本发明涉及菌膜防治领域，具体涉及浒苔多糖及其降解产物浒苔寡糖，以及药物组合物以及其在抗菌方面的用途。
背景技术：
：临床持续性感染及院内获得性感染出现的原因多与病原菌在宿主体或医疗材料表面内形成菌膜(biofilm)相关。菌膜又称生物被膜，是具有特殊微环境的细菌群落及其胞外基质复合体。细菌或真菌群落附着于物体表面或气液分界，分泌大量胞外多糖、蛋白质和dna，从而形成菌膜聚落。菌膜态病原菌对抗生素等药物的耐受性往往比浮游态菌提高数百至上千倍。传统药物对于治疗菌膜相关感染的效果欠佳，因此，临床上急需可有效针对菌膜状态病原菌发挥作用的药物。浒苔(enteromorphaprolifera)是绿藻门，绿藻纲，石莼目，浒苔属的藻类植物，俗称浒苔、海青菜、苔菜、苔条。浒苔多糖是浒苔的主要活性物质，研究表明，浒苔多糖具有显著的降血糖、血胆固醇作用，对ehrlich癌和皮肤癌有显著的抑制活性。浒苔多糖是一种由鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸组成并富含硫酸基的聚阴离子糖链。tangetal.(2013)研究发现浒苔多糖的单糖组成为鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸，质量百分比分别为64.2％、18.2％、12.6％，硫酸基含量为19.6％，多糖分子量为103.51kda。rayetal.(2006)研究表明浒苔中鼠李糖为(1→2,4)键连接，葡萄糖醛酸为(1→4)键连接，木糖为(1→4)键连接，硫酸基处于鼠李糖c-3端形成鼠李糖硫酸酯。研究发现浒苔多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、提高免疫力、抗氧活性等功效。浒苔多糖含有两种潜在功能糖成分：葡萄糖醛酸、鼠李糖硫酸酯。其中，葡萄糖醛酸有护肝解毒作用，是功能饮料、食品、化妆品的主要添加剂。而鼠李糖可参与合成香料、强心苷类药物和外源凝集素等，具有明显的免疫活性。与鼠李糖硫酸酯结构相似的岩藻糖硫酸酯被证实具有神经传导、免疫调节等重要生理功能，因此鼠李糖硫酸酯是一种潜在的功能成分。然而，在应用过程中，多糖较高的分子量和粘度降低了其生理功能。中国专利申请cn105695537a公开了一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法，其制备了一种糖基化浒苔寡糖，对于对á-葡萄糖苷酶具有强抑制活性，能显著促进肠道益生菌增殖，并且具有改善肠道菌群的功效，对肠道益生菌双歧杆菌增殖有明显促进作用。中国专利申请cn106305721a公开了一种绿藻寡糖植物疫苗及其制备方法，所述的植物疫苗是由天然绿藻浒苔为原料经精准提取制备的浒苔寡糖和昆布氨酸组成，通过控制反应条件，产生不同大小的寡糖，其能诱导植物的某些与抗病抗逆相关分子的基因的表达，从而提高植物的抗逆性。浒苔寡糖疫苗能够显著刺激植物的免疫系统反应，在抗小麦全锈病和抗小麦纹枯病中的应用中效果显著。中国专利申请cn104962490a公开了一种制备浒苔微生物菌剂的方法,包括如下步骤：s1，取新鲜浒苔制成浆液，得浒苔浆料；s2，将保存的细黄链霉菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌和膜醭比赤酵母菌进行无菌培养，得到生物菌种；s3，取步骤s1得到的浒苔浆料30-35重量份，步骤s2得到的生物菌种3-5重量份，以及糖蜜3-5重量份、助剂8-12重量份和水40-60重量份混匀，并控制温度低于35℃进行有氧发酵培养；s4，当菌液中芽孢杆菌类80％以上的繁殖体转变为空型芽孢时，停止通气和搅拌、继续进行厌氧发酵；s5，将所得发酵产物检验并包装，即得液体菌剂。