诊断装置及相关方法与流程

本公开内容涉及一种分析液体样品的装置，和使用所述装置的诊断方法。

背景

传染性疾病每年造成超过五千六百万人死亡(每天>153000人)，而其余几十亿受影响的人患有感染后发病状态，如营养不良、身心发育不良、认知发育受损等。流行性感染如腹泻、hiv和结核(tb)占总死亡率的一半以上，需要立即医疗护理。依据世界卫生组织(who)和unicef，约20亿人患有腹泻病，且每年190万名年龄小于5岁的儿童死亡。这占所有儿童死亡的18%(每天>5000例死亡)。在2014年，报告约三千六百九十万人患有hiv，其中二百六十万人是儿童。虽然发达国家的死亡率最低，但从非洲和东南亚地区的发展中国家报道了约50-80%，在这些国家中人群缺乏良好的医疗保健设施和适当的传染性疾病诊断。

作为一个实例，tb每年影响超过9百万人，造成150万例死亡。tb的致病因子结核分枝杆菌(mtb)，一般通过获得染色体中的序列突变而产生抗性。突变的mtb菌株对至少两种主要的第一线抗-tb药物异烟肼(inh)和利福平(rif)产生抗药性，被分类为多重耐药性tb(mdr-tb)。mtb中另外的突变对大多数剩余抗生素产生广泛的抗药性(xdr-tb)，其对于诊断和治疗提出了挑战。首先，mtb通过涂片显微术检测出来，但这种技术无法识别耐药菌株。由于mtb的缓慢生长，基于培养的药物易感性测试(dst)方法既费力又耗时(数周至数月才获得正确结果)。相比之下，基于聚合酶链反应(pcr)的核酸扩增试验(naat)通过各种自动和半-自动技术，提供检测耐药性mtb菌株的快速结果。例如，基于实时pcr的genexpertmtb/rif(cepheid,sunnyvale,ca,usa)测定在不到2h内通过直接分析痰样品提供结果。genetypemtbdrplus探针-杂交测定(hainlifesciencegmbh,nehren,germany)能够平行检测多个抗性标记，但估计该系统仅分别检出95%和74%的rif和inh抗性菌株。此外，这两项试验很难在资源有限的实验室进行，因为需要训练有素的实验室人员和基础设施。因此，在资源有限的环境中，对目前可用的核酸扩增试验(naat)的仪器和技术人员的能力和要求阻碍了对mdr-tb的迅速检测。

正确和可靠地鉴定致病微生物及其引起耐药性的遗传模式仍然是一个挑战，尤其是在外围临床设置中。因此，在各种细菌感染的诊断领域中，对改进的诊断装置和方法有持续的需要。特别是，需要一种可与熟练的分子方法结合使用的简单可靠的装置，其能够应对细菌感染(例如mdr-tb)的技术以及临床检测挑战，为外围资源有限的医疗保健环境提供合适的解决方案。

意欲用于测试样品的不同类型的装置的实例公开于wo2010/079479和wo2013/163353中，其可以从一个样品靶标以顺序的方式提供一个信号。然而，这些结果是半定性的，并且不能提供确定的答案，尤其影响抗生素治疗。因此，需要更好和用户友好的装置，其能够对样品取得多个结果，并且提供确定的试验结果以开始适当的治疗，甚至从第一次临床接触时。

发明简述

本公开内容的一个目的是提供一种分析包含扩增核酸的液体样品的新装置。

本公开内容的一个目的是提供一种克服从现有技术已知的缺点的装置。

本公开内容的一个目的是提供一种能够同时检测多个预定核酸序列的装置。

本公开内容的一个目的是提供一种简单、便于使用并提供可靠的结果的装置。

此外，本公开内容的目的是提供一种适合外围和资源有限的实验室环境的装置。

提供检测多个预定核酸序列的组合方法也是本公开内容的一个目的。

提供一种检测受试者中耐药和/或耐抗生素细菌靶向基因突变的存在的方法也是本公开内容的一个目的。

从本公开内容来看，对技术人员来说是显而易见的这些和其它目的，由所附权利要求书要求的和一般如本文公开的本发明的不同方面满足。

因此，在本公开内容的第一个方面，提供一种分析包含扩增核酸的液体样品的装置，所述装置包含：

样品垫；

为分析核酸样品的不同方面而配置的第一和第二样品分析条，其中第一和第二条是细长的并从样品垫延伸，且所述第一和第二条各自包含一个基本上直的分析部分，其被分成若干区段，每个被配置以指示具有预定序列的靶标核酸是否存在于所述样品中，所述具有预定序列的靶标核酸与检测分子直接或间接偶联，和

其中所述第一和第二样品分析条的分析部分包含由具有至少0.1mm厚度的透明层覆盖的背衬膜，所述分析部分被配置以分析具有不同的预定序列的核酸的存在与否，第一和第二样品分析条的所述分析部分具有基本相同的长度且被并排排列，以致分析结果可从出现在所述第一和第二分析条的对齐区段的透明层中的三维标记的组合检测到，

其中所述区段包含与分析其存在与否的靶标核酸的预定序列互补的核酸序列；

和

围绕所述样品垫和至少两个细长样品分析条的外壳，所述外壳包含前侧，在其中形成样品入口通道，以致样品垫可从外壳的外部接近，和至少一个开口，以致从外壳的外部可以检测到分析结果。

本公开内容的装置可例如利用侧向流动核酸生物传感器(lfnab)。在lfnab中，包含与预定核酸序列互补的核酸序列的标记被固定在膜上，例如硝酸纤维素膜或尼龙膜。当样品通过分析条时，包含预定核酸序列的核酸分子将与它们互补的固定序列结合。

依据本发明的装置使得在不需要其它先进医疗分析装置的情况下分析样品成为可能，这在医疗分析装置的获得受限的地理区域是非常有用的。所述装置，由于其特征性设计，提供有利于正确有效的药物治疗、避免经验治疗的详细结果。因此，它对于患者是非常有利的，且有助于避免不必要的不利影响并减少在不治疗患者的情况下处方药物的数量。样品垫和分析部分由外壳保护，且不需要任何准备即可使用。

特别地，本公开内容的装置提供一种在诊断的早期阶段提供例如有关药物易感性模式的信息的方式，其当然可以帮助临床医师开始传染性疾病的适当治疗。此外，本发明的装置适用于外围实验室环境。

此外，包含由透明层覆盖的背衬膜的分析部分的不同区段产生一个出现在指示区段的透明层中的非常独特的三维标记，其有助于阅读结果，并确保正确地阅读结果。

如本文所用的，术语“传染性疾病”指由微生物例如细菌、病毒、寄生虫或真菌引起的生理疾病。传染性疾病可在人和动物之间或之中直接或间接地传播。

如本文所用的，术语“核酸”指任何形式的脱氧核糖核酸(dna)，其由携带遗传密码的碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶组成并决定任何活的生物体的生物学作用。由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶形成的类似于dna但用途更广泛的核糖核酸(rna)转移遗传密码并传递信息。因此，术语核酸指任何形式的dna或rna和它们的相关物。这样的相关物的非限制性例子包括cdna、mrna、trna、rrna、snrna、mirna、sirna、pirna、rnrna、scarna、长ncrna、细胞外dna和细胞外rna。

