专利名称：使用多糖将治疗剂传递到受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及将治疗剂靶向传递到特定细胞群，特别是肝细胞的方法。
背景技术：
使治疗剂到达特定细胞的必要性治疗剂是有效地改变患者某些生理功能给患者服用的制剂。这些试剂包括药物，蛋白，激素，酶，核酶，肽，甾体，生长因子，酶活性调节因子，受体活性调节因子和维生素。本发明涉及使治疗剂到达所选择的细胞(也即靶细胞)，并因此增加治疗剂在其中产生有益效果的细胞中的浓度，减少在其中产生毒性的细胞中的浓度。通过将治疗剂传递到特定细胞，使之发挥药效，而避免进行那些会对其产生药物毒性的细胞，可增加治疗剂的安全性和有效性。
与治疗剂相比，诊断对比型试剂是根据使某些生理功能更明显，而同时使其它生理功能不影响的目的给患者服用的制剂。这些诊断试剂包括用于闪烁照相法的放射性同位素，用于X-射线或计算机化X-射线照相术的电子密度标记，和用于磁共振显影的磁标。基于网状内皮系统RES的靶向传递一种靶向传递治疗剂的策略包括将这些试剂传递到吞噬细胞，也称巨噬细胞，发现它们在称为网状内皮系统(RES)的一系列器官中大量存在，RES的器官包括肝脏，脾脏和骨髓。吞噬作用是非特异性地将各种物质包括胶体，粒子，脂质体和微球体从血液中排除的过程。例如，右旋糖酐铁，是葡萄糖被胶态氢氧化正铁包覆用于治疗贫血，它可被RES中具有吞噬活性的巨噬细胞慢慢从血液中清除。(Henderson et al.，34 Blood(1969)pp.357-375)。脂质体包被的药物也被用于治疗这类疾病如利什曼原虫病(Leishmania)Co′Mullane et al“BiopHarmaceutics ofMicroparticulate Drug Carriers”Ann.N.Y.Acad.Sci.(1987)507120-140)。微球体也被用于将治疗剂传递到RES，用于刺激巨噬细胞的免疫功能(Kankte et al.“Interaction of Microspheres with blood constituents，II.Macrophage phagocytosis ofvarious type of polymeric drug carriers，”42 J.Parenternal Science and Technology(1988)pp.157-165)。但是，将治疗剂传递到巨噬细胞很少应用于不涉及巨噬细胞或巨噬细胞功能的疾病治疗中。基于RME的靶向传递另一种靶向传递治疗剂的策略包括将治疗剂结合到分子(也称载体)上，通过受体介导的细胞内吞(RME)使其从血管腔隙中脱离。RME是分子在细胞外空间与特定的细胞表面受体结合，然后被吞入细胞的过程。通过RME吸收物质是正常，健康的细胞的特征。RME转移系统可在正常巨噬细胞，肝细胞，纤维细胞和网状细胞中找到。RME使细胞能从血浆中清除各种大分子，如低密度脂蛋白，铁传递蛋白和胰岛素。参见表1，Wilemanet et al.，232 Biochem.J.(1985)pp1-14，列出了进行RME的细胞，同时还包括RME的综述。还可参见Menz，E.T.，PCT WO90/01295，1989年8月3日申请中的表I，这两篇文献这里引作参考。通过将治疗剂结合到载体上进行RME，可将治疗剂传递到无吞噬作用的细胞中，例如肝脏的肝细胞。基于RME将治疗剂靶向传递需要将治疗剂结合到合适的受体分子上，以改变治疗剂的生理分布。
诊断试剂也被结合到载体上进行通过RME的吸收，例如，载体与无唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受体相互作用，例如在动物研究中发现用放射性同位素制备的糖原白蛋白-99Tc对肝显示出高特异性。(Vera et al，J.Nucl.Med.261157-1167，1985)。在另一个例子中，Groman et al，(U.S.5,284,646)，这里引作参考)将超导磁性金属氧化物与糖蛋白结合在磁共振显影时用作体内对比试剂。用于RME靶向传递的载体一种类型的分子广泛用作基于RME靶向传递治疗剂的载体是糖蛋白。糖蛋白分子含有蛋白质主链，并与多个低聚糖侧链相连，它们通常含有2-20个单糖通过共价键与蛋白质主链的N或O连接。(stryer L，Biochemistry，3d Ed.，NYW.N.Freeman Co.，pp.343-344(1988))。例如，已知一种受体为肝的无唾液酸糖蛋白受体可识别具有半乳糖残基的糖蛋白并将它融入细胞。那些具有唾液酸连接到在低聚糖的半乳糖前末端基的糖蛋白缺乏与受体的亲和性，但可通过除去末端的唾液酸使半乳糖暴露而转化成可与受体结合的分子。例如，胎球蛋白可通过除去末端的唾液酸基转化成无唾液酸胎球蛋白。被无唾液酸糖蛋白受体识别，并进行RME，是依赖于连接在低聚糖上的半乳糖基的数目和簇的排列。类似地，在巨噬细胞上的甘露糖受体识别具有甘露糖残基的糖蛋白，并通过RME将它们融入细胞。另一种可替换糖蛋白载体的是所称的新糖蛋白，它是通过将多个单糖或二糖通过共价键连接到蛋白质分子上合成的。新糖蛋白的一个例子是乳糖化的牛血清白蛋白，它可结合到肝无唾液酸糖蛋白受体上。
表1提供了几个基于RME靶向传递的例子，它包括受体，细胞，治疗剂和载体。要看进一步的综述可参见Ranade，J.Clin.Pharmacol.，29685-694(1989)；和Bodmer et al.，Methods of Enzymology vol.112.，P.298，Academic Press(1985)。要看最近的综述，可参见Meeier，Antiviral Research，18215-258(1992)；Meijer，Trends inDrug Research，vol 13，303-332；Meijer，Pharm.Res.6(2)105-118(1989)。
