部固定，去除蜚蠊翅膀和足，用眼科剪从腹未边沿剪开体壁，小镊子剔除腹腔多余组织，将消化道拉直，沿咽顶端和直肠末端剪断获得蜚蠊完整消化系统。
(2)取材：手术刀片分别切取嗉囊和中肠、柱状结肠，样品组织小于0.5cm×0.5cm×0.1cm。
(3)固定和包埋：用4％pfa(0.01mpbs，ph7.4)进行固定，经70％乙醇60分钟、85％乙醇60分钟、95％乙醇60分钟、100％乙醇50分钟两次、二甲苯透明30分钟两次、55℃石蜡中30分钟三次、用不锈钢模具包埋组织块。
(4)石蜡切片：石蜡切片，将厚度4μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，65℃烘烤2h；
(5)he染色：脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中10分钟两次、100％乙醇5分钟、95％乙醇5分钟、90％乙醇5分钟、85％乙醇5分钟、75％乙醇5分钟、自来水洗5分钟两次；浸入明矾苏木素染液浸染15分钟，流水冲洗切片30秒钟。1％盐酸酒精分化切片3秒钟，流水冲洗切片30秒钟。淡氨水返蓝1分钟。1％伊红酒精液染色3分钟。95％酒精脱水30秒钟。100％酒精脱水30秒钟两次。二甲苯60秒钟三次。中性树胶封片。
(b)扫描电镜观察
(1)取材：分离蜚蠊中肠和嗉囊后，采用昆虫生理盐水漂洗干净，每次15min。采用2.5％戊二醛室温下固定30min，小心将组织剪开方便展开，放入4℃冰箱固定24h。
(2)漂洗：将固定好的样品采用0.1mpbs漂洗3次，每次15min。
(3)后固定：漂洗后的蜚蠊中肠和嗉囊放入1％锇酸中固定2h。
(4)脱水：蜚蠊中肠和嗉囊样品经50％酒精-70％酒精-80％酒精-85％酒精-90％酒精-95％酒精-无水酒精脱水各1h，样品放入纯丙酮中置换20min，最后将样品放入醋酸异戊酯中30min。
(5)co2临界点干燥：蜚蠊中肠和嗉囊样品从醋酸异戊酯中取出后，放入临界点干燥仪的样品室内，盖上盖。在达到临界状态(31℃，72.8个大气压)后，将温度再升高10℃，使液体co2气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。
(6)离子溅射镀膜：将干燥后的皮肤样品置于离子溅射仪下，将金属粒子溅射到中肠和嗉囊样品表面，形成一层金属膜。电镜下观测，拍照。
实验结果：
(1)vip3aa蛋白对美洲大蠊消化道的影响
图7为vip3aa蛋白对美洲大蠊消化道的影响，通过解剖发现，相对于正常美洲大蠊消化道，给药组美洲大蠊消化道明显缩短；大部分给药后的，美洲大蠊嗉囊膨胀。
(2)vip3aa蛋白对病理学观察
图8为vip3aa蛋白对美洲大蠊嗉囊的影响，结果显示给药后美洲大蠊嗉囊上层细胞未见明显改变。图9为vip3aa蛋白对美洲大蠊中肠的影响，结果显示给药后美洲大蠊中肠细胞上皮细胞破裂，bbmv皱缩，脱离上皮细胞。图10为vip3aa蛋白对美洲大蠊柱状结肠的影响，结果显示美洲大蠊柱状结肠细胞上皮细胞破裂，bbmv皱缩，脱离上皮细胞。图11vip3aa蛋白对美洲大蠊嗉囊的影响(扫描电镜图)，结果显示给药后美洲大蠊嗉囊上层细胞未见明显改变，表面覆盖齿状结构。图12vip3aa蛋白对美洲大蠊中肠的影响(扫描电镜图)，结果显示美洲大蠊中肠表面齿状结构消失，暴露下层组织结构。图13为vip3aa蛋白对美洲大蠊柱状结肠的影响(扫描电镜图)，结果显示美洲大蠊柱状结肠表面齿状结构消失，暴露下层组织结构。
序列表
<110>广东药科大学
<120>一种重组vip3aa蛋白的制备方法及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2430
<212>dna
<213>bacillusthuringienis
<400>1
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