如本文所用的，术语“外围实验室环境”指任何临床实验室，例如医疗设施非常有限的农村卫生保健中心和医疗营地，例如缺乏标准设备、敷料和药物、抗生素，以及具有有限的或甚至缺乏受过培训以提供诊断和治疗的卫生保健人员。

在如本文公开的装置的一个实施方案中，第一和第二样品分析部分被配置以分析液体样品是否包含基因或部分基因的野生型变体，或是否包含所述基因或部分基因的突变型变体。如本文所用的，这样的野生型变体及其相应的突变型变体被称为“野生型–突变型变体对”。技术人员将意识到，基因或部分基因的突变型序列在至少一个核苷酸位置与所述基因或部分基因的野生型序列不同。

因此，在一个实施方案中，提供一种如本文公开的装置，其中第一样品分析条的分析部分包含至少一个区段，其至少含有野生型基因的部分核酸序列，和第二样品分析条的分析部分包含至少一个区段，其含有所述基因的突变体的相应核酸序列，所述相应核酸序列包含至少一个突变。在一个实施方案中，所述核酸序列是大约10-40个核苷酸长，例如18-30个核苷酸长。在另一个实施方案中，所述核酸序列是大约60-130个核苷酸，例如70-120个核苷酸长。在一个实施方案中，所述核酸序列被生物素化和/或与蛋白或肽相连。在本文中，术语“相应的”指包含其存在与否要被检测的一个或多个突变的核酸序列。例如，相对于其相应的野生型基因，突变体基因的核酸序列在一个或多个突变位置的5’和/或3’包含相同或互补的核酸序列的变化。

要理解在所述至少一个区段中的所述至少部分核酸序列被偶联或缀合或杂交或固定在分析部分，例如通过共价方式或通过疏水方式。因此，在一个如本文公开的装置的实施方案中，所述至少部分核酸序列被共价偶联到分析部分的至少一个区段。在如本文公开的装置的另一个实施方案中，所述至少部分核酸序列通过疏水或离子或氢键合来偶联到分析部分的至少一个区段。

技术人员将意识到，所述分析部分的至少一个区段中的所述至少部分核酸序列可通过单链dna的非-特异性物理吸附到硝酸纤维素，通过重氮偶联的共价连接，或通过光化学方法来连接。例如，要连接的核酸可进行热变性处理，并将其应用于在盐缓冲液中的通过uv照射(在尼龙膜的情况下)或烘烤(在硝酸纤维素膜的情况下)或改变离子相互作用而固定的膜上。技术人员知道其它合适的偶联方法。

如本文所用的，术语“侧向流动生物传感器(lfnab)”指用于免疫色谱试验的传感器。一般原理是在反应混合物中的试验分子通过重力介导的毛细管运动流动，并通过底物例如链酶抗生物素、生物素、辣根过氧化物酶、缀合的金纳米颗粒(aunp)或荧光团的杂交在膜条上产生视觉信号(颜色变化)。技术人员将意识到所述试验的许多变化存在。

在装置的一个实施方案中，所述分析部分由透明的纤维素或聚合物材料形成。这些材料由于其可支撑特性而为有利的。

在装置的一个实施方案中，背衬膜和出现在区段中的三维标记具有不同的颜色，以进一步提高在读取检测结果时的准确性并确保得自装置的信息被正确读取。

在本公开内容的一个实施方案中，提供如本文公开的装置，其中分析部分或条包含选自尼龙膜、pvdf膜、硝酸纤维素膜的膜。在一个特定的实施方案中，所述膜是硝酸纤维素膜。在一个实施方案中，分析条和分析部分具有相同的材料。

要理解几个不同的突变型-野生型变体对可同时在相同的第一和第二样品分析部分上分析。例如，至少两个不同的突变型-野生型变体对可同时在相同的第一和第二样品分析部分上分析，例如至少4个、至少6个、至少8个或至少10个。这是因为每个样品分析部分可含有几个区段，其中每个区段包含对应于突变型或野生型序列的核酸序列。

在本公开内容的一个实施方案中，样品垫和从样品垫延伸至第一区段的细长样品分析条的部分是在一块材料中形成的。这个实施方案是非常有利的，因为样品将能够从样品垫和通过样品分析条更快地流动，促进毛细力。

因此，在一个实施方案中，提供一种装置，其中每个样品分析部分含有包含不同的核酸的至少2个区段，例如至少4个区段，例如至少6个区段和例如至少10个区段。

本发明可用于检测任何革兰氏-阳性或革兰氏-阴性细菌和它们的抗性标记。本发明也可用于检测例如引起疾病的病原体，所述疾病例如放线菌病、炭疽、布鲁氏菌病、空肠弯曲菌(caphylobacter)感染、霍乱、梭菌感染、白喉、腹泻、肠球菌感染、丹毒丝菌病、气体坏疽、肠道感染(由克雷伯氏菌(klebsiella)、肠杆菌(enterobactor)、沙雷氏菌(serratia)、大肠杆菌(escheriacoli)所致)、军团菌病、钩端螺旋体病、李斯特氏菌病、莱姆病、脑膜炎球菌感染、百日咳、鼠疫、肺炎、假单胞菌感染、沙门氏菌病、伤寒、脑膜炎球菌感染、葡萄球菌感染和隐孢子虫感染。也可检测以上提及的疾病的标记，例如但不限于甲氧西林抗性、广谱β-内酰胺酶抗性、万古霉素抗性和金属抗性。

本发明也可用于鉴别引起动物和植物疾病的dna和rna病毒和它们的抗性标记，例如，但不限于属于腺、爱泼斯坦-巴尔、疱疹、肝炎、巨细胞病毒、流感、hiv/aids、乳头瘤、脊髓灰质炎、狂犬病、副流感、呼吸道合胞、风疹和水痘-带状疱疹的类别的病毒。

本发明也可用于鉴别真菌感染和它们的标记，例如，但不限于，曲霉病、芽生菌病、白色念珠菌病、球孢子菌病(山谷热)、新生隐球菌感染、c.gattii、眼部感染包括组织胞浆菌病、毛霉病、肺囊虫肺炎、蠕虫感染如癣菌病、线虫(roundworm)、丝虫病、孢子丝菌病和蛔虫(ascaris)。