该申请公开的菌剂可以适用于农作物种植、畜禽及水产养殖业需求的微生物菌剂，一方面可显著提高农作物、畜禽及水产养殖的产量，另一方面，可用于污染的治理，改良土壤及水质。然而,现有技术中对于浒苔多糖的使用多集中于微生物菌剂,而对于其杀菌的作用则并未报道。发明人惊讶地发现，浒苔多糖及其降解产物浒苔寡糖可有效清除菌膜状态的细菌，此外浒苔多糖及其降解产物浒苔寡糖与抗生素物理混合物的效果显著优于同浓度抗生素。技术实现要素：本发明提供了一种浒苔多糖及其降解产物浒苔寡糖在抗菌方面的用途。本发明提供了一种浒苔多糖，其特征在于，制备浒苔多糖的原料为青岛海域的浒苔。作为上述浒苔多糖一种更好的选择，所述浒苔多糖的分子量范围为5000da～1000000da。本发明还提供了一种浒苔寡糖，所述浒苔多糖的分子量范围为200da～3000da，该浒苔寡糖可由浒苔多糖降解而得到。本发明还提供了一种浒苔寡糖，所述浒苔寡糖中包括木糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖以及葡萄糖醛酸，这些组分的摩尔比值范围为0.5-2:1-3:2-6:0.1-1:1-5。本发明还提供了一种浒苔寡糖，所述浒苔寡糖由木糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖以及葡萄糖醛酸组成，这些组分的摩尔比值范围为0.5-2:1-3:2-6:0.1-1:1-5。本发明提供的浒苔多糖可按照如下方法制备：(1)提供浒苔和水的混合物，该混合物中浒苔和水的质量比为1：15～30，然后加入0.5％～2％的降解酶，在40～70℃条件下反应4～6h，得到反应液；(2)所述反应液经过滤后得到提取液，将提取液在60～80℃下喷雾干燥，获得粗提干粉；(3)所述粗提干粉经溶剂洗涤，静置过夜后，获得沉淀物，喷雾干燥后获得浒苔多糖干粉。进一步的，所述降解酶为木瓜蛋白酶、纤维素酶或果胶酶。所述的反应温度也可以根据实际情况进行调整，如可以调整为20-40摄氏度。作为上述方法一种更好的选择，所述浒苔为原料浒苔烘干后研磨成粉后的粉体。进一步的，步骤3)中的溶剂可为75％的乙醇。进一步的，本发明提供的浒苔多糖可按照如下方法制备：(1)提供浒苔和水的混合物，该混合物中浒苔和水的质量比为1：15～30，然后加入0.5％～2％木瓜蛋白酶，在40～70℃条件下反应4～6h，得到反应液；(2)所述反应液经过滤后得到提取液，将提取液在60～80℃下喷雾干燥，获得粗提干粉；(3)所述粗提干粉经75％乙醇洗涤，静置过夜后，获得沉淀物，喷雾干燥后获得浒苔多糖干粉。作为上述方法一种更好的选择，所述浒苔为原料浒苔烘干后研磨成粉后的粉体。优选的，所述浒苔多糖按照如下方法制备：(1)提供浒苔和水的混合物，该混合物中浒苔和水的质量比为1：20，然后加入1％木瓜蛋白酶，在65℃条件下反应4h，得到反应液；(2)步骤(1)所述反应液过滤，得到提取液，将提取液在60℃度下喷雾干燥，获得粗提干粉；(3)步骤(2)所述粗提干粉经75％乙醇洗涤，静置过夜后，获得沉淀物，喷雾干燥后获得浒苔多糖干粉。进一步的，本发明还提供了制备浒苔寡糖的方法，其包括：浒苔多糖的干粉中加入降解剂，将浒苔多糖降解至浒苔寡糖。所述的降解剂可以为生物降解剂，如酶降解剂；也可以是化学降解剂，如通过自由基降解的方式进行降解。优选的，所述浒苔多糖通过混合三氟乙酸混合后水解降解，得到的反应液冷冻干燥后得到浒苔寡糖。此处三氟乙酸起到了降解剂的作用，其他在此可以使用的化学降解剂包括但是不局限于盐酸、硫酸、过氧化氢和乙酸。