本发明属于基因工程领域，具体涉及到耐热酸性木聚糖酶的基因优化序列以及含有优化序列的重组表达载体和重组宿主细胞，本发明进一步涉及它们在生产耐热酸性木聚糖酶中的应用。
背景技术
木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，为植物细胞壁中半纤维素的主要组分，占植物细胞干重的30％，是一种丰富的生物多糖资源，在自然界中含量仅次于纤维素。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中的一种关键酶，它以内切的方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键，其水解产物有木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖等单糖。
现今木聚糖酶已成功应用于饲料、食品、医药、造纸等工业中。例如：木聚糖酶较早应用于饲料行业中，因木聚糖是饲料中的典型抗营养因子，由于木聚糖的持水性、小分子吸附和表面活性，如果饲料中含有较多的木聚糖会对单胃或无胃动物形成抗营养作用，尤其是大麦、小麦、麸皮和米糠等木聚糖含量很高的饲料更加突出。在这类高木聚糖含量饲料中添加木聚糖酶可以有效解除木聚糖的抗营养作用。其对木聚糖抗营养作用的解除机制主要有：破坏植物细胞壁结构，促进饲料营养成分的释放；降低胃肠道食糜粘度，提高养分的吸收和转化效率；促进动物内源性消化酶的分泌，使饲料的表观代谢能得以增加；改善胃肠道的微生态环境。
在饲料制粒过程中需要经历短暂的高温处理，另外家畜家禽类动物胃肠道是偏酸性环境，本发明涉及的木聚糖酶既能经历高温处理而保持较高残留酶活，又能在偏酸性的动物消化道内体现较高的催化活力，因此特别适合在饲料工业使用，具有很好的应用前景。
木聚糖酶产业发展现阶段必须克服的问题是怎样降低它的生产成本提高它的产量。为解决这个问题，人们尝试通过诱变野生菌选育高产菌、利用基因工程手段构建重组工程菌、培养条件的优化等等一些列手段来提高木聚糖酶的产量。
目前，我国各企业使用的优良木聚糖酶生产菌株依然依赖于国外技术，难以实现核心技术的国产化，使企业的生产成本增加。随着我国畜牧业的现代化水平越来越高，动物营养越来越受到重视、作为重要的饲料添加剂、木聚糖酶的需求也越来越大，尤其是对于产量高、热稳定性好、性质优良以及酶活性高的木聚糖酶制剂的需求也越来越大。随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术已对来源于微生物的多种木聚糖酶基因进行了克隆测序，对木聚糖酶基因的结构、功能以及调控表达等方面有了较为深入的了解。随着分子生物学技术的深入研究，利用一些高效微生物菌株来生产优良性质的木聚糖酶已经成为一种新的有效途径。各国研究专家已经从各种不同微生物中筛选出了大量的具有优良性质的木聚糖酶基因，这些木聚糖酶拥有不同的性质，如高比活、耐热、耐低温、耐酸等。为了提高这些木聚糖酶的生产水平，有研究者将这些木聚糖酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等宿主菌中进行异源重组表达。研究显示，对于真菌来源的木聚糖酶，毕赤酵母作为真核细胞宿主对表达蛋白能够进行糖基化修饰，因此是真菌来源木聚糖酶理想的异源表达宿主。来源于黑曲霉的木聚糖酶耐热性较好，并且在酸性环境下有较高活力，对耐热酸性木聚糖酶进行优化改造，得到能在毕赤酵母中分泌表达量有显著提高的木聚糖酶优化基因，具有巨大的应用价值。
技术实现要素：
本发明目的之一是提供一种经过优化改造的高表达的耐热酸性木聚糖酶基因序列，该耐热酸性木聚糖酶优化基因在宿主细胞中，尤其是毕赤酵母宿主细胞中的分泌表达量高。
本发明目的之二是提供含有该高表达的耐热酸性木聚糖酶优化基因序列的重组表达载体。
本发明目的之三是提供所述高表达的耐热酸性木聚糖酶优化基因的重组表达载体的重组宿主细胞。
本发明目的之四是提供上述基因或者重组载体或者重组宿主细胞应用于耐热酸性木聚糖酶的生产。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明对耐热酸性木聚糖酶xynzn的基因序列进行了优化，在不改变其编码蛋白质氨基酸序列的情况下，综合考虑密码子偏好性，宿主密码子频率，问题密码子的删除，mrna二级结构等因素，对xynzn基因序列进行优化，优化后的基因xynznop如seqidno.1所示。
本发明另一方面提供了含有所述耐热酸性木聚糖酶的优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重组酵母表达载体，最优选为重组毕赤酵母表达载体。
所述的重组真核表达载体中空白载体来源于商用的pgapzαa、pgapzαb、pgapzαc三种载体中的任一种，或者商用的ppiczzαa、ppiczzαb和ppiczzαc三种载体中的任一种，或者ppic9k，或者ppic3.5k。