如本文说明的，本发明的装置可用于基因试验，以检测致病性微生物及其抗性标记，包括结核分枝杆菌复合群(mycobacteriumtuberculosiscomplex)。结核分枝杆菌复合群指可引起人、动物和其它多细胞生物的结核病的一群遗传相关的分枝杆菌物种。分枝杆菌物种的非限制性例子包括结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、非洲分枝杆菌(mycobacteriumafricanum)、牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)、田鼠分枝杆菌(mycobacteriummicroti)、卡氏分枝杆菌(mycobacteriumcanetti)、山羊分枝杆菌(mycobacteriumcaprae)、海狮分枝杆菌(mycobacteriumpinnipedii)、mycobacteriumsuricattae、mycobacteriummungi、鸟分枝杆菌(mycobacteriumavium)、细胞内分枝杆菌(mycobacteriumintracellulare)、副结核分枝杆菌(mycobacteriumparatuberculosis)和非结核的分枝杆菌菌株(non-tuberculosismycobacteriumstrains)，包括麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)和弥散型麻风分枝杆菌(mycobacteriumlepromatosis)。

在实施例部分，在用于检测结核分枝杆菌复合群中的抗生素抗性标记的基因试验的背景中描述了本发明。技术人员将意识到，这个实施例不应以任何方式被视为限制。本公开内容的装置同样适用于用于表明样品中具有预定序列的任何核酸是否存在的基因试验。

如本文所用的，术语“抗生素抗性”指在对抗微生物剂(包括抗生素)产生抗性的任何生物中存在基因的一个或多个突变，或蛋白或酶的修饰。这样的抗性表型/基因型对抗生素没有反应。

如本文所用的，术语“抗生素抗性标记”指基因的突变型变体，所述变体赋予对抗微生物剂(包括抗生素)的抗性。

在本公开内容的背景中，突变型-野生型变体对可包含抗生素抗性标记，其经由在基因中的任何核苷酸位置的突变赋予抗生素抗性，例如rpob、katg、inha、gyra、rrs、eis或emb；和其野生型序列，其不赋予抗生素抗性。结核分枝杆菌复合群的抗生素抗性标记的非限制性实例包括rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc、rpob598gag、katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变、在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g、rpsl262c、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。相应的野生型序列的非限制性实例包括katgwt、rpobwt、gyrawt、rrswt、eiswt、embwt、ahpcwt、oxyrwt和rpslwt的保守基因区，例如在rpob516wt、katg315wt、rpob331wt、rpob531wt、rpob526wt、inha-15wt、rrs1401wt、gyra94wt、gyra90wt、rpob533wt、emb306wt、eis-10wt、eis-12wt和eis-15wt的密码子处的基因序列。在本文中，突变型-野生型变体对的实例是rpob516tac和rpob516wt。

在一个实施方案中，提供一种如本文公开的装置，其中所述基因包含抗生素抗性标记，例如结核分枝杆菌复合群抗生素抗性标记。在一个实施方案中，所述抗生素抗性标记选自rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc、rpob598gag、katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变、在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g、rpsl262c、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。在一个实施方案中，所述抗生素抗性标记选自rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc和rpob598gag。在一个实施方案中，所述抗生素抗性标记选自katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变。在一个实施方案中，所述抗生素抗性标记选自gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h。在一个实施方案中，所述抗生素抗性标记选自在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g、rpsl262c、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。

在一个如本文公开的装置的实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc、rpob598gag、katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变、在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g、rpsl262c、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc和rpob598gag。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。

在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg和rpob533ccg。为了清晰起见，该组在下文被称为x组的抗生素抗性标记。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g和inha-17t。为了清晰起见，该组在下文被称为y组的抗生素抗性标记。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：rpob516tac、rpob516gtc、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、katg315acc、katg315aac、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc和katg315cgc。为了清晰起见，该组在下文被称为z组的抗生素抗性标记。在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自以下的抗生素抗性标记的核酸序列：在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g。为了清晰起见，该组在下文被称为p组的抗生素抗性标记。

在一个实施方案中，所述至少一个区段包含选自rpob531ttg和katg315acc的抗生素抗性标记的核酸序列。在一个特定的实施方案中，所述至少一个区段包含选自seqidno:2和seqidno:4的核酸序列。

技术人员将意识到，如本文公开的分析部分可包含几个区段，其中每个区段包含与其它区段的核酸序列不同的抗生素抗性标记的核酸序列。因此，分析部分可包含各自包含不同抗生素抗性标记的核酸序列的区段。技术人员将意识到，以上列出的标记可在一个或多个分析部分中自由组合。例如，任何分析部分可包含含有在以上x组列出的任何一个抗生素抗性标记的区段和含有在以上y组列出的任何一个抗生素抗性标记的区段。分析部分可包含含有来自x组的标记的区段，含有来自y组的标记的区段，含有来自z组的标记的区段，和含有来自p组的标记的区段。也可能的是分析部分可包含含有来自一个组的一个或多个标记的区段和含有来自相同组的不同标记的一个或多个区段。技术人员将意识到在此列出的组合不是限制性的。

因此，在一个实施方案中，如本文公开的所述分析部分包含至少两个区段，例如至少3个区段，例如至少6个区段，例如至少9个区段，例如至少12个区段，例如至少14个区段，其包含不同的抗生素抗性标记的核酸序列，例如选自以上列出的不同或相同组的不同抗生素抗性标记。

例如，分析部分可包含含有抗生素抗性标记rpob176tgc、rpob432ggc、rpob438caa、rpob447acc、rpob516tac、rpob526cgc、rpob531ttg、katg315aca、inha-15t、rrs1401g、gyra94g、emb306vatg和ies-10g/a，或其亚组的核酸序列的区段。例如，分析部分可包含含有抗生素抗性标记rpob432acc、rpob438atg、rpob447ggg、rpob516gtc、rpob526gac、rpob531tgg、katg315act、inha-8、gyra90t、emb306iatg和ies-12c/t，或其亚组的核酸序列的区段。例如，分析部分可包含含有抗生素抗性标记rpob432cag、rpob438ttc、rpob447tcg、rpob526ctc、katg315ggc、inha-17g和ies-15c/g，或其亚组的核酸序列的区段。例如，分析部分可包含含有抗生素标记rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g和rpsl262c或其亚组的核酸序列的区段。例如，分析部分可包含含有抗生素抗性标记rpob432ctg、rpob447ttg、rpob526acc和katg315cgc或其亚组的核酸序列的区段。

在一个如本文公开的装置的实施方案中，包含野生型基因的至少部分核酸序列的所述至少一个区段包含选自(但不限于)以下的序列：在rpob516wt、katg315wt、rpob331wt、rpob531wt、rpob526wt、inha-15wt、rrs1401wt、gyra94wt、gyra90wt、rpob533wt、emb306wt、eis-10wt、eis-12wt和eis-15wt的密码子处的katg、rpob、gyra、rrs、eis、emb、ahpc、oxyr。在该背景中，突变型-野生型变体对的实例是rpob516tac和rpob516wt。在一个实施方案中，包含野生型基因的至少部分核酸序列的所述至少一个区段包含选自rpob531wt和katg315wt的序列。在一个特定的实施方案中，所述至少一个区段包含选自seqidno:1和seqidno:3的序列。