表1基于RME的靶向传递的受体，细胞，治疗剂和载体受体/细胞 治疗剂/载体 参考文献半乳糖或无唾液酸 ara AMP/乳糖化 Fiumeet et al.，Lancet糖蛋白/肝细胞 的人血清白蛋白 213-15(1988)半乳糖或无唾液酸 乙酰半胱氨酸/ Wu and Wu，Hepatology糖蛋白/肝细胞 无唾液酸胎球蛋白5709-713(1985)半乳糖或无唾液酸 甲酰四氢叶酸/ Wu and Wu，Proc.Natl糖蛋白/肝细胞 无唾液酸胎球蛋白Acad.Sci.803078-3080(1983)半乳糖或无唾液酸 DNA/无唾液酸Wu and Wu，J.Biol.Chem.糖蛋白/肝细胞 α-酸性糖蛋白 26314621-14624(1988)甘露糖/T4淋AZT/甘露糖化Molema et al，Biochem巴细胞 白蛋白 Pharm.402603-2610(1990)甘露糖/巨噬细胞胞壁酰二肽/甘露糖 Roche et al.，Res.Virol，化白蛋白141，243-249RME的特征通过RME吸收显示出配体-受体相互反应的三个特性结构特异性，饱和性和竞争性。
结构特异性，受体可区分结构极为近似的分子，只有分子结构符合受体结合位点的结合需要的分子才能被融入细胞。通常RME中的受体是通过它们在融入细胞的能力或从环境中清除糖蛋白的能力被发现的。
饱和性，当通过RME融入细胞的试剂的速率减少，伴随着试剂浓度增加时可观察到饱和性。这是因为，在高浓度时，受体接近于全部被占领或被配体饱和。
竞争性，当一种分子在血液中的清除减少是由于出现了另一种结构与第一种分子相似的物质时，可观察到竞争性。第二种分子竞争受体的结合位点并减少了第一种试剂融入细胞的比率而且当高浓度的单一配体竞争有限数量的受体位点时，出现饱和性，竞争导致化学上不同的配体结合到有限数量的受体位点上。竞争可用于区分本发明的RME型的多糖与其它类型的多糖(参见表2)。糖蛋白和新糖蛋白作为治疗剂载体存在的问题不管糖蛋白和新糖蛋白作为治疗剂载体的应用多少，这些载体会出现许多问题，其中某些在文献中被讨论过。
1.糖蛋白和新糖蛋白在进行RME时不是天然产物。使糖蛋白与无唾液酸糖蛋白受体相互作用需要对糖白蛋修饰，如除去末端的唾液酸使半乳糖残基暴露。例如，胎球蛋白必须脱唾液酸化才能制成可与受体相互作用的载体。同样的，新糖蛋白是通过将多个乳糖残基接到的蛋白上合成的。
2.从牛源衍生来的糖蛋白可导致人的免疫反应。有报道新糖蛋白对动物有致免疫作用。(Fium L.)Busi C.，Preti P.，Spinosa G.Cancer Drug Delivery，1987，4145-150)。
3.新糖蛋白和糖蛋白一般在结合合成中不允许有机溶剂的存在。本发明的实施例中用到了有机溶剂。
4.在合成新糖蛋白时，为了接上单糖或二糖，消耗了蛋白质中带正电荷的胺基(并中和)。其结果导致新糖蛋白有太多的负电荷。如此多的负电荷使得它更易被称为净化剂的受体吸收，而减少了治疗剂通过RME传递到细胞的量(Kanke.M，Geissler RG，Powell D，Kaplan A，DeLuca P.J Parenteral Science and Technology，1988，42157-165)。
由于上述原因，需要寻找新方法定向传递治疗剂到特定细胞，如果能找到改进的载体进行RME的靶向传递治疗剂到特定细胞，问题也就解决了。这种载体对受体应是高亲和性的，并且在复合形成和与治疗剂接合后保持亲和力。另外，所期望的载体应是天然的，易以纯的形式得到，并且必须是无毒的。
发明概述本发明的目的是提供一种定向传递治疗剂到特定细胞的方法，它通过使受治疗者服用有效剂量的复合物，复合物含有结合在RME多糖上的治疗剂，并且结合的RME多糖可与靶细胞上的RME受体结合，以使靶细胞可将治疗剂融入靶细胞内。
RME多糖可以是，例如阿拉伯半乳聚糖，阿拉伯胶或甘露聚糖。治疗剂可以是，例如，抗病毒剂，激素，维生素，抗体，酶或基因。另一种情况是，一种RME多糖可以是另一种RME多糖的水解产物。
附图简述
图1是RME多糖阿拉伯半乳聚糖的一般结构。
图2是RME多糖阿拉伯胶的一般结构。
图3是将治疗剂通过RME多糖上的羧基连接到RME多糖上的详细化学过程。
图4是将治疗剂通过RME多糖上的胺基连接到RME多糖上的详细化学过程。
特别实施方案的详述本发明涉及使用多糖载体将治疗剂传递到特定细胞，而避开其它细胞，并通过这样，提供通过受体介导的细胞内吞(RME)靶向传递治疗剂到特定细胞的方法。靶向传递增加了治疗剂在其中起有益作用或诊断功能的细胞中的浓度，减少了其在其中产生不希望的毒性的其它细胞中的浓度。许多治疗剂产生毒性作用，但对于试剂在其中产生有益效果的细胞不产生毒性，而对不用于不需要有着作用的细胞产生毒性。
通过使用多糖载体定向传递治疗剂到特定细胞，而避开其它细胞，本发明提供了增加已知治疗剂的安全性和有效性的方法。例如，一种用于抑制肝炎病毒B在肝的肝细胞中复制的治疗剂，可显示出对骨髓细胞的毒性。由于骨髓的功能对于生命是必要的，对骨髓的毒性限性了可给患者施用的治疗剂的用量。但是，依照本发明的实施方案，可将治疗剂连接到载体上通过RME吸收，靶向传递到肝细胞，并减少了治疗剂到达骨髓细胞的浓度。另外，治疗剂的效能也增加了，因为以前分布到骨髓细胞的部分治疗剂现在也到达了肝。涉及骨髓的副反应可大大减少。本发明的RME多糖我们发现了一些多糖与RME中的受体相互作用，我们称其为RME-多糖。RME多糖是从天然来源得到的天然多糖。例子包括可与肝细胞的无唾液酸糖蛋白受体相互作用的阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯胶，以及可与甘露糖受体(表1)相互作用的甘露聚糖。一般的多糖包括纤维素，淀粉，羟乙基淀粉，肝素，葡聚糖硫酸酯，羧甲基化的葡聚糖和羧甲基纤维素，它们不与RME的受体相互作用。RME多糖的特性RME多糖一般具有高度分支结构。许多主链残基具有至少3个分支点，且许多分支使得产生许多末端单糖残基。最终，是这些末端单糖残基的类型，数量和排列决定RME多糖与受体的相互作用强度。