所述的重组真核表达载体中空白载体优选来源于商用的组成型载体pgapzαa、pgapzαb、pgapzαc三种载体中的任一种，或者商用的诱导型载体ppiczzαa、ppiczzαb和ppiczzαc三种载体中的任一种。
将所述耐热酸性木聚糖酶优化基因可操作性的与酵母的表达调控序列相连就可得到在酵母细胞中分泌表达耐热酸性木聚糖酶的重组酵母表达载体；为了达到更好的分泌表达效果，本发明优选将所述耐热酸性木聚糖酶优化基因可操作性的与毕赤酵母的表达调控序列相连得到能够在毕赤酵母细胞中分泌表达重组耐热酸性木聚糖酶的重组毕赤酵母表达载体。
当选用空白载体为组成型载体时，所述的高表达的耐热酸性木聚糖酶基因在重组载体中位于α分泌引导肽基因序列下游，优选将高表达的耐热酸性木聚糖酶基因序列插入到组成型载体中的xhoi和xbai限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于gap启动子下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pgapzα-xynznop；
当选用空白载体为诱导型载体时，所述的高表达的耐热酸性木聚糖酶基因在重组载体中位于α分泌引导肽基因序列下游，优选将高表达的耐热酸性木聚糖酶基因序列插入到诱导型载体中的xhoi和xbai限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox1启动子下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppiczα-xynznop。
本发明还提供了一种耐热酸性木聚糖酶优化基因的应用方法，即高效表达耐热酸性木聚糖酶。具体包括将所述的耐热酸性木聚糖酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株培养重组菌株，重组耐热酸性木聚糖酶以组成型或诱导型的方式表达，过滤除菌后，得到耐热酸性木聚糖酶。上述方法中，所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体，最优选为pgapzαa和ppiczαa重组表达载体，所述的宿主细胞优选为酵母，更优选为毕赤酵母细胞。
本发明的效果在于：本发明对耐热酸性木聚糖酶基因的密码子进行优化。本发明验证了密码子优化的效果，以pgapzαa(组成型)和ppiczαa(诱导型)真核表达载体为例，将未优化的xynzn基因和优化后的xynznop基因分别装入pgapzαa(组成型)和ppiczαa(诱导型)真核表达载体中，并转入毕赤酵母x-33，经高拷贝筛选，得到每种组合产酶能力最高的菌株。发酵实验结果表明，在载体pgapzαa的组成型启动子gap的调控下，耐热酸性木聚糖酶基因优化后的表达水平较未优化基因提高52.0％，发酵液上清耐热酸性木聚糖酶活力达到2883.86u/ml，在载体ppiczαa的诱导型启动子aox1的调控下，耐热酸性木聚糖酶基因优化后的表达水平较未优化基因提高46.3％，发酵液上清耐热酸性木聚糖酶活力达到4066.24u/ml。而且木聚糖酶的耐高温和耐酸性能没有受到影响。
附图说明
图1：本发明耐热酸性木聚糖酶基因优化前后的密码子适应指数(codonadaptationindex：cai)比较；
图2：本发明耐热酸性木聚糖酶基因优化前后的密码子频率分布(codonfrequencydistribution：cfd)比较；
图3：本发明涉及的耐热酸性木聚糖酶基因pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测图片，泳道m：dl2000plusdnamarker(vazymebiotechco.,ltd)，泳道1：未优化的xynzn基因，泳道2：优化后的xynznop基因；
图4：包含优化后的xynznop基因的组成型毕赤酵母表达载体pgapzα-xynznop示意图；
图5：包含优化后的xynzn基因的甲醇诱导型毕赤酵母表达载体ppiczα-xynznop示意图；
图6：包含组成型载体的重组毕赤酵母表达优化前xynzn基因和优化后xynznop基因所产酶活性比较图；
图7：包含甲醇诱导型载体的重组毕赤酵母表达优化前xynzn基因和优化后xynznop基因所产酶活性比较图；
图8：反应ph对重组木聚糖酶活性的影响，(a)xynzn；(b)xynznop；
图9：重组木聚糖酶的ph稳定性(相应ph孵育2h)，(a)xynzn；(b)xynznop；
图10：反应温度对重组木聚糖酶活性的影响，(a)xynzn；(b)xynznop；
图11：重组木聚糖酶的热稳定性(相应温度孵育5min)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、耐热酸性木聚糖酶基因的优化设计及合成