优选的，所述浒苔多糖通过酶降解剂进行降解，可以使用的酶降解剂包括纤维素酶、葡聚糖酶、梳理糖苷酶、半乳糖苷酶或木聚糖酶。在本发明的一个实施例内，一定质量的浒苔多糖干粉，加入10mg/ml1m三氟乙酸，在100℃条件下水解60-120min，得到反应液；将反应液冷冻干燥后获得浒苔寡糖干粉。本发明还提供了上述浒苔多糖以及浒苔寡糖用作微生物抑制剂的用途，所述微生物为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。在限定了浒苔寡糖或多糖的组成后，其可以用于对于微生物的抑制，而并非是起到对于微生物的增殖的作用。优选的，其中所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、链球菌、单增李斯特菌。优选的，其中所述的革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌。优选的，其中所述的真菌为白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉菌。本发明还提供了一种用于生物被膜深处微生物的抑制剂的药物组合物，其包含：(1)浒苔多糖和/或浒苔寡糖；(2)一种或多种抗菌药物。所述药物组合物可以以粉体的形式提供，在该药物组合物中，浒苔多糖和/或浒苔寡糖的含量为5-99wt％，抗菌药物的比例可以按照实际需要量进行调整。在必要时，所述药物组合物还可以包括辅剂，所述辅剂可以为用于辅助成型的、调味剂等可以为药学上可以接受的物质。本发明还进一步提供了一种用于生物被膜深处微生物的抑制剂的药物组合物，其包含：(1)浒苔多糖和/或浒苔寡糖；(2)一种或多种抗菌药物；(3)溶剂；其中，所述组合物中浒苔多糖重量浓度为10μg/ml-5000μg/ml优选的，所述组合物中浒苔多糖重量浓度为100-500μg/ml。本发明的药物组合物还可以包括水。优选的，所述溶剂为水。优选的，所述组合物中浒苔多糖和抗生素的质量比例为5:1～1:5。优选的，所述组合物中浒苔多糖和抗生素的质量比例为1:1。优选的，其中所述抗菌药物为氨基糖苷类抗生素。优选的，所述抗菌药物为链霉素、卡那霉素或庆大霉素，更优选链霉素。优选的，所述药物组合物中还含有辅料。本发明还提供了浒苔多糖和浒苔寡糖用于制备药物组合物的用途。本发明涉及浒苔多糖及其降解产物浒苔寡糖作为活性物质，与药学上可接受的辅料制成各种剂型的抗菌膜药物。其中所述药学上可接受的辅料是本领域常规使用的辅料。所述药物辅料是指生产药品和调配处方时所用的赋形剂与附加剂。在具体的实施过程中，本发明可通过多种本领域已知的方法实施应用。其中所述抗菌膜药物更佳地为抗细菌菌膜类药物。所述细菌为本领域常规致病菌。所述细菌较佳地为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。其中革兰氏阳性菌较佳地为金黄色葡萄球菌，其中革兰氏阴性菌较佳地为铜绿假单胞菌。本发明涉及一种具有抗菌膜效用的组合物，其包含浒苔多糖或浒苔寡糖、溶剂和抗菌药物，其中所述组合物中浒苔多糖或浒苔寡糖的重量浓度为10-5000μg/ml，优选地为100-500μg/ml。作为上述抗菌膜效用的药物组合物一种更好的选择，所述溶剂为水。作为上述抗菌膜效用的药物组合物一种更好的选择，所述抗菌药物包括抗生素、抗真菌药物中的一种或多种。所述抗菌药物可以为本领域常规的抗菌药物。所述抗生素较佳地为氨基糖苷类抗生素。所述氨基糖苷抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的糖苷类抗生素。所述抗生素较佳地为链霉素，卡那霉素或庆大霉素。本发明所述抗生素优选地为链霉素。