应该意识到，如本文公开的装置允许分析样品中相应的野生型序列的存在与否。为了简洁起见，未在此列出所有此类相应的野生型序列的组合。在一个实施方案中，所有相关的野生型序列在一个包含几个区段的分析部分上分析，其中每个区段包含不同的野生型核酸序列。因此，在一个实施方案中，分析部分可包含含有rpob176wt、rpob432wt、rpob438wt、rpob447wt、rpob516wt、rpob526wt、rpob531wt、katg315wt、inha-8、inha-15、inha-17wt、16srrnawt、gyra90、gyra91、gyra92、gyra93、gyra94wt、emb306wt和ies-10、ies-12、eis-15wt、rrs483wt、rrs485wt、rrs496awt、rrs491wt、rrs512wt、rrs798wt、rrs877wt、rrs904wt、rrs906wt、rrs904wt、rrs1401wt、rpsl43wt、rpsl88wt、rpsl128wt、rpsl263wt和rpsl262wt和ies-10、ies-12、eis-15wt的核酸序列的区段；在一个实施方案中，分析部分可包含含有rpob432wt、rpob438wt、rpob447wt、rpob516wt、rpob526wt、rpob531wt、katg315wt、inha-8、inha-15、inha-17wt、gyra90、gyra91t、gyra92t、gyra93g、gyra94wt、emb306wt和ies-10、ies-12、eis-15wt；或rpob432wt、rpob438wt、rpob447wt、rpob526wt、katg315wt、inha-8wt、inha-15wt、inha-17wt、rrs483wt、rrs485wt、rrs496awt、rrs491wt、rrs512wt、rrs798wt、rrs877wt、rrs904wt、rrs906wt、rrs904wt、rrs1401wt、rpsl43wt、rpsl88wt、rpsl128wt、rpsl263wt和rpsl262wt和ies-10、ies-12、eis-15wt；或rpob432wt、rpob447wt、rpob526wt和katg315wt的核酸序列的区段。

还设想分析部分可包含含有抗生素抗性标记的核酸序列和野生型基因的相应核酸序列的区段。例如，分析部分可包含含有rpob176wt和rpob176tgc；rpob432wt、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432cag和rpob432ctg；rpob438wt、rpob438caa、rpob438atg和rpob438ttc；rpob447wt、rpob447acc、rpob447ggg、rpob447tcg和rpob447ttg；rpob516wt、rpob516tac和rpob516gtc；rpob526wt、rpob526cgc、rpob526gac、rpob526ctc和rpob526acc；rpob531wt、rpob531ttg和rpob531tgg；katg315wt、katg315aca、katg315act、katg315ggc和katg315cgc；inha-8wt、inha-15wt、inha-17wt、inha-15t、inha-8和inha-17g；16srrnawt和rrs1401g；gyra90-94wtgyra94g和gyra90t；emb306wt、emb306vatg、emb306iatg；或ies-8wt、ies-12wt、ies-15wt、ies-10g/a、ies-12c/t和ies-15c/g的核酸序列的区段。

表1

应该意识到，在其中存在两个以上的分析条的本装置的实施方案中，所述标记可以在所述两个以上的条之间划分。

作为一个实例，已设想如本文公开的装置包括用于分析如在表1的栏1中说明的野生型的分析部分和至少一个选自表1的栏2-5中说明的部分的分析部分，例如栏1和2，栏1和3，栏1和4，和栏1和5。也设想了依据栏1的分析部分与栏2和3；2和4；2和5；3和4；3和5；4和5；2、3和4；3、4和5；2、4和5；2、3和5；或2、3、4和5的组合。

还设想样品分析部分可至少包含能够检测细菌物种，例如包括在结核分枝杆菌复合群中的物种之一的区段。

此外，技术人员将意识到每个样品分析部分可包含用作任何野生型及其在分支杆菌属物种中引起抗性的突变的对照的区段。在一个特定的实施方案中，提供一种包含含有对照区段的样品分析部分的装置。在一个实施方案中，所述对照区段包含细菌物种的管家基因(例如结核分枝杆菌物种的管家基因)的至少部分序列，及其抗性标记。在一个特定的实施方案中，所述序列是seqidno:5。

在装置的一个实施方案中，样品垫和细长样品分析条由吸收纤维材料形成，样品能够通过重力或毛细管运动流动穿过所述吸收纤维材料。其它材料替代品是透明的纤维素材料或聚合物材料。

意欲将所述装置安排在例如桌子或实验台上，以致样品垫和细长样品分析条基本上是水平排列的，以便于样品在细长样品分析条内流动。此外，用于样品垫和分析条的吸收材料确保样品被转移至样品分析部分。

装置的一个优选的实施方案包括由塑料或惰性或不透明物质组成的背衬膜，与外壳中的入口通道和开口相对排列。背衬膜阻止液体样品在到达样品分析部分之前从样品垫或样品分析条材料泄漏，从而提高分析结果的准确性。

在装置的一个实施方案中，细长样品分析条在它们成角度之前，首先从样品垫的中心基本径向延伸，以致分析部分彼此平行排列，结果可以从与细长样品分析条横向排列的区段的组合中检测到。这个实施方案是有利的，因为样品可以很容易地从样品垫流向细长样品条，这确保将足够的样品转移到每个细长样品分析条。

在装置的一个实施方案中，第一和第二分析部分的相应区段与分析部分横向排列。装置的这个实施方案使得易于以简单可靠的方式读取正确的分析结果，例如，野生型和突变体基因型。在装置的一个特定的实施方案中，检测剂存在于样品分析部分。在一个实施方案中，检测剂仅存在于分析部分的区段中。

装置的一个实施方案包括为分析核酸样品的不同方面而配置的第三细长样品分析条，其中所述第三样品条的分析部分被配置以分析具有不同预定序列的核酸的存在与否，并具有基本相同的长度且在所述第一和第二细长样品分析条之间排列，以致分析结果可从3个分析条的相应区段的组合中检测到。第三细长样品分析条还增加分析的诊断准确性，因为可以检测到进一步的表型变化。

在装置的一个实施方案中，在40º-80º范围内的角度α在第一和第二细长样品条之间形成，而从周边向样品垫中心延伸的切口在第一和第二细长样品条之间的样品垫中形成，以使样品被导向第一和第二细长样品条。装置的这种设计确保样品容易地流入细长样品分析条中。

在装置的一个实施方案中，第三细长样品条从切口尖端从样品垫以基本径向的方向延伸。

装置的一个实施方案，包括为分析核酸样品的不同方面而配置的第四和第五细长样品分析条，其中所述第四和第五样品条的分析部分被配置以分析具有不同预定序列的核酸的存在与否，并具有基本相同的长度并被排列在第一和第二细长样品分析条的相对侧上，以致分析结果可从所有四个或五个分析条的相应区段的组合检测出来。第四和第五细长样品分析条进一步增加精确性并提供分析的细节，因为可检测参数，例如属、种、管家基因、野生型和抗性基因标记。