对于可用作载体的多糖，必须有许多单糖在合适的排列位置用于与受体的相互作用。在无唾液酸糖蛋白受体中，多个成簇的半乳糖残基族与受体的结合是有用的。例如，RME多糖阿拉伯半乳聚糖是高度分支的，有许多末端半乳糖残基相邻近，并且显示出与无唾液酸糖蛋白受体很强的相互作用，参见表2。相反，半乳聚糖，由许多半乳糖组成，与无唾液酸糖蛋白受体显示出很少的相互作用。这是因为半乳聚糖是线性聚合物，很少有末端半乳糖。因为半乳聚糖很少被受体识别，RME多糖不能仅从组成数据上来鉴定。RME多糖的测定可根据多糖与和第二种物质竞争结合的能力来将多糖划分为RME多糖或非-RME多糖，已知所述的第二种物质可与RME受体相结合。例如，多糖与无唾液酸糖蛋白受体相互作用的能力可通过竞争分析试验来显示，看它是否减缓了阿拉伯半乳聚糖包被的超顺磁铁氧化物胶体的清除，因为已知这种胶体是被上述受体清除的。由于这种胶体已知被无唾液酸糖蛋白受体清除(Josephson et al.，Mag.Res.，Imag.8637-646(1990))；Menz，E.T.PCT WO 90/01295，1988年8月3日申请，两篇文献均在这里引作参考)，多糖与受体相互作用，减缓了胶体的清除，即增加了血液半衰期。
为了测定血液半衰期，将Sprague Dawley大鼠(200-300g)麻醉，对其注射一定剂量的阻断剂(如阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖)，然后再注射胶体，注射量为40μmoles Fe/kg。在不同的时间抽血，测定1/T1，旋转点阵松驰率(the spin-latticerelaxation rate)，及1/T2，自旋松弛率(the spin-spin relaxation rate)。1/T1和1/T2值的增高与超顺磁铁氧化物的浓度有关。从1/T1和1/T2的变化，可测定出阿拉伯半乳聚糖包被的超顺磁金属氧化物在血中的半衰期。将单独的阿拉伯半乳聚糖包被的超顺磁铁氧化物胶体的清除率作为参考点。和服用阻断剂后胶体的半衰期的增长(清除减慢)显示出阻断剂与胶体与同一受体结合，因此阻碍了胶体的吸收。在无阻断剂存在时，超顺磁铁氧化物胶体会很快被无唾液酸糖蛋白受体清除，其血中半衰期为2.8分钟。结果列于表2。
表2多糖对于超顺磁铁氧化物胶体清除的影响阻断剂 类型 阻断剂用量(mg/kg) 胶体血液半衰期(分钟)无 - 无2.8阿拉伯半乳聚糖 RME-多糖 150 33.2阿拉伯胶 RME-多糖 150 107.5无唾液酸胎球蛋白 糖蛋白100 56.6羟乙基乙基淀粉 非-RME多糖750 1.6半乳糖单糖 300 6.0RME-多糖(阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯胶)和糖蛋白载体无唾液酸胎球蛋白可增加超顺磁铁氧化物胶体的血中半衰期，显示出胶体与试验载体竞争相同的受体结合位点。作为对比，非-RME多糖羟乙基淀粉和单糖半乳糖对胶体的半衰期几乎没有影响。如表2的类似实验方法，RME-多糖甘露聚糖阻碍了放射性糖蛋白RNA酶B的清除。Brown et al.，Arch，Brochem.Biophys，188418-428(1978)。这是因为RNA酶B的清除是被甘露糖受体识别的，且显示出甘露聚糖是一种RME型多糖。
上述竞争性清除分析还可用于检测RME-多糖-治疗剂复合物是否合成了，如下述实施例中所述，是否保留与受体的相互作用。
RME-多糖还可进行部分水解消化，以产生低分子量的RME-多糖。可从RME-多糖开始，进行酸催化的，碱催化的或酶催化的水解产生低分子量的多糖。所得多糖进行例如表2的分析评估，测定它们与受体的相互作用能力。本发明的多糖，水解消化前或后，都具有大于约1,000道尔顿的分子量。RME多糖作为治疗剂载体的优点。
RME-多糖作为治疗剂的载体具有许多优点。
1.RME多糖以其自然形式被受体识别。而天然糖蛋白需要修饰(除去唾液酸)或新糖蛋白需要合成制备(将乳糖连接到白蛋白上)，只有这样，这些分子才能作为治疗剂的受体。
2.多糖具有高度的化学稳定性。由于多糖的稳定性，在治疗剂和多糖间的共价键可在有机溶剂中获得。这是个很重要的优点，因为许多治疗剂具有低水溶性。在非水介质中进行，对水不稳定的键(例如，酯)可在治疗剂和多糖间产生。实施例6提供了这样的化学例子。另外，多糖在高温不变性，并且可在大pH值范围内或有机溶剂中存在。在实施例1中，多糖阿拉伯半乳聚糖用于包被铁氧化物胶体。在此合成中，阿拉伯半乳聚糖首先暴露于pH约低于3的条件下，当可溶性铁盐出现时，加入碱达到高pH，最后又用高温。
3.RME多糖可以不从动物得到，而从自然来源得到(即，微生物或植物)。而来自人或动物的糖蛋白，需要花费昂贵的费用以确保它们不含病原体。
4.植物或微生物源可以可靠方式和合理的价格提供大规模生产粗品多糖。
RME多糖的例子1.阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖是一类可以从许多树和植物的细胞壁获得的多糖。阿拉伯半乳聚糖的一种常用的来源是在美国西部的落叶松(Larixoccidentalis)。从此来源得到的阿拉伯半乳聚糖曾被用作粘合剂，乳化剂或食物中的稳定剂。
阿拉伯半乳聚糖含有半乳糖型主链和阿拉伯糖和半乳糖支链。一般地，半乳糖与阿拉伯糖的比例在5∶1到10∶1之间。分子量在10到100千道尔顿之间。(Glickman，ed.，“Food Hydrocolloids”，CRC Press(1982)pp.5，33)。阿拉伯半乳聚糖的糖基键分析表明它具有高度分支结构，含有1，3连接的吡喃半乳糖主链与1，3糖苷键，包括3，4，6-，3，6-和3，4-及3-连接的残基。在碳-13NMR谱中，阿拉伯半乳聚糖的主要共振位置是§-吡喃半乳糖，§-呋喃阿拉伯糖，和§-吡喃阿拉伯糖。图1表示的是阿拉伯半乳聚糖的结构。