所述组合物中浒苔多糖和抗生素的质量比例为5:1～1:5，优选地为1:1。本发明的积极进步效果在于：实验证明，所述浒苔多糖、浒苔寡糖、浒苔多糖与抗生素物理混合物、浒苔寡糖抗生素物理混合物与对已经形成的细菌生物膜具有较强的破坏作用，杀菌范围广，对生物膜的形成具有良好的抑制作用。同时，所述浒苔多糖、浒苔寡糖、浒苔多糖与抗生素物理混合物、浒苔寡糖抗生素物理混合物能够有效降低细菌以生物膜形式存在时产生的耐药性，提高细菌对传统抗生素的敏感性，降低传统抗生素的使用量。附图说明图1、hplc法鉴定浒苔多糖的分子量分布；图2、hplc-gpc法鉴定浒苔多糖的分子量分布；图3、毛细管电泳法鉴定浒苔多糖的单糖组成；图4、maldi-tof质谱鉴定浒苔寡糖结构。具体实施方式如下为本发明的具体实施方式，其仅用作对本发明的解释而并非限制。实施例1浒苔多糖、浒苔寡糖制备与结构表征在本实施例中，对浒苔多糖、浒苔寡糖进行制备及结构表征。具体实施如下：一定质量浒苔烘干后研磨成粉，加入15～30倍重量的水混匀，然后加入0.5％～2％木瓜蛋白酶，在40～70℃条件下反应4～6h，得到反应液；反应液离心取上清，将上清液在60～80℃下喷雾干燥，获得粗提干粉。将粗提干粉经75％乙醇洗涤，离心获得沉淀物，喷雾干燥后获得浒苔多糖干粉。取一定质量浒苔多糖干粉，加入10mg/ml1m三氟乙酸，在100℃条件下水解60-120min，得到反应液；将反应液冷冻干燥后获得浒苔寡糖干粉。本领域技术人员也可以参见
发明内容部分的其他技术方案对反应条件进行优化，如选用纤维素酶、葡聚糖酶、梳理糖苷酶、半乳糖苷酶或木聚糖酶对其进行降解，其加入量可以和木瓜蛋白酶相同，也可以根据实际需要进行调整。本发明通过hplc法对浒苔多糖和浒苔寡糖的分子量分布进行了表征，确定浒苔多糖分子量范围是5000da～1000000da(见附图1)，浒苔寡糖分子量范围是200da～3000da(见附图2)，相应的分子量分布见下表：时间峰面积峰高峰宽对称因子峰面积％area％logmw分子量da113.9651846988.414351.41.7780.70751.651.63.45698652864.088939217.0011642169.580677.70.30441.17645.87745.8772.6861461485.4517824317.55683834.83574.60.38160.5312.3422.3422.5452316350.9389723418.1486475.9346.80.28910.2050.1810.1812.3949228248.2691744通过毛细管电泳法对浒苔多糖的单糖组成进行了测定，确定其组分包括木糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、以及葡萄糖醛酸，其中鼠李糖及葡萄糖醛酸为浒苔多糖的主要组成成分(见附图3)以及下表。使用maldi-tof质谱对浒苔寡糖结构进行了质谱分析，确定其主要为鼠李糖及硫酸化鼠李糖形成的核心单元，并与木糖及葡萄糖醛酸组成其寡糖主要结构(见附图4)。申请人还提供了不同的浒苔寡糖组合物，其组成如下：实施例2浒苔多糖、浒苔寡糖对金黄色葡萄球菌菌膜破坏效果实验在本实施例中，对浒苔多糖、浒苔寡糖对菌膜状态下对金黄色葡萄球菌菌膜破坏效果进行了研究。具体实施如下：所用的野生型金黄色葡萄球菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。金黄色葡萄球菌在tsb液体培养基37℃摇动培养过夜后，取100μl～2×107cfu菌液加入到96孔板37℃静态培养24小时形成成熟菌膜。