在装置的一个实施方案中，第四和第五细长样品条在它们成角度之前从样品垫的中心基本径向延伸，以致分析部分彼此以及与第一和第二分析部分平行排列，并与第一和第二细长样品条的分析部分对齐。

装置的一个实施方案包括在外壳内形成的支持结构，以支持样品垫和细长样品条在外壳内的正确位置，这对确保正确显示分析结果是非常重要的。

在本公开内容的另一个方面，提供一种在得自受试者的样品中确定具有预定序列的靶标核酸的存在与否的诊断方法，该方法包括以下步骤：

a)提供生物样品，其先前已以非侵入性方式从受试者获得，

b)使样品经受至少一个具有预定序列的靶标核酸的选择性扩增，以获得扩增的靶标核酸，

c)将扩增靶标核酸应用于如本文描述的装置(10；30；50)的样品垫，

d)将所述装置孵育足以能够通过检测剂检测所述靶标核酸的时段，和

e)检测至少一个具有预定序列的靶标核酸的存在与否。

在如本文公开的方法的一个实施方案中，在步骤b)中获得的所述扩增的靶标核酸在将扩增的靶标核酸应用于装置的样品垫之前被直接或间接偶联于检测剂。

在另一个实施方案中，在步骤b)中获得的扩增的靶标核酸和检测剂被分开加入到装置的样品垫中，以使直接或间接偶联原位发生。在一个实施方案中，在加入检测剂之前加入所述扩增的靶标核酸。在另一个实施方案中，在加入扩增的靶标核酸之前加入所述检测剂。

在又一个实施方案中，检测剂存在于样品垫和/或分析部分中。在一个实施方案中，所述检测剂仅存在于分析部分的区段中。因此，在这个实施方案中，在步骤b)中获得的扩增的靶标核酸在其加入到如本文公开的装置的样品垫中之前不与检测剂偶联。

在一个实施方案中，所述生物样品从所述受试者以非侵入性方式，例如非手术方式获得，该方式不会给所述患者带来任何风险且不需要由专业医务人员执行。在如本文公开的方法的一个实施方案中，生物样品是来自所述受试者的原代细菌培养物。

在一个实施方案中，所述样品是选自生物流体例如尿、血、痰和组织，例如尿、血和痰，例如尿和痰的样品。

在如本文公开的方法的一个实施方案中，在步骤e)中的孵育是足够能进行检测的时间，所述时间少于180分钟，例如少于120分钟，例如少于90分钟，例如少于80分钟。应该意识到，迅速提供分析结果是有益的。

在所公开方法的一个实施方案中，步骤c)与步骤b)同时进行。在另一个实施方案中，步骤c)在步骤b)之后进行。

在该方法的一个实施方案中，步骤b)中的选择性扩增是多路选择性扩增。多路选择性扩增指在一个反应瓶里同时选择性扩增多个不同的预定核酸序列。一般来说，靶标分子可通过核酸扩增方法扩增，例如等温扩增，然而正确识别靶标dna中的点突变仍然是一个挑战，例如在耐药性细菌感染的情况下。因此，提供一种能够进行可靠、特异性和选择性扩增靶标dna的方法是至关重要的，该方法允许准确地检测单核苷酸变体。

因此，在本公开内容的第二方面的一个实施方案中，提供一种方法，其中在步骤b)中的选择性扩增选自聚合酶链反应(pcr)、逆转录酶pcr(rt-pcr)、分支dna(quantiplexbdna)试验、连接酶链反应、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、与通过锁式探针(plp)的靶标识别相结合的滚环扩增(rca)。

作为一个实例，plp是含有检测、限制、特异性标记和接头序列的线性寡核苷酸探针，其中5’和3’臂(末端)被设计与靶标序列杂交。当探针末端在靶标特异性位点上并置杂交时，为了连接需要在3’端完全匹配，有效分辨点突变。中间的接头区段包含具有扩增、鉴别和检测功能的序列，即使是以高度多路的方式。连接-介导的循环挂锁可经历rca以产生含有plp序列的多个互补重复的单链多联体。为了提高灵敏度，多联体可被限制消化，重新连接至新环并经受另一轮的rca，称为环对环扩增(c2ca)。限制-消化的扩增子(单体)以夹心方式杂交于其aunp寡核苷酸的共同标记和分别固定在侧流条上的野生型和突变型寡核苷酸标记，以产生视觉信号。因此，在所述方法的一个实施方案中，步骤b)中的选择性扩增是与通过锁式探针的靶标识别(任选地包含环对环扩增步骤)组合的滚环扩增。

在一个实施方案中，所述锁式探针是70-120个核苷酸长度，例如，70-100个核苷酸长度。

在本方法的一个实施方案中，应用步骤利用至少一个对选自以下的抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob176tgc、rpob432ggc、rpob432acc、rpob432agc、rpob432cag、rpob432ctg、rpob432agc、rpob432cag、rpob436ctg、rpob437agc、rpob438caa、rpob438ttc、rpob438atg、rpob441gac、rpob441aac、rpob441cag、rpob444aac、rpob444ccg、rpob444ctg、rpob447tcg、rpob447ggg、rpob447ttg、rpob447acc、rpob451cac、rpob451aag、rpob451cgc、rpob451cga、rpob451ctg、rpob456tcg、rpob456gcg、rpob458ctg、rpob486ctg、rpob486atc、rpob496ctg、rpob497atc、rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、rpob558cgc、rpob598gag、katg269cgt、katg463ctg、katg379acc、katg98tgc、katg352gaa、katg463ctg、katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、inha-34g、inha-34t、inha-47t的突变、在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs483t、rrs485g、rrs496a、rrs491t、rrs512t、rrs798t、rrs877a、rrs904g、rrs906c、rrs904t、rrs1401g、rpsl43agg、rpsl88cag、rpsl128g、rpsl263g和rpsl262c、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g，和至少一个对相应的野生型序列特异性的锁式探针。

相应的野生型序列的非限制性实例包括在rpob516wt、katg315wt、rpob331wt、rpob531wt、rpob526wt、inha-15wt、rrs1401wt、gyra94wt、gyra90wt、rpob533wt、emb306wt、eis-8wt、eis-10wt、eis-12wt、eis-15wt、rrs483wt、rrs485wt、rrs496awt、rrs491wt、rrs512wt、rrs798wt、rrs877wt、rrs904wt、rrs906wt、rrs904wt、rrs1401wt、rpsl43wt、rpsl88wt、rpsl128wt、rpsl263wt和rpsl262wt的密码子处的katg、rpob、gyra、rrs、eis、emb、ahpc、oxyr。在该背景中，突变型-野生型变体对的实例是rpob516tac和rpob516wt。