1、实验材料及来源
黑曲霉，由发明人本实验室保存；
优化基因片段由南京金斯瑞生物科技公司合成。
2、耐热酸性木聚糖酶基因的优化设计
本发明首先对从黑曲霉(aspergillusniger，本实验保藏)中克隆获得的耐热酸性木聚糖酶野生型基因xynzn的序列进行分析，在不改变基因编码氨基酸序列的前提下，对耐热酸性木聚糖酶基因序列进行改造，并在序列上屏蔽了限制性酶切位点xhoi和xbai，在序列两端添加限制性酶切位点xhoi和xbai，得到的优化后的耐热酸性木聚糖酶基因命名为xynznop。
结果：
优化后的序列与原始序列相比，如表1所示，共有24％的碱基被优化。如(图1)所示，密码子适应指数(codonadaptationindex：cai)由未优化前的0.66提高至优化后的0.97，cai值定义的范围在0～1之间，如果越高则表明相应宿主中该基因的密码子偏好性越强。如(图2)所示，基因优化使密码子频率分布也发生了变化，序列中所有的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，使用频率在91％到100％之间的高频密码子占优化后总序列的87％，而优化前这些高频密码子仅占总序列的37％。
xynznop优化基因序列表1
(其中竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应的碱基不同)
实施例二、优化的耐热酸性木聚糖酶基因的高效表达
1、实验材料及来源
表达载体pgapzαa和ppiczαa和毕赤酵母菌株x-33为invitrogen公司产品；
ypd液体培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
yps液体培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
ypds琼脂培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，0.1m山梨醇，2％琼脂粉。
2、表达载体pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop的构建
(1)将实施一中测序正确的含有xynznop的质粒用xhoi和xbai限制性内切酶消化，得到的较小片段即为包含xhoi和xbai粘性末端的xynznop序列，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应片段。
(2)将表达载体pgapzαa和ppiczαa用xhoi和xbai限制性内切酶消化，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应片段，将(1)中处理好的包含xhoi和xbai粘性末端的xynznop序列与载体pgapzαa和ppiczαa分别使用t4dna连接酶(thermofisherscientific，catalognumber：el0011)按照说明书的相关方法进行连接反应。
(3)连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，取适量细胞涂布于含有博莱霉素(zeocin，thermofisherscientific)的平板，37℃过夜培养，用菌落pcr法筛选阳性转化子并进行测序验证，将测序正确的重组质粒分别命名为pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop。
(4)按上述同样的方法构建未优化的耐热酸性木聚糖酶xynzn基因重组质粒pgapzα-xynzn和ppiczα-xynzn。
3、耐热酸性木聚糖酶表达菌株的制备、发酵培养与高活力转化子的筛选
(1)大量提取重组质粒pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop，获得20μg以上的质粒基因，经过bglii限制性内切酶线性化处理后，采用氯仿/苯酚抽提法纯化并浓缩线性化后的质粒，使产物的质粒浓度达到1μg/μl以上。
(2)制备毕赤酵母x-33感受态细胞，方法参照invitrogen毕赤酵母操作手册。
(3)将纯化后的pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop线性化产物电击转入毕赤酵母x-33，电击电压为1500v，电击时间为5ms。电击后将细胞涂布于含有400μg/ml博莱霉素的ypds琼脂平板，于30℃培养48小时，得到含有pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop的转化子。
(4)高活力转化子的筛选，方法如下：