分别制备浒苔多糖、浒苔寡糖、浒苔多糖+链霉素混合物(质量比1:1)、浒苔寡糖+链霉素混合物(质量比1:1)用于本研究。待菌膜成熟后，移去上清液体，分别加入100μl含有250μg/ml上述样品的tsb液体培养基。未处理组加入100μltsb液体培养基。阳性对照组加入100μl含有250μg/ml链霉素的tsb液体培养基。37℃下作用24小时后采用结晶紫染色法检测菌膜破坏效果。实验结果表明，浒苔多糖、浒苔寡糖组、浒苔多糖+链霉素混合物组、浒苔寡糖+链霉素混合物组均具有较好的菌膜清除效果，其中浒苔多糖+链霉素混合物组最优，对比链霉素组显著提高了菌膜清除效果，具体结果参见下表1。表1金黄色葡萄球菌菌膜破坏效果组菌膜清除率(％)未处理组0浒苔多糖17.1浒苔寡糖16.4浒苔多糖+链霉素混合物37.8浒苔寡糖+链霉素混合物14.3链霉素0申请人还提供了其他的对于革兰氏阳性菌菌膜的处理效果：组菌膜种类菌膜清除率(％)浒苔多糖链球菌12.3浒苔寡糖链球菌16.0浒苔多糖单增李斯特15.1浒苔寡糖单增李斯特18.5未处理组链球菌0未处理组单增李斯特0实施例3浒苔多糖、浒苔寡糖对铜绿假单胞菌菌膜破坏效果实验在本实施例中，对浒苔多糖、浒苔寡糖对菌膜状态下对铜绿假单胞菌菌膜破坏效果进行了研究。具体实施如下：所用的野生型铜绿假单胞菌pao1来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。铜绿假单胞菌在lb液体培养基37℃摇动培养过夜后，取100μl～2×107cfu菌液加入到96孔板30℃静态培养24小时形成成熟菌膜。分别制备浒苔多糖、浒苔寡糖用于本研究。待菌膜成熟后，移去上清液体，分别加入100μl含有250μg/ml上述样品的lb液体培养基。未处理组加入100μllb液体培养基。阳性对照组加入100μl含有250μg/ml链霉素的lb液体培养基。30℃下作用24小时后采用结晶紫染色法检测菌膜破坏效果。实验结果表明，浒苔多糖、浒苔寡糖组均具有较好的菌膜清除效果，其中浒苔多糖的效果最优，对比链霉素组显著提高了菌膜清除效果，具体结果参见下表2表2铜绿假单胞菌菌膜破坏效果组菌膜清除率(％)未处理组0浒苔多糖35.0浒苔寡糖26.9链霉素30.1申请人还提供了其他的对于革兰氏阴性菌菌膜的处理效果：组菌膜种类菌膜清除率(％)未处理组大肠杆菌0浒苔多糖大肠杆菌27.6浒苔寡糖大肠杆菌23.3未处理组沙门氏菌0浒苔多糖沙门氏菌28.9浒苔寡糖沙门氏菌29.1实施例4浒苔多糖、浒苔寡糖对白色念珠菌菌膜抑制效果实验在本实施例中，对浒苔多糖对菌膜状态下对白色念珠菌菌膜抑制效果进行了研究。具体实施如下：所用的野生型白色念珠菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。白色念珠菌在ypd液体培养基30℃摇动培养过夜后，取100μl～2×107cfu菌液加入到96孔板。分别加入100μl含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml浒苔多糖的ypd液体培养基。未处理组加入100μlypd液体培养基。30℃静态培养24小时后采用结晶紫染色法检测菌膜抑制效果。实验结果表明，浒苔多糖具有较好的真菌菌膜抑制效果，其中2mg/ml浒苔多糖的效果最优，具体结果参见下表3表3白色念珠菌菌膜抑制效果组菌膜清除率(％)未处理组01mg/ml浒苔多糖5.22mg/ml浒苔多糖30.63mg/ml浒苔多糖15.54mg/ml浒苔多糖13.35mg/ml浒苔多糖28.8申请人还提供了其他的对于真菌菌膜的处理效果：最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12