在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob513cca、rpob515atc、rpob516tac、rpob516gtc、rpob522tgg、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg和rpob533ccg，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：katg315acc、katg202gca、katg203act、katg518ggtc插入、katg315aac、katg127ccg、katg506tag、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc、katg315cgc、inha-15t、inha-8、inha-17g和inha-17t，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob516tac、rpob516gtc、rpob526cgc、rpob526、rpob526gac、rpob526ctc、rpob526acc、rpob531ttg、rpob531tgg、rpob533ccg、inha-15t、inha-8、inha-17g、inha-17t、katg315acc、katg315aac、katg315aca、katg315acg、katg315act、katg315atc、katg315aga、katg315ggc和katg315cgc，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。

在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：在密码子-10、-6、-39、-48、-15、12和-9的ahpc-oxyr突变、rrs1401g、gyra94g、gyra90t、gyra90v、gyras91p、gyrad94a、gyrad94g、gyra94n、gyra94h、emb306vatg、emb306iatg、eis-10g/a、eis-12c/t、eis-15c/g和rrs1401a/g，以及对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob176tgc、rpob432ggc、rpob438caa、rpob447acc、rpob516tac、rpob526cgc、rpob531ttg、katg315aca、inha-15t、rrs1401g、gyra94g、emb306vatg和ies-10g/a，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob432acc、rpob438atg、rpob447ggg、rpob516gtc、rpob526gac、rpob531tgg、katg315act、inha-8、gyra90t、emb306iatg和ies-12c/t，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的另一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob432cag、rpob438ttc、rpob447tcg、rpob526ctc、katg315ggc、inha-17g和ies-15c/g，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的又一个实施方案中，应用步骤至少利用对以下抗生素抗性标记特异性的锁式探针：rpob432ctg、rpob447ttg、rpob526acc和katg315cgc，和对相应的野生型序列特异性的锁式探针。在本方法的另一个实施方案中，利用抗性标记rrs483wt、rrs485wt、rrs496awt、rrs491wt、rrs512wt、rrs798wt、rrs877wt、rrs904wt、rrs906wt、rrs904wt、rrs1401wt、rpsl43wt、rpsl88wt、rpsl128wt、rpsl263wt和rpsl262wt和ies-10、ies-12、eis-15wt和突变体密码子。

技术人员将意识到，使用的锁式探针的组合依赖于要检测是否存在的抗生素抗性标记的身份，并且与本发明第一个方面相关列出的标记的任何组合同样与该第二方面相关。为了简洁起见，列表不在此重复。

在一个实例中，在步骤b)中用于选择性扩增的锁式探针可分别对抗生素抗性标记rpob516tac、rpob516gtc和对相应的wt序列rpob516wt有特异性。在另一个实例中，在步骤b)中用于选择性扩增的锁式探针可分别对抗生素抗性标记rpob531tgg和rpob531wt有特异性。在一个实施方案中，所述锁式探针分别包含序列seqidno:10和seqidno:9。在又一个实例中，在步骤b)中用于选择性扩增的锁式探针可分别对抗生素抗性标记katg315acc和katg315wt有特异性。在一个实施方案中，所述锁式探针分别包含序列seqidno:8和seqidno:7。技术人员将意识到，几个不同的锁式探针可在一个选择性扩增中组合，例如一个选择性扩增反应可使用几个各自对rpob531tgg、rpob531wt、katg315acc和katg315wt之一有特异性的锁式探针进行。在本文公开的方法的一个特定实施方案中，锁式探针是seqidno:7-10的至少一个，例如seqidno:7-10的至少两个，例如seqidno:7-10的至少三个，例如seqidno:7-10的全部四个。在一个实施方案中，所述锁式探针是seqidno:7和8。在另一个实施方案中，所述锁式探针是seqidno:9和10。

为了读出rca或c2ca信号而对精密仪器，例如荧光计、荧光显微镜、阵列扫描仪的要求阻碍在资源有限的实验室，例如外围实验室环境中使用rca，并呼吁替代方法。技术人员将意识到，本装置可用作一种不需要先进和昂贵的分析装置，因而适合于外围实验室的方法。

在本方法的实施方案中，扩增的靶标核酸分子偶联于检测剂。这样的偶联可以是直接或间接的偶联，例如经由额外的核酸分子的方式。将检测分子偶联于核酸分子的方法是本领域非常成熟的，且技术人员知道合适的方法，包括电或机械或离子或化学或这些方法的组合。有机和无机核酸检测剂和它们的组合的非限制性实例包括放射性核素、金纳米颗粒、荧光团或任何有色物质、适体或接头、链酶抗生物素-相关试剂、生物素、辣根过氧化物酶或缀合的金纳米颗粒(aunp)。在一个实施方案中，所述检测剂是金纳米颗粒，这样的金纳米颗粒与核酸分子缀合。在一些实施方案中，所述检测剂在视觉上可以检测到。在一些实施方案中，所述检测剂提供有色信号。

在一个相关的方面，提供一种试剂盒，其包含如本文描述的装置和至少一个对多抗性标记特异性的探针、至少一个对相应的野生型序列特异性的探针和如本文公开的检测剂。例如，可使用所述的锁式探针或其组合。技术人员将意识到，与本公开内容的第一和第二方面相关的抗性标记和锁式探针的描述与这第三个方面同样相关。

因此如在本公开内容的实施例1中所示，核酸扩增可涉及锁式探针、滚环扩增、侧向流动读出装置和金纳米颗粒的组合使用和整合，以便为简化试验结果的评估提供可见的视图信号，如在下面所详细讨论的。例如侧向流动试验条可具有核酸缀合的具有或没有金纳米颗粒作为组成部分的寡核苷酸，和用于制备检测和/或测定核酸的所述试验条的方法。核酸缀合的金纳米颗粒以干燥形式稳定，并在再水合后保留其所有性质(形状、质地、流动性、杂交能力和胶态)。样品中靶标核酸的存在通过试验和对照区上两条红带的形成来检测。

虽然已参考各个示例性方面和实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将理解可进行各种变化，并且在不背离本发明的范围的情况下，可以用等价物代替其要素。此外，在不背离其实质范围的情况下，可进行许多修饰以使某一特定情况或分子适应本发明的教义。因此，意欲使本发明不限于设想的任何特定的实施方案，而是本发明将包括所有落入所附权利要求书的范围内的实施方案。

附图简述

图1显示在50,000x和300,000x放大倍率的透射电子显微镜(tem)图像(a和b)，显示金纳米球具有15±0.5nm的平均直径。从520nm至528nm的移光吸收光谱(c)显示制备的金颗粒与寡核苷酸缀合。dls测量的单光滑谱(d)证实aunp-寡核苷酸缀合物的缀合和单分散性。

图2显示通过测试10-倍稀释的基因组mtbdna，得自plp-lf方法的检测限的研究的结果(a)。在b中的密度图(通过计算局部颜色强度绘制)描述对照线和试验线的半定量变化。

图3显示来自测试从含有rpob531和katg315的野生型或突变体密码子的临床mtb分离的特征基因组dna样品(300ng)的结果。密度图定性显示临床分离株的野生型和/或突变体基因型的存在和/或缺乏。