在本发明所述实施例的实施方案中，可商购得到的阿拉伯半乳聚糖(从Sigma化学公司购得)还要用超滤法进一步纯化，以除去分子量大于100,000道尔顿和小于10,000道尔顿的杂质。
2.阿拉伯胶。阿拉伯胶是从金合欢树(Acacia Senegal(L)Willd)的渗出物中得到的高度分支的多糖。天然的阿拉伯胶分子具有1，3-连接的D-吡喃半乳糖单元。其中一些在6-位由1，6-连接的以葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸残基结尾的吡喃半乳糖单元的侧链取代。在粗的树胶中存在少量的多肽(约2％)，主要是丝氨酸和羟脯氨酸。(Dickinson et al.in“Food polymers，gels and colloids，Special publicationNo.82，Proceedings of an international symposium by the Food Chemistry Group of theRoyal Society of Chemistry，Dickinson，Ed.，Norwich England(1991))。不同的作者报导粗品阿拉伯树胶的分子量从720,000道尔顿(带有蛋白质)(Duvallet et al.PolymerBulletin 21517(1989))到约300,000道尔顿(参见上面的Dickinson)。使用链霉蛋白酶控制降解可使分子量减少至约180,000道尔顿(参见上面Duvallet)。可商购得到的材料具有在250,000道尔顿范围内的分子量。
在本发明的实施例中使用的阿拉伯胶是从Sigma Chemicals购得的，通过大小排阻层析得到的分子量约为150,000到300,000道尔顿。可商购的阿拉伯胶主要含有阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和葡萄糖醛酸，且氮含量＜0.5％。用酸滴定每摩尔阿拉伯胶约有176个羧酸，用碱滴定约有250个羧酸。这些羧酸使它更易衍生。
本发明的实施方案还包括阿拉伯胶的衍生物，如阿拉伯胶的片段，二聚物，三聚物和聚合物。这些衍生物提供了附着于治疗剂上的反应物底物，治疗剂可通过衍生物上的氨基，羧基，巯基，磷酰基或其它官能团与其相连。天然存在在阿拉伯胶末端糖苷上的羧基可通过碳化二亚胺或其它试剂与其它分子连接。胺衍生物可通过各种反应与治疗剂相连。另外，萄聚糖和聚-L-赖氨酸可连接到阿拉伯胶载体上，以增加治疗剂的连接位点数目。衍生物可以任何方式制备只要能保留无唾液酸糖蛋白受体的识别性。
我们惊奇地发现阿拉伯胶可允许很大程度的修饰，仍保持与RME受体结合的亲和性。这与我们上面报道的对阿拉伯半乳聚糖的发现一致。阿拉伯胶允许修饰且仍保留其生物活性的能力使得它可作为很多用于靶向传递的治疗剂的载体。图2表示的是阿拉伯胶的结构。
2.甘露聚糖。甘露聚糖是一类可从酵母菌的细胞壁中得到的多糖。它主要是-D-吡喃甘露糖，带有各种线状和支链结构(Gorin et al.，Vol.2“ThePolysaccharides”G.O.Aspinall，ed.，Academic Press(1983)pp.376-380)。
甘露聚糖可结合到在RES的巨噬细胞上发现的甘露糖受体上。结果连接到甘露聚糖上的治疗剂靶向传递到巨噬细胞的RME受体上进行吸收，并通过RME吞入细胞。可用RME多糖传递的治疗剂使用本发明的方法，可将各种治疗剂定向传递到特定细胞。下述实施例6和所列表3显示了如何将RME多糖及其衍生物连接到治疗剂上，制成各种可定向传递到特定细胞的分子。图3和4描绘了将治疗剂连接到载体上的两种化学方法。本发明的可连到载体上的治疗剂包括激素，甾体，维生素，核酸，酶，化学防护剂，防辐射剂，抗体和抗病毒剂。例如，连接到RME多糖上的抗病毒剂，如核苷酸和核苷类似物，可传递到含有RME受体且病毒在其中复制的细胞(肝细胞)。
Ara-AMP，一种核苷酸类似物，由于它在离靶位点较远的位点而产生较大的副作用是一个抗病毒药具有有限用途的例子。在Ara-AMP用于治疗肝炎B的研究中显示出严重的神经学副作用。(Lok et al.，J.Antimicrob.Chemother.1493-9(1984)；Hoffnagel(et al.，J.Hepatol.3S73-80(1986))。通过形成Ara-AMP-RME多糖连接，可减小治疗剂在非靶位点的不希望副作用，这是因为减少了药物在中枢神经系统的浓度并增加了药物在病毒复制的靶器官的浓度。Ara-AMP与糖蛋白结合可被无唾液酸糖蛋白受体识别(美国专利No.4,794,170)，但这类载体存在上述局限性。其它的可连接到RME多糖上以增加安全性和有效性的抗病毒治疗剂包括无糖环鸟苷，核苷类似物Ara-A和干扰素。
另一类抗病毒治疗剂是抗体和抗体同系物，包括多克隆抗体，单克隆抗体，和抗体片段。在病毒感染后，在宿主动物血中产生循环抗体并伴有细胞介导的免疫应答。但是，循环抗体一般对病毒感染无效，因为病毒在细胞内复制。例如肝炎B病毒的情况，病毒在肝的肝细胞内复制，而抗肝炎病毒抗原的抗体不能在此复制期直接连到病毒上。通过将肝炎B抗体连接到RME多糖上，并允许连接的抗体结合到无唾液酸糖蛋白受体上，受体介导的细胞内吞是有用的，抗体可进入细胞的细胞质并与病毒抗原相结合，而变为有效的治疗剂。
RME多糖或RME衍生物还可用作辐射防护剂治疗剂的载体。一种这类治疗剂，WR2721，最近被用于临床研究，确定它是否可用于保护癌症患者在辐射治疗(Kligerman et al.7th Internaitonal Conference on Chemical Moditiers of CancerTreatment，1991，Clearwater FL，pp.338-340)或化学治疗(Schein，InternationalConference on Chemical Moditiers of Cancer Treatment，1991，Clearwater FL，pp341-342)时的正常细胞。但是，最近研究表明WR2721也保护癌细胞免受辐射，这就限制了它用作化学防护剂(The Pink Sheet，Feb.3，1992，54，#5)。例如，将阿拉伯胶与WR2721相连，使辐射防护剂定向传递到具有唾液酸糖蛋白受体的细胞，即非癌性肝细胞。除了WR2721，其它自由基清除剂也可连接到RME多糖，并靶向传递到含受体的细胞。例子包括硒，黑色素，巯基乙胺衍生物，酚功能团(如6-羟基-苯并二氢呋喃-2-羧酸(如Trolox)和生育酚(如维生素E)和酶(超氧物歧化酶)。