pgapzα-xynznop组成型表达转化子微板法筛选：挑取克隆接于120μl的ypd液体培养基中(置于96孔细胞培养板中)，于28℃、300rpm过夜培养24h后取20μl培养液转接于100μl的ypd液体培养基中继续36h，培养液于5000g离心5min，上清即为耐热酸性木聚糖酶发酵粗液，测量酶活后选取高活力转化子以三个平行样重复上述培养过程，培养结束后再次测量酶活以完成复筛。
ppiczα-xynznop诱导型表达转化子微板法筛选：挑取克隆接于120μl的ypd液体培养基中(置于96孔细胞培养板中)，于28℃、300rpm过夜培养24h后取20μl培养液转接于80μl的yps液体培养基中；继续培养24h后加入20μl含3％甲醇(w/w)的yps液体培养基，诱导表达12h后再次加入20μl含3％甲醇(w/w)的yps液体培养基继续12h；培养液于5000g离心5min，上清即为耐热酸性木聚糖酶发酵粗液，测量酶活后选取高活力转化子以三个平行样重复上述培养过程，培养结束后再次测量酶活以完成复筛。
(5)按上述同样的方法构建未优化的耐热酸性木聚糖酶xynzn基因重组质粒pgapzα-xynzn和ppiczα-xynzn并转入毕赤酵母x-33筛选高活力菌株。
(6)摇瓶水平发酵培养重组菌株制备耐热酸性木聚糖酶
组成型载体pgapzαa重组菌株的筛选：将复筛后筛选到的转入pgapzα-xynzn、pgapzα-xynznop载体的木聚糖酶活力的重组菌株分别培养于10mlypd培养基中，于30℃以250rpm转速培养24h后，转接1ml培养液至50mlypd培养基中，于28℃以250rpm转速继续培养48h。取培养液于5000g离心5min得发酵粗酶液，每个样本设置三组平行实验。
甲醇诱导型载体ppiczαa重组菌株的筛选：将复筛后筛选到的转入ppiczα-xynzn、ppiczα-xynznop载体的木聚糖酶活力的重组菌株分别培养于10mlypd培养基中，于30℃以250rpm转速培养24h后，转接1ml培养液至50mlyps培养基中继续培养36h，至此开始每12h加入适量甲醇使终浓度为0.5％，连续添加4次，第4次添加后12h结束发酵。取培养液于5000g离心5min得发酵粗酶液，每个样本设置三组平行实验。
(7)摇瓶水平的酶活测量方法参照国家标准《gb/t23874-2009饲料添加剂耐热酸性木聚糖酶活力的测定》中所述的方法，96孔板初筛与复筛的方法略有改进，具体方法如下：取50μl耐热酸性木聚糖酶底物(10g/l)加入到96孔pcr板中，置于pcr仪于一定温度预热5分钟，加入50μl经适当稀释的于相同温度预热后的酶液，充分混匀后于相同温度反应30min，加入125μldns溶液，充分混匀后与95℃加热5min。取170μl上述反应液转移至96孔酶标板，采用酶标仪于540nm测量吸光度，根据读数结果计算每个样品的酶活。
由1.000g/l木糖溶液配制50-500mg/l不同浓度的木糖溶液制作木糖标准曲线，计算标准曲线方程。酶活力单位(u)的定义：在最适温度和的测定条件下，催化终浓度为的木聚糖底物溶液生成还原糖(以木糖表示)所需的酶量定义为一个酶活力单位。
(8)序列优化的耐热酸性木聚糖酶的性质变化测定
最适ph的测定：最适温度下，测定重组木聚糖酶在ph2.2-8.0的0.1m柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的酶活性。每组实验测定3个平行样。
ph稳定性的测定：在室温下预先分别将步骤(6)得到的重组木聚糖酶xynzn和xynznop酶液孵育在ph1.0-13.0的缓冲液中2h，然后测定残余木聚糖酶的活力。每组实验测定3个平行样。
最适温度的测定：在最适ph的缓冲液，采取不同温度下(20～95℃)，分别测定重组木聚糖酶xynzn和xynznop的酶活。每组实验测定3个平行样。
温度稳定性的测定：预先将重组木聚糖酶xynzn和xynznop在60-90℃下孵育0-30min,，再测定残余的木聚糖酶的活力。每组实验测定3个平行样。
结果：
一、合成序列pcr及其重组表达菌株构建结果
除去信号肽优化后的xynznop序列大小为621bp，pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，在500bp和750bp之间的位置出现特异性的条带，与理论值大小相符。将合成好的基因片段分别连入pgapzαa和ppiczαa载体，得到的载体图谱如图4、图5所示，在xhoi和xbai限制性酶切位点之间插入了xynznop序列，得到的重组载体命名为pgapzα-xynznop和ppiczα-xynznop，长度分别为4136bp和3690bp。上述载体转化毕赤酵母x-33后筛选到的高木聚糖酶活力菌株分别命名为x-33/pgapzα-xynznop和x-33/ppiczα-xynznop。