图4是在实施例1中公开的seqidno:1-18的核酸序列的列表。

图5a、6a和7a说明依据本发明的装置10；30；50的不同实施方案的透视视图。意欲用装置10；30；50分析包含扩增核酸的液体样品。

图6a中说明的装置10包括具有前侧12、背侧13和四侧表面14的矩形保护外壳11。意欲使装置10在使用期间与朝上的前侧12基本水平排列。

在外壳11的前侧12，形成一个基本圆形的样品入口通道15，以致需要分析的样品可从外壳11的外部接近样品垫16。此外，在外壳的前侧形成两个开口17，通过开口可看到分析结果。开口17可被透明层覆盖以保护外壳内部。在不背离本发明的范围的情况下，样品入口通道15和开口17的大小和形状可以几种方式修改。例如，两个开口可由一个较大的开口替代。

外壳例如由提供对装置的不同组件的支持并提供对装置所需的保护的塑料材料制得。

外壳围绕如在图6b中图示的样品垫16和第一(18)和第二(19)细长样品分析条。

在示例性实施方案中样品垫16基本上是圆形的且由吸收纤维材料制得，例如由玻璃、合成纤维或纤维素材料制得。向样品垫16供应液体样品并通过毛细管运动流过样品垫至第一(18)和第二(19)细长样品分析条。这个实施方案在图5b和图8中说明。

为了促进样品的流动，从样品垫外围延伸到样品垫中心的切口23在第一和第二细长分析条之间的样品垫中形成。示例性样品垫基本上是圆形的，但形状可以通过几种方式进行修改，以促进样品流向细长样品分析条。一种可供选择的形状可能像一个具有面朝细长样品分析条的狭窄末端的液滴。

连接于样品垫16的样品分析条的第一个部分，优选地由与样品垫16相同的材料制得，以将样品转移至各个样品分析部分20。为进一步改进样品从样品垫向样品分析条的转移，样品垫和从样品垫延伸至样品分析部分的细长样品分析条的部分是在一块材料中形成的。

第一和第二细长样品条的分析部分20具有相同的长度并相互并排平行排列，以致从外壳的前侧可以读取来自每个条的两个样品分析部分20的合并结果。

每个分析部分包含相同数目的区段22。每个样品分析部分中的区段22被并排排列，以提供相邻区段之间的所需接触并使样品可能流过样品分析部分。样品分析部分，即彼此相邻排列的不同的区段，由背衬膜31上面排列的透明材料制成。透明材料具有至少0.1mm的厚度，且一旦一个区段检测到样品中预定的基因或物质，则三维标记出现在区段的透明层内。透明层与背衬膜的组合提供给用户很容易阅读的一个非常独特的标记。在分析条上看不到不同的区段，但在应用样品时，标记将出现在与分析过的样品的结果相对应的区段中。结果可以通过第一和第二样品分析条的两个相应横向区段的组合来检测。

在40º-80º范围内的角度α在第一和第二细长样品条之间形成，以确保样品容易地流入细长样品分析条。

在图6a和6b中，装置的备选实施方案如图所示。外壳具有与先前的实施方案基本上相同的设计，但装置包含另外的在第一和第二细长样品分析条之间排列的第三细长样品分析条。第三细长样品分析条是与第一和第二细长样品分析条基本上相同的，并使在相同的装置中分析更多的特征是可能的。第三细长样品条从第一和第二细长样品分析条之间形成的切口尖端，从样品垫的中心基本上径向延伸。

在图7a和7b中，装置30的进一步备选的实施方案50如图所示。外壳具有与先前的实施方案基本上相同的设计，但装置包含在第一和第二细长样品分析条外侧上，即第一和第二细长样品分析条的相对侧上排列的第四(25)和第五(26)细长样品分析条。第四和第五细长样品分析条是与第一和第二细长样品分析条基本上相同的，并使在相同的装置中分析更多的特征是可能的。第四和第五细长样品条在它们成角度之前，首先从样品垫的中心基本上径向延伸，以致样品部分与第一和第二细长样品分析部分的样品部分并排平行排列。

在60º-100º范围内的角度β在第四和第五细长样品条之间形成，以确保样品容易地流入所有的细长样品分析条。

在图7b中，样品部分以透视的方式说明。样品垫16和细长样品分析条18、19、24、25、26优选地包含排列在外壳中的入口通道15和开口17对侧的塑料背衬膜31，以防止液体样品从样品垫和细长样品分析条泄漏。第一、第二、第三、第四和第五细长样品分析条的每一个包含分析部分20，后者包含许多区段，所述区段是为了如果在流过样品部分20的液体样品中检测到预定核酸序列来显示标记而制备。第一、第二、第三、第四和第五细长样品分析条的每一个还包含排列在样品条末端的吸收垫28。吸收垫有利于样品流过分析部分20。

样品部分20的不同的区段22在样品被应用之前是看不见的，并且如果特定的细菌或核酸触发了样品中检测的区段上的标记，结果以出现在样品分析条上的线或符号显示在样品分析部分上。

样品部分20中的区段数目可适应于装置所适应的具体分析，但大多数包括至少5个区段。分析结果从并排排列的各样品分析部分(即与样品部分20横向排列的2、3或5个区段)上指示的结果的组合中读取。

实施例1

概述

下面的实施例公开了为本发明基础的样品结核分枝杆菌复合群(mtb)的准备和分析的概念证据。

材料和方法

化学品和寡核苷酸：来自阿维丁链霉菌(streptomycesavidinii)的链酶抗生物素、氯化金(iii)三水合物(haucl4)、蔗糖、二硫苏糖醇(dtt)、tritonx-100、柠檬酸三钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)、tween20、乙二胺四乙酸(edta)和牛血清白蛋白(bsa，对于寡核苷酸-aunp缀合物)、氯化钠-柠檬酸钠(ssc)缓冲液(ph7.0)、磷酸盐缓冲盐水(pbs,ph7.4,0.01m)，和氯化钠(nacl,5m,ph7.0)、atp、dntps、寡核苷酸(从integrateddnatechnologies和sigma-aldrich购得)。对于lf测定，无粘结剂硼硅酸盐玻璃纤维垫(a/c级)、纤维素纤维吸收垫(113级)和硝酸纤维素膜，其附在层压卡/条(0.4和0.5cm宽度)上。

细菌菌株和dna提取：参考株mtbh37rv(atcc25618)和10个临床mtb分离株(表2)分别在有和没有40mg/lrif的lowenstein-jensen培养基上培养。提取dna并将10μg基因组dna使用各10u的naei和hpych4v，和1xcutsmart缓冲液(newenglandbiolabs,ipswich,ma,usa)于37℃酶促片段化90min，接着于65℃灭活酶20min。dna浓度通过dsdnahs和br测定法，使用qubit2.0荧光计(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)测定。