本发明的另一方面是包含RME多糖和聚-L-赖氨酸的组合物，其中强正电荷的聚-L-赖氨酸可与一些负电荷的核酸通过Coulombic效应相吸附(Wu et al.，J.Biol.Chem.2624429-2232(1987)。例如，聚-L-赖氨酸-阿拉伯胶结合物可用作用于胃肠外给药的基因或反义寡聚核苷酸的载体。(Degols et al.，Nucleic Acids Res.179341-50(1989))。将核酸靶向传递到细胞可用于治疗遗传缺陷病，如肝中肝酶的缺乏。在这种情况下，DNA可传递到肝用以逆转遗传缺陷。除了聚-L-赖氨酸，其它多聚分子，如糊精，葡聚糖，或白蛋白也可连接到RME多糖上。
在实施例1中，合成了阿拉伯半乳聚糖胶体作为铁的载体，并经RME受体将铁定向传递到肝细胞。常用胃肠道外给药以称为右旋糖酐铁的铁氧化物葡聚糖复合物的形式提供铁治疗贫血。铁氧化物葡聚糖在血中被RES慢慢清除。由于右旋糖酐铁在体内被细胞非特异性吸收，因此显示出有产生不利反应的倾向(Hamstra et al.，243JAMA(1980)pp.1726-1731)。与之对比，将铁氧化物连接到载体阿拉伯半乳聚糖上(参见实施例1)，将它靶向传递到肝的肝细胞，并通过RME很快被吞入细胞(Menz et al，WO 90/1295)。
在本发明的另一方面，维生素被传递到特异的RME细胞。实施例3描述了甲酰四氢叶酸阿拉伯半乳聚糖结合物的制备，它可将维生素甲酰四氢叶酸通过RME传递到肝细胞。一个化学性质与甲酰四氢叶酸相似的药物的例子是氨甲蝶呤，与甲酰四氢叶酸相似，可按实施例3描述的方法进行少量修饰将氨甲蝶呤连接到阿拉伯半乳聚糖上。
实施例5和6描述了靶向传递两个甾体激素-雌激素和氢化泼尼松到特定细胞的RME受体。也可依此方式进行有效地传递的其它甾体包括糖皮质甾体激素。靶向传递甾体到特定细胞在各种疾病的治疗中都有较大意义的应用。(Martin，C.R.，“Text book of Endocrine Physiology”，Williams & Wilkins(1976)p.21)。依照本发明的实施方案，除了RME多糖-阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯胶，甘露聚糖也已用于将甾体靶向传递到靶细胞的RME受体。
表3治疗剂， RME多糖和受体实施例治疗剂/疾病 RME多糖 受体/靶细胞1 铁氧化物/贫血阿拉伯半乳聚糖 无唾液酸糖蛋白/肝细胞2 铁氧化物/贫血阿拉伯胶无唾液酸糖蛋白/肝细胞3 甲酰四氢叶酸/化学防护阿拉伯半乳聚糖 无唾液酸糖蛋白/肝细胞4 甲酰四氢叶酸/化学防护阿拉伯胶无唾液酸糖蛋白/肝细胞5 甾体/抗炎阿拉伯半乳聚糖 无唾液酸糖蛋白/肝细胞6 甾体/调节蛋白合成阿拉伯胶无唾液酸糖蛋白/肝细胞7 ara AMP/抗病毒 阿拉伯胶无唾液酸糖蛋白/肝细胞8 ara AMP/抗病毒 阿拉伯半乳聚糖衍生物无唾液酸糖蛋白/肝细胞9 N-乙酰-L-半胱氨酸/化学防护 阿拉伯胶无唾液酸糖蛋白/肝细胞& acetominophen中毒10甾体/抗炎甘露聚糖RME受体/巨噬细胞实施例实施例1阿拉伯半乳聚糖铁氧化物胶体本实施例描述用阿拉伯半乳聚糖包被的铁氧化物胶体的制备方法，以及靶向传递铁到肝细胞，并用于治疗缺铁症。按WO 90/01295的实施例6.10.1描述的方法制备阿拉伯半乳聚糖包被的超顺磁(或顺磁)铁氧化物。将FeCl3水溶液(15.8g，58.5mole)和FeCl24H2O(6.24g，31.6mmole)通过0.22微米的滤器过滤除去大的碎屑。将等体积的铁盐和从落叶松木得到的阿拉伯半乳聚糖(60g，Sigma Chemical Co.)的溶液在蒸馏水中(120ml)于室温下混合并充分搅拌。将30％氢氧化铵水溶液加入混合物，要缓慢滴加，直到pH达到约10。将混合物加热至约90-100℃，保持15分钟。将混合物冷却，并通过以0.80，0.45和0.22递减的多孔微米过滤器过滤。
过量的阿拉伯半乳聚糖用超滤法除去，使用2升的具有300千道尔顿切割量的中空纤维装置(Amicon，Inc.，Danvers，MA)。前一步的过滤产物加入超过滤装置中并加入25mM柠檬酸钠(pH8.5)缓冲液洗涤。重复洗涤5次或直到观察到澄清的洗脱液。然后将洗涤产物浓缩至开始的多糖加金属溶液的体积。
发现阿拉伯半乳聚糖包被的铁胶体被肝的无唾液酸糖蛋白受体清除，而且注入的铁在肝内，而不是在脾内被识别。这证明铁被成功地靶向传递到了肝细胞。对于连接到阿拉伯半乳聚糖上的铁对比剂(诊断试剂)经无唾液酸糖蛋白受体特异吸收的数据，可参见Menz et al.，PCT WO 90/01295的表V，这里引作参考。
使用59Fe合成包被的氧化物胶体来证明阿拉伯半乳聚糖包被的铁氧化物用于治疗缺铁性贫血的治疗潜力。经过几天，标记的铁进入正常形式的身体铁源如含铁的血红蛋白。通过这种方式，阿拉伯半乳聚糖包被的铁氧化物可用作治疗剂用于治疗缺铁性贫血。实施例2阿拉伯胶铁氧化物胶体此实施例描述由阿拉伯胶包被的铁氧化物胶体的制备方法，它可用于将铁靶向传递到肝细胞，并用于治疗缺铁症。
下面例子中使用的阿拉伯胶购自Sigma Chemicals，且具有由供应商确定的分子量约250,000道尔顿。将阿拉伯胶溶于水，并用#54 Whatman滤纸过滤，再用0.8μm过滤器过滤以除去微粒重杂质。过滤后的材料用排阻分子量为100,00道尔顿的膜超滤5次，以除去低分子量杂质。残余物用0.2μm的过滤器过滤，以制得无菌溶液，然后冷冻干燥。
