一种小鼠IL-38的生产方法与流程

本发明属于基因工程领域。具体涉及一种小鼠IL-38的生产方法。

背景技术：

白细胞介素-38(interleukin-38，IL-38)是新近发现的IL-1家族细胞因子，人IL-38基因定于2号染色体2q13-14.1，与编码IL-1Ra(IL-1的受体拮抗剂)和IL-36Ra的基因位点相邻。IL-38基因包含5个外显子，编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子质量约为16.9kDa。IL-38在多种组织都有表达，如心脏、胎盘、胎儿肝、皮肤、脾、胸腺、扁桃体等。序列分析表明，IL-38蛋白与IL-1Ra、IL-36Ra蛋白的氨基酸组成具有较高同源性，分别为41％和43％。与IL-36R的结合能力比较研究发现，高浓度的IL-38明显高于同浓度的IL-36Ra，提示高浓度的IL-38在IL-36R介导的炎性途径中可能较IL-36Ra具有更强的受体拮抗剂作用。IL-38能抑制念珠菌属刺激人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)产生Th17相关细胞因子(IL-17A和IL-22)，并能减少IL-36γ刺激PBMC产生的IL-8，抑制炎症反应。鉴于IL-38在炎症反应中的重要作用，有必要在小鼠疾病模型中对其作用机制进行研究，所以急需开发一种可以大量表达并制备高纯度小鼠IL-38蛋白的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种小鼠IL-38蛋白的生产方法。

本发明采用的技术方案是：一种小鼠IL-38的生产方法，采用基因工程技术生产，所述的基因工程技术包括以下步骤：

1)构建pUC57-mIL-38质粒：合成小鼠IL-38基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-

mIL-38质粒；

2)PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，

以pUC57-mIL-38质粒为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物P1和P2的序列为：

P1：5’-GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG-3’

P2：5’-CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT-3’

PCR反应体系为：2×PfuMasterMix25μL，P1、P2引物各2μL，pUC57-mIL-38质粒模板0.2μL，加双蒸水补充至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。

3)pET28a-mIL-38重组表达载体的构建：将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，双酶切后凝胶回收mIL-38与pET28a载体，回收后的mIL-38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a-mIL-38；

4)转化：将原核表达质粒pET28a-mIL-38转化大肠杆菌BL21，获得IL-38重组工程菌；

5)小鼠IL-38蛋白的诱导表达：将IL-38重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜；次日，以1:50比例扩大培养，37℃、210r/min震荡培养1.5～2h，至OD600达到0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG进行诱导表达，PCR诱导条件为：20℃，100r/min，20h，获得菌体；

6)小鼠IL-38蛋白的纯化：采用超声破碎法将获得的菌体裂解，离心取上清液，用Ni-NAT对上清液进行纯化，得纯化的IL-38蛋白。

本发明的有益效果是：

1.本发明建立了小鼠IL-38的生产方法，采用基因工程技术，根据需求构建得到小鼠IL-38基因工程菌，能使小鼠IL-38高效表达，由于该工程菌表达的小鼠IL-38主要为可溶性成分，纯化后相对的生物学活性较高。

2.本发明，由于表达的小鼠IL-38蛋白C端带有6×His-Tags，用Ni-NAT进行纯化即可得到较高纯度的IL-38蛋白。

3.本发明成功制备小鼠IL-38蛋白，为探究IL-38在炎症性疾病中的作用及相关机制等研究提供了前提，并为开发预治炎症及自身免疫性疾病的新型临床药物奠定了基础。

附图说明

图1是pUC57-mIL-38质粒双酶切结果；

其中，1：M：DNA标准分子量；pUC57-mIL-38质粒双酶切结果。

图2是小鼠IL-38基因扩增结果图；

其中，M：DNA标准分子量；1：IL-38PCR结果。

图3重组质粒pET-28a-mIL-38的构建图谱。

图4是重组质粒pET28a-mIL-38测序结果。

图5是表达及纯化后小鼠IL-38蛋白的SDS-PAGE分析图谱；

其中，M：蛋白质标准分子量；1：未诱导细菌总蛋白；2诱导后细菌总蛋白；3：细菌破壁后沉淀总蛋白；4：细菌破壁后上清总蛋白；5：纯化后的小鼠IL-38蛋白。

具体实施方式

1)构建pUC57-mIL-38质粒：

优化小鼠IL-38基因密码子，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成小鼠IL-38基因，克隆入pUC57，构建pUC57-mIL-38质粒。小鼠IL-38基因的DNA如SEQ ID NO.1所示。

经SmaⅠ和BamHI双酶切验证，双酶切结果如图1所示，由图1可见，经酶切，pUC57-mI L-38质粒在正确位置出现载体条带与目的DNA片段，质粒构建成功。

2)PCR引物的合成

根据优化的小鼠IL-38基因序列设计并合成一对PCR引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和H indⅢ酶切位点：