二、重组菌株产酶能力的比较
经过摇瓶发酵实验，未优化xynzn基因在gap启动子的调控下，最大发酵活力为1897.28±186.13u/ml，优化后的xynznop基因在gap启动子的调控下，最大发酵活力为2883.86±230.43u/ml，与未优化基因相比提高了52.0％；未优化xynzn基因在aox1启动子的调控下，最大发酵活力为2779.38±220.05u/ml，优化后的xynznop基因在gap启动子的调控下，最大发酵活力为4066.24±248.92u/ml，与未优化基因相比提高了46.3％。
三、序列优化的耐热酸性木聚糖酶的性质变化测定
通过对序列优化前木聚糖酶xynzn和优化后重组木聚糖酶xynznop温度和ph性质的测定，得到如下结果：(见图8-11)
重组木聚糖酶最适反应ph为5.0，ph为2.0-12.0的条件下处理2h后仍具有78％以上的酶活力，具有很宽泛的ph适应性，优化后的重组木聚糖酶xynznop与优化前木聚糖酶的ph性质无明显差异。
重组木聚糖酶最适反应温度为50℃，在45～65℃之间的相对活力达到90％以上，经过80℃高温处理5min后的残留酶活仍可达到50％以上，优化后的重组木聚糖酶xynznop与优化前的木聚糖酶温度性质无明显差异。
序列表
<110>中南大学
<120>一种高表达的耐热酸性木聚糖酶基因及其表达载体和应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>621
<212>dna
<213>黑曲霉(aspergillusniger)
<400>1
gttccccacgactctgtcgcccagcgttcggatgccttgcacatgctctctgagcgctcg60
accccgagctcgaccggcgagaacaacggcttctactactccttctggaccgacggcggt120
ggcgacgtgacctacaccaacggagatgctggtgcctacactgttgagtggtccaacgtg180
ggcaactttgtcggtggaaagggctggaaccccggaagtgcgcaggacatcacctacagc240
ggcaccttcacccctagcggcaacggctatctctccgtctatggctggaccactgacccc300
ctgatcgagtactacatcgtcgagtcctacggcgactacaaccccggcagtggaggcaca360
tacaagggcaccgtcacctcggacggatccgtttacgatatctacacggctacccgtacc420
aatgctgcttccattcagggaaccgctaccttcactcagtactggtccgtccgccagaac480
aagagagttggcggaactgttaccacctccaaccacttcaatgcttgggctaagctggga540
atgaacctgggtactcacaactaccagatcgtggctaccgagggttaccagagcagtgga600
tcttcgtccatcactgttcag621
<210>2
<211>621
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>2
gtgccgcacgacagcgttgcgcagcgtagcgatgcgctgcacatgctgagcgagcgttcc60
accccttcttctactggtgaaaacaacggattctattactcattctggactgatggtggt120
ggagatgttacctacacaaacggtgatgctggtgcttacactgttgaatggtctaacgtt180
ggtaattttgttggtggtaaaggttggaacccaggttctgctcaagatatcacttactct240
ggtacttttactccttctggtaatggttacttgtctgtttatggttggactactgatcca300
ttgatcgaatactacatcgttgaatcttacggagattataaccctggttctggtggtact360
tacaaaggtactgttacttctgatggttctgtttacgatatctacactgctactagaact420
aacgctgcttctattcaaggtactgctacttttactcaatactggtctgttagacaaaat480
aagagagttggtggtactgttactacttctaaccattttaatgcttgggctaaattgggt540
atgaacttgggtactcacaattatcaaatcgtcgctacagagggttatcaatcatcaggt600
tcatcatccatcacagttcaa621