将1.5ml溶于0.1N HCl中的0.93M氯化铁和1.5ml溶于0.1N HCl中的3.14M氯化亚铁溶液加入到溶于去离子水的30ml 50％(W/V)阿拉伯胶溶液中。加入40ml30％(W/V)氢氧化铵溶液时，形成黑色沉淀。将沉淀的溶液置于沸水浴中30分钟，冷却至室温，并使之通过标准的0.22μm滤器。滤液用0.1μm中空纤维滤器透析，除去未与阿拉伯胶包裹的磁性颗粒结合的物质。磁性胶体含有以此方式形成的阿拉伯胶包被的磁性颗粒，它的磁感应为45,400×106c.s.g.。实施例3甲酰四氢叶酸连接到阿拉伯半乳聚糖。
甲酰四氢叶酸是一种维生素，下面描述的是将它连接到RME-多糖阿拉伯半乳聚糖上。氨甲蝶呤是甲酰四氢叶酸的拮抗剂并是抗癌药。通过修饰下面描述的甲酰四氢叶酸的化学性质，将氨甲蝶呤接到RME-多糖上并用于药物传递。
将甲酰四氢叶酸二水化物(6.0mg，13μmol)悬浮于H2O(1mL)中。加入NaOH(0.10N，7滴)直到白色固体甲氨四氢叶酸几乎全部溶解。加入纯化的阿拉伯半乳聚糖(20,000道尔顿，35.3mg)，然后再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(51.2mg，286μmol)。在室温搅拌2.5小时后，反应混合物用HPLP分析，使用Sephadex G-25柱(9.5×300mm)，洗脱液为0.05％NaN3(0.33mL/min)。使用UV检测仪，在280nm(对于甲酰四氢叶酸，UVmax＝283nm)检测游离的和结合的甲酰四氢叶酸。色谱显示在保留时间为16.8min有一个峰，这是因为叶酸盐连接到了阿拉伯半乳聚糖上。游离的甲酰四氢叶酸在35min出现。这个分配是从阿拉伯半乳聚糖和甲酰四氢叶酸的色谱分析得到的。纯化的阿拉伯半乳聚糖需要折射率检测仪，因为它在280nm无吸收。由UV检测可知，37％的甲酰四氢叶酸连到了阿拉伯半乳聚糖上。基于无损失的阿拉伯半乳聚糖和37％的叶酸盐结合，得到叶酸盐/阿拉伯半乳聚糖的比例是3∶1。实施例4，将氨甲四氢叶酸连接到阿拉伯胶衍生物上。
甲酰四氢叶酸是一种化学防护性治疗剂，当它靶向传递到需要进行化学防护的细胞时，其效能会增加。在此实施例中一种叫氨基阿拉伯胶的阿拉伯胶衍生物用作RME多糖。因此可说明用衍生物提供连接治疗剂的位点。
制备氨基阿拉伯胶。将亚乙基二酰胺(5g)溶于10ml DI水中。阿拉伯胶(5g)溶于25ml DI水中。将两溶液混合，并用6N HCl将pH调至6～6.5之间。加入3-乙基碳化二亚胺盐酸化物(EDAC，7.5g)并搅拌直至溶解。向反应液中加入四亚乙基二胺(25ml)并将pH调至6.5。混合物在室温搅拌过夜。溶液用40升水透析，换水4次。用茚三酮分析衍化的程度。结果显示300mole胺/mole阿拉伯胶，mole/mole。
连接到甲酰四氢叶酸上。将甲酰四氢叶酸(25mg)溶于1ml甲酰胺。向其中加入5μl的氯甲酸乙酯和7.5μl的TEA。反应持续30分钟。将氨基阿拉伯胶(200mg)溶于4ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH9.0)中，并将此溶液涡旋。经数分钟将活化的甲酰四氢叶酸逐滴加入氨基阿拉伯肿中。反应在室温持续过夜。使任何沉淀重新悬浮，并将反应混合物用PD-10柱(Pharmacia)分级分离，从未反应的甲酰四氢叶酸中分离出结合产物。向每100μl的级分中加入磷酸盐缓冲液。通过测定结合的甲酰四氢叶酸在330nm的吸收度来检测其结合程度。结果表明衍生程度为62.5分子甲酰四氢叶酸/每分子氨基阿拉伯胶。实施例5将甾体连接到阿拉伯半乳聚糖-DPTA上。
甾体是一类可将其连接到RME多糖上并可被传递到细胞中的药物。下面给出了使用化学方法将各种甾体连接到阿拉伯半乳聚糖的例子。步骤包括(i)与DTPA反应制备具有羧基的多糖连接物，和(ii)将甾体通过羧基与DTPA-多糖相连接。
制备阿拉伯半乳聚糖-DTPA在60℃，将纯化的阿拉伯半乳聚糖(23,000道尔顿，0.50g，21.7μmol)和二亚乙基-三胺五乙酸(DTPA)二酐(0.102g，285μmol)溶于DMSO(20mL)。1小时后，将澄清的溶液冷却至室温。加入H2O(10ml)，形成白色沉淀。混合物用Amicon YM5超滤膜(5,000道尔顿排阻)过滤，并用H2O(4×30ml)洗涤。留在膜上的产物溶于H2O(10ml)中，冷冻干燥。得到白色粉末0.44g。名义上的DTPA/阿拉伯半乳聚糖比为13∶1，假定加入的所有的DTPA量全部连接(DTPA的名义分子量28,000道尔顿)。
将6-甲基泼尼松龙连接到阿拉伯半乳聚糖-DTPA上。在60℃将阿拉伯半乳聚糖-DTPA(107.5mg，3.8μmole)和6-甲基泼尼松龙(64.5mg，172μmol)溶于DMSO(15ml)中。加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(259mg，1.45mmol)并将反应混合物在60℃搅拌1小时。HPLC分析(Sephadex G-10柱，9.5×300mm，洗脱剂为0.05％NaN3，0.50ml/min，280nm UV检测)，反应混合物在10.5分钟保留时间处只有一个单峰，与阿拉伯半乳聚糖-DTPA结合物的动态相应。在19.5分钟时处未观测到6-甲基泼尼松龙的峰，表明甾体全部连接(通过酯化)到阿拉伯半乳聚糖-DTPA结合物上。加入H2O(10ml)后，反应混合物用Amicon YM3(3,000道尔顿排阻)超滤，用H2O(3×30ml)洗涤。滤液含有未反应的甾体，碳化二亚胺，痕量的DTPA和其它低分子量物质。HPLC分析滤液证明无游离的甾体。将H2O(10ml)加入截留物，并将产物冷冻干燥。得到灰白色粉末0.10g。实施例6将雌二醇连接到氨基阿拉伯胶上下面给出可将不同的甾体连接到阿拉伯胶的化学方法的例子。