上游引物P1：5’-GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG-3’(下划线处为EcoRⅠ)，

下游引物P2：5’-CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT-3’(下划线处为Hind Ⅲ)。

3)PCR扩增小鼠IL-38基因

以pUC57-mIL-38质粒为模板，以上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增，获得小鼠IL-38基因片段。

PCR反应体系如下:2×PfuMasterMix 25μL，上、下游引物各2μL，pUC57-mIL-38质粒模板0.2μL，加双蒸水补充至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果如图2所示，如图2可见，以pUC57-mIL-38质粒为模板扩增出小鼠IL-38基因序列，序列459bp，与电泳结果相符。

4)pET28a-mIL-38重组表达载体的构建

将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切。双酶切后凝胶回收mIL-38与pET28a载体，回收后的mIL-38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a-mIL-38。

重组表达载体pET28a-mIL-38的构建图谱如图3所示。

5)转化

将原核表达质粒pET28a-mIL-38转化感受态受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化产物涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板培养基上，37℃培养约14h，次日挑取培养皿上单菌落，并用菌落PCR鉴定阳性重组子。挑取阳性菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养14h，提取重组质粒，进行酶切验证。最后，选择酶切和PCR鉴定均为阳性重组质粒进行序列测定。测序鉴定正确的菌体即为小鼠IL-38重组工程菌。测序结果如图4所示。经测序鉴定正确，即为重组小鼠IL-38基因工程菌。

6)小鼠IL-38蛋白的诱导表达

将小鼠IL-38重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜；次日，以1:50比例扩大培养，37℃、210r/min震荡培养1.5～2h，至OD600达到0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG进行诱导表达，PCR诱导条件为：20℃，100r/min，20h，获得菌体。

7)小鼠IL-38蛋白的纯化：采用超声破碎法将获得的菌体裂解，离心取上清液，用Ni-NAT对上清液进行纯化，获得纯度达到95％以上的小鼠IL-38蛋白。

将收集的样品作SDS-PAGE分析，结果如图5所示，如图5可见，经IPTG诱导，经鉴定的重组小鼠IL-38基因工程菌可表达IL-38蛋白，且其主要存在于上清中，经Ni-NAT纯化，可获得纯度95％以上的IL-38蛋白。

收集到的样品小鼠IL-38蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明生产的小鼠IL-38主要为可溶性成分，纯化后相对的生物学活性较高。

<110> 辽宁大学

<120> 一种小鼠IL-38的生产方法

<160> 2

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213>小鼠IL-38

<400> 1

atgtgctctc tgccgatggc tcgttattat attattaaag atgctcacca gaaagctctg 60

tatacccgta acggtcagct gctgctgggt gatccggata gcgataacta ttctccggaa 120

aaagtttgca tcctgccgaa ccgtggtctg gatcgttcta aagttccgat ttttctgggt 180

atgcagggtg gttcttgctg tctggcttgt gttaaaaccc gtgaaggtcc gctgctgcag 240

ctggaagatg ttaacatcga agatctgtat aaaggtggtg aacagaccac ccgtttcacc 300

ttcttccagc gtagcctggg tagcgcgttc cgtctggaag ctgcagcttg tccgggttgg 360

ttcctgtgcg gtccggctga accgcagcag ccggttcagc tgaccaaaga atctgaaccg 420

tctacccata ccgaatttta ttttgaaatg agccgttaa 459

<210> 2

<211> 201

<212> 氨基酸

<213>小鼠IL-38蛋白

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val

1 5 10 15

Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met

20 25 30

Gly Arg Gly Ser Glu Phe Met Cys Ser Leu Pro Met Ala Arg Tyr

35 40 45

Tyr Ile Ile Lys Asp Ala His Gln Lys Ala Leu Tyr Thr Arg Asn

50 55 60

Gly Gln Leu Leu Leu Gly Asp Pro Asp Ser Asp Asn Tyr Ser Pro

65 70 75

Glu Lys Val Cys Ile Leu Pro Asn Arg Gly Leu Asp Arg Ser Lys

80 85 90

Val Pro Ile Phe Leu Gly Met Gln Gly Gly Ser Cys Cys Leu Ala

95 100 105

Cys Val Lys Thr Arg Glu Gly Pro Leu Leu Gln Leu Glu Asp Val

110 115 120

Asn Ile Glu Asp Leu Tyr Lys Gly Gly Glu Gln Thr Thr Arg Phe

125 130 135

Thr Phe Phe Gln Arg Ser Leu Gly Ser Ala Phe Arg Leu Glu Ala

140 145 150

Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Gly Pro Ala Glu Pro Gln

155 160 165

Gln Pro Val Gln Leu Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ser Thr His Thr

170 175 180

Glu Phe Tyr Phe Glu Met Ser Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

185 190 195

His His His His His His

200