表2.菌株的基因型信息

锁式探针和滚环扩增：用于该研究的寡核苷酸序列在图4中给出。4个plp被设计靶向基因katg和rpob中的两个密码子和它们的相应野生型序列(katg315acc(mut)、katg315agc(wt)、rpob531ttg(mut)和rpob531tcg(wt)。在使用mfold网络服务器(mfoldwebserver)验证二级结构后，通过将由1μm寡核苷酸、1xpnk缓冲液a、1mmatp和1u/μlt4多核苷酸激酶(thermoscientific,waltham,ma,usa)组成的反应混合物于37℃孵育30min，接着于65℃灭活酶20min，使plp的5’端磷酸化。通过进行改良的c2ca[dahletal.procnatlacadsciusa2004,101,4548-4553]，证实了plp的有效性。通过具有从300pg、3ng、30ng和300ng基因组dna制备的扩增子的lf条评价该测定法的灵敏度。

寡核苷酸缀合的金纳米颗粒的制备和特征鉴定：金纳米颗粒通过改良的标准柠檬酸盐还原法[frensg.naturephyssci.1973,241,20-22]制备。在一个在王水(3:1比例的硝酸和盐酸)中清洁的干燥500ml圆底硼硅酸盐玻璃烧瓶中，在剧烈搅拌下，将100ml0.01%haucl4/milliq水沸腾。加入4毫升1%柠檬酸三钠溶液，此后转变为酒红色。设计为与所有c2ca单体中存在的序列杂交的50微升硫醇盐寡核苷酸用在ssc缓冲液中的500mmdtt还原30min。nap™-5柱(gehealthcarebiosciences,littlechalfont,uk)被用来纯化寡核苷酸并直接洗脱到1mlaunp中。于37℃孵育2h后，逐渐递增加入1mnacl并于4℃保持“老化”。将溶液以13,000g离心25min，弃去上清液并将aunp-寡核苷酸缀合物再次分散于1ml5%bsa、0.25%tween20和20mmtris-hcl(ph8.0)中。

制备的aunp的传统透射电子显微镜(tem)图像以100kv获得以检查制备的粒子的质量。aunp-寡核苷酸缀合物通过在多模式微板读取器(spectramaxrm5,moleculardevices)中测量它们在520nm的光吸收进行特征鉴定，它们的表面电荷(ζ-电位)通过动态光散射(dls)，使用装配有4.0mwhene激光和雪崩光电二极管探测器的zetasizernanozs90(malvern,uk)测量。

侧向流动条的设计、组装和制备：100x5mmlf条由安装在薄塑料背衬上的样品应用垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。干燥样品垫(25x5mm)，在用1%bsa、1%tritonx-100、20mmtris-hcl、100mmnacl；ph8.0)饱和后，在具有2-3mm重叠的硝酸纤维素膜(45x5mm)的一端上固定，而吸收垫(30x5mm)则固定在硝酸纤维素膜的另一端。生物素化条寡核苷酸(图3)固定在硝酸纤维素膜的试验区和对照区内。对照区含有与aunp-寡核苷酸缀合物互补的固定化寡核苷酸的一条线。试验区含有4个相隔3mm的线，其中每个线由独特的条寡核苷酸组成，以供通过杂交检测对应于katg315wt、katg315mut(agc/acc)、rpob531wt和rpob531mut(tcg/ttg)的其特定基因型的c2ca单体。50微摩尔的条寡核苷酸与含15μm链酶抗生物素的等体积的1xpbs混合。于37℃孵育2h后，使用纳米绘图仪(nano-plotternp2.0,gesim,grosserkmannsdorf,germany)将链酶抗生物素-缀合的寡核苷酸固定在硝酸纤维素膜上。

侧向流动条上的c2ca扩增子的可视化：使55微升c2ca单体(扩增的核酸片段)与13μlaunp-寡核苷酸缀合物杂交并逐滴施加于lf条的样品垫。允许样品流动5-7min并用4xssc缓冲液洗涤以供红色条带的可视化。对照线中出现颜色表明阳性测定对照，而来自每个试验线的信号特别涉及katg315和rpob531的wt和/或mut基因型的存在。使用开源工具imagej(版本1.49q)[schneideretal.nat.meth.2012,9,671-675]，为条带生成强度图，并测量了像素密度以量化密度图中的结果。

结果

如本文所示，本发明的实施例提供了一种原理验证测定法，其能够产生快速视觉信号，以在导致mdr-tb(即对inh和rif的抗性)的katg和rpob基因的野生型和突变之间进行区分。该方法可产生大约75min的视觉信号，和结果可指导临床医生就公共卫生控制行动作出英明决定，以及调整有效的抗生素方案。这种测定法对耗时的传统dst提供初步的替代信息并为资源有限的临床实验室提供兼容的解决方案。因此，本发明人已开发一种简单、特定和成本有效的诊断试验，以供迅速鉴定药物和/或抗生素抗性。基于dna的试验适合应用于资源有限的临床实验室并提供关于感染患者的细菌的药物和/或抗生素抗性模式的信息，这对临床医师采取适当的治疗和感染控制行动来说是有价值的。

aunp-寡核苷酸缀合物的评价：aunp的tem图像(图1a和b)证实球形粒子的大小为±3.5nm。基于aunp的光吸收的大小分布曲线显示在寡核苷酸缀合之前λ-max在520nm处，而在缀合之后峰位移至527nm(图1c)。dls测量(图1d)揭示90±4nm的平均直径，单峰表示单分散溶液，无颗粒聚集。对于aunp及其寡核苷酸-缀合物，分别为-37.4mv和-34.5mv的ζ-电位测量显示该制剂是稳定的。

锁式探针-侧向流动试验的检测限：这种plp-lf测定的检测限(lod)通过测试来自参考菌株mtbh37rv的各种稀释度的基因组dna，按一式三份执行。因为两个信号用300ngdna清晰地观察到(图2a)，在这个概念验证研究中，使用来自临床样品(表2)的dna的进一步实验使用这个量执行。基于侧向流动条上产生的红色信号的局部像素密度的密度图(图2b)与视觉观察相关。rpob531wt的信号强度比katg315wt更低，这可能是由于在rpob基因的靶标区内的高gc含量，可能导致c2ca单体的较低产量。在对照线的密度图中观察到微小的变化，即使使用了来自相同打印通话(session)的侧向流动条。改进以获得更高的灵敏度将能够对痰样品进行直接测试。

对mtb的临床分离株的锁式探针-侧向流动试验的视觉评价：对inh和rif为抗性和/或易感的一组10个临床分离株mtb(表2)通过plp-lf方法测试。如在图3中所见到的，6个菌株(id号：2、4、8、9和12)含有突变体katg和rpob密码子；3个菌株(19、20和21)仅具有野生型密码子，和1个菌株(13)显示野生型katg密码子和突变体rpob密码子的存在。试验菌株的plp-lf测定的所有视觉信号与通过焦磷酸测序的菌株的基因型特征完全一致，每个lf条下面的各自的密度图与它们的视觉信号相对应。该方法可通过包括引起mdr-tb的各种其它突变来扩展，并且可提高灵敏度以直接应用于得自tb患者的痰样品。