将25mg§-雌二醇3-羧甲基醚(雌二醇3-CME)溶于DMF(1ml)。向其中加入氯甲酸乙酯(5μl)和TEA(7.5μl)。将氨基阿拉伯胶(参见实施例4，100mg)溶于甲酰胺(2ml)中，并稍微加热。涡旋氨基阿拉伯胶，经数分钟逐滴加入活化的雌二醇3-CME。使用去离子水饱和的PD10-柱将结合的物质与未反应的雌二醇3-CME分离。向100μl的各馏分中加入去离子水(1ml)，确定在277nm的吸收与标准曲线对比来检测衍化的程度。结果显示每分子氨基阿拉伯胶有18.2个雌二醇。实施例7将腺嘌呤单磷酸酯(AMP)连接到氨基阿拉伯胶上此实施例证明将核苷酸或核苷类似物连到阿拉伯胶上，用于靶向传递到肝。在下面的方法中，包括araAMP的任何核苷酸都可连接到阿拉伯胶上，araAMP用作抗病毒剂在治疗肝炎中使用(参见上述表1)。
将氨基阿拉伯胶(100mg)(参见实施例4)溶于1ml去离子水中。向阿拉伯胶溶液中加入AMP(100mg)和四亚乙基二胺(500μl)。加入氢氧化钠(2N)以使pH增加到6.5。加入EDAC(100mg)，并调节pH到6.5。将溶液在37℃反应过夜。使用PD-10柱(Pharmacia)将结合物从未反应的AMP中分离出来，而且100μl的各馏分用1ml磷酸盐缓冲液稀释。通过260nm的吸收值测定结合的AMP的量来测定衍化的程度。实施例8将AraAMP连接到阿拉伯半乳聚糖衍生物上本实施例证明将治疗剂连接到阿拉伯半乳聚糖的水解产物上。阿拉伯半乳聚糖的这种修饰不影响该多糖与肝细胞上的RME无唾液酸糖蛋白受体之间的相互作用的能力。
制备阿拉伯半乳聚糖水解产物。将阿拉伯半乳聚糖(100g)溶于37℃水中制得20％溶液。在另一容器中，NaOH(200g)溶于37℃水(5L)中。将硼氢化钠(20g)溶于该NaOH溶液中，然后将阿拉伯半乳聚糖溶液加入此溶液。再向反应液中加入20g硼氢化钠，反应混合物在37℃搅拌15min，通过加入4℃的冷浓HCl将混合物调节至pH8.6。
1.溶液用排阻分子量3000道尔顿的透析管彻底透析。透析液用0.22微米过滤器过滤，并冷冻干燥得到阿拉伯半乳聚糖水解产物，为白色结晶固体。分子排阻层析法显示具有单一组分，且平均分子量为8kDa。
制备羧甲基阿拉伯半乳聚糖(8kDa)的水解产物。将50g阿拉伯半乳聚糖(8kDa)水解产物溶于200ml水。向此溶液加入1mole NaOH，然后加入溴乙酸(70-275mmoles)。反应在30℃进行90分钟。反应结束后，加入6N HCl中和溶液。使用合适的滤器充分超滤进行产物纯化，然后冷冻干燥。羧甲基的掺入是每克1毫克当量。
连接治疗剂。将araAMP连接到8kDa的羧甲基阿拉伯半乳聚糖水解产物上要分两步进行。向亚乙基二胺(2.5ml)，腺苷-5-单磷酸酯(10g)，和1-羟基苯并三唑(HOBt，3.7g)的混合物中，在40℃分4次经3.5小时加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC，15g)。真空除去水，产物用50ml 2∶1的(H3CN/MeHO研磨。固体用100ml乙腈洗涤，在50℃真空干燥。使固体通过2.5cm×25cm含有100ml湿体积的Amberlite IR-120(Na型)的离子交换树脂柱。合并得到的产物亚乙基二胺-araAMP(en-araAMP，首先是250ml)部分，在真空除去水。产物再用2∶1的丙酮/MeOH研磨，用100ml丙酮洗涤。产物在50℃真空下干燥2小时，产量8.2g。
为将en-ARA-AMP连接到羰甲基阿拉伯半乳聚糖上，将10g(1mEq/gCOOH)的8kDa的羧甲基阿拉伯半乳聚糖水解产物加入到350ml广口瓶中，瓶中含有20ml的四亚乙基二胺/HCl缓冲液(4.0g，0.5M，pH7.5)，再向其中加入HoBt1.37g和en-araAMP 8.2g。将混合物加热至40℃然后于室温搅拌过夜。当所有固体都溶解后，分3次经6小时加入EDC 7.6g。粗混合物用水稀释10倍，并用3K的滤器超滤。重复用蒸馏水洗涤后，冻冷干燥产物得到白色固体。产量12g产物带有0.50mmolaraAMP/g；阿拉伯半乳聚糖水解产物上的羧基位点约有63％的被衍化。实施例9将N-乙酰基-L-半胱氨酸连接到氨基阿拉伯胶上本实施例描述将化学防护剂连接到阿拉伯胶衍生物上。N-乙酰基-L-半胱氨酸是一种氨基酸，可用作化学防护剂和肝对乙酰氨基酚中毒的解毒剂。
将N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，120mg)溶于1ml甲酰氨中。向其中加入12μl氯甲酸乙酯和20μ1三乙胺(TEA)，使反应持续30分钟。将氨基阿拉伯胶(200mg)(参见实施例4)溶于4ml(50mg/ml)0.1M磷酸盐缓冲液中，pH9.0。将此溶液涡旋，并将活化的NAC经数分钟逐滴加入。反应在室温进行1小时。使溶液通过PD-10柱(Pharmacia)使结合的NAC从未反应的NAC中分离出来。用5，5′-二硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)分析巯基来测定衍化程度。50微升的各馏分用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7)稀释到1ml，并加入50μl的10mM的DTNB。DTNB与巯基残基反应产生的颜色，在430nm测定。结果显示每分子氨基阿拉伯胶有100分子的半胱氨酸。实施例10将治疗剂连接到甘露聚糖上用甘露聚糖代替阿拉伯半乳聚糖，按实施例5的方法将甘露聚糖与治疗剂相连。
权利要求
1.一种定向传递治疗剂到特定细胞的方法，包括(i)给患者服用有效剂量的复合物，其中复合物含有连接到受体介导的细胞内吞的(RME)多糖上的治疗剂；和(ii)使复合物结合到靶细胞的RME受体上以使治疗剂融入靶细胞。
2.按照权利要求1的方法，其中步骤(i)中RME多糖是天然存在的。
3.按照权利要求2的方法，其中RME多糖是被化学修饰的。
4.按照权利要求2的方法，其中RME多糖是阿拉伯胶。
5.按照权利要求2的方法，其中RME多糖是阿拉伯半乳聚糖。
6.按照权利要求2的方法，其中RME多糖是甘露聚糖。
7.按照权利要求1的方法，其中治疗剂选自激素，甾体，核酸，抗体，维生素，抗病毒剂，酶，化学防护剂和辐射防护剂。
8.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是抗病毒剂。
9.按照权利要求8的方法，其中抗病毒剂是araAMP。
10.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是抗体。
11.按照权利要求10的方法，其中抗体选自单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段和抗体类似物。
12.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是激素。
13.按照权利要求12的方法，其中激素选自6-甲基泼尼松龙，皮质甾体和雌激素。
14.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是维生素。
15.按照权利要求14的方法，其中维生素是甲酰四氢叶酸。
16.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是氨甲蝶呤。
17.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是干扰素。
18.按照权利要求1的方法，其中治疗剂是含铁的化合物。
19.按照权利要求18的方法，其中含铁化合物是铁氧化物胶体。
20.按照权利要求1的方法，其中RME细胞受体是无唾液酸糖蛋白受体。
21.按照权利要求1的方法，其中RME细胞受体是甘露糖受体。
22.一种载体，含有阿拉伯半乳聚糖，在还原剂存在下用碱溶液处理，得到的水解产物可与RME受体结合，且当与治疗剂连接时可将治疗剂传递到具有RME受体的靶细胞。
23.按照权利要求22的载体，其中碱溶液具有大于8.0的pH值。
24.按照权利要求23的载体，其中还原剂是硼氢化物盐。
25.按照权利要求24的载体，其中水解的阿拉伯半乳聚糖产物具有约为8Kd的分子量。
26.一种载体，含有含有具有多个羧甲基官能团以结合治疗剂的多糖，羧甲基化的多糖可将治疗剂传递到具有RME受体的靶细胞。
27.按照权利要求26的载体，其中多糖是羧甲基化的阿拉伯半乳聚糖。
28.按照权利要求26的载体，其中多糖上的羧甲基官能团可与治疗剂上的氨基磷酸酯基团连接。
29.按照权利要求28的载体，其中多糖是阿拉伯半乳聚糖。
30.一种载体，可连接治疗剂用以将其传递到在靶组织上的RME细胞受体，含有一种多糖，该多糖在位点被官能残基修饰以产生衍生物，使衍生物具有对细胞受体的有利的亲和力，其中官能残基选自磷酰基，巯基，氨基，卤素，acyamidizole，羧基，葡聚糖，聚-L-赖氨酸，糊精和白蛋白，所述衍生物允许治疗剂进一步连接到衍生物上的反应。
31.一种药物组合物，含有一种多糖载体，该多糖载体由官能残基修饰产生衍生物，使其具有与RME细胞受体的亲和力；和一种治疗剂，它连接在载体上以便有效地传递到靶组织的细胞受体上。
32.按照权利要求31的药物组合物，其中RME多糖选自甘露聚糖，岩藻多糖，和阿拉伯胶。
33.按照权利要求31的药物组合物，其中官能残基选自氨基，羧基，巯基，磷酰基，葡聚糖，聚-L-赖氨酸，糊精和白蛋白。
34.按照权利要求31的药物组合物，其中治疗剂共价连接到载体上。
35.按照权利要求31的药物组合物，其中治疗剂选自激素，甾体，维生素，核酸，辐射防护剂，抗体，和抗病毒剂。
36.按照权利要求35的药物组合物，其中抗病毒剂是araAMP。
37.按照权利要求34的药物组合物，其中载体具有多个羧甲基官能团，适于共价连接治疗剂。
38.按照权利要求37的药物组合物，其中载体通过氨基磷酸酯键与治疗剂共价连接。
39.按照权利要求37的药物组合物，其中载体通过亚乙基二胺键与治疗剂共价连接。
40.按照权利要求38的药物组合物，其中多糖是阿拉伯半乳聚糖。
41.按照权利要求39的组合物，其中治疗剂是ara-AMP。
42.按照权利要求40的组合物，其中治疗剂是ara-AMP。
43.一种制备用于靶向释治疗剂到特定细胞的载体的方法，包括(a)提供阿拉伯半乳聚糖；(b)水解阿拉伯半乳聚糖到预定的大小；和(c)基本纯化水解的阿拉伯半乳聚糖。
44.按照权利要求43的方法，其中步骤(b)中进一步包含在还原剂存在下在碱溶液中水解阿拉伯半乳聚糖。
45.按照权利要求44的方法，其中还原剂是硼氢化物盐。
46.按照权利要求44的方法，其中硼氢化物盐选自硼氢化钠和氰基硼氢化钠。
47.按照权利要求46的方法，进一步包括(d)用化学试剂修饰水解的阿拉伯半乳聚糖形成衍生物，此衍生物具有与RME细胞受体的亲和力。
48.按照权利要求47的方法，其中在步骤(d)中的化学试剂是溴代羧酸。
49.按照权利要求48的方法，其中溴代羧酸是溴乙酸。
全文摘要
本发明涉及将治疗剂靶向传递到特定细胞的方法，其中治疗剂与融合细胞受体反应的多糖相联形成复合物，给患者服用复合物，使能治疗剂能按已知的复合体介导进入细胞(RME)的方式进行特定细胞，多糖可以是，例如，阿拉伯半乳聚糖，阿拉伯胶，甘露聚糖或它们的水解产物，治疗剂可以是，例如，抗病毒剂，核酸，激素，甾体，抗体，化学防护剂或辐射防护剂。细胞受体可以是，例如，无唾液酸糖蛋白受体或甘露糖受体。
文档编号C08J9/14GK1150761SQ95193606
公开日1997年5月28日 申请日期1995年6月7日 优先权日1994年6月16日
发明者尔奈斯特·V·哥尔曼, 爱德华·T·门兹, 非利甫·M·恩尔奎兹, 吉尔姆·M·路易斯, 张超华, 李·约瑟夫森 申请人:先锋磁力公司