不明原因发热的标记物、检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及不明原因发热的标记物、检测方法及其应用。
背景技术：
：不明原因发热(feverofunknownorigin,fuo)，是指发热持续时间超过3周，体温多次在38.3℃以上，经详细询问病史、体格检查和常规实验室检查仍不能明确诊断。它是临床上较为多见的症状或病患，各个年龄段均可发生，以午后或傍晚发作为多见。不明原因发热的诊断关键在找出病因，从诊断学角度临床上将发热分为4类：即感染性疾病、恶性疾病、结缔组织病和炎症性血管疾病及其他可引起发热的疾病。其中以感染性疾病最为常见，能够占到所有不明原因发热的60-70％左右。另外肿瘤和自身免疫病各占10-15％左右；恶性肿瘤有时难以诊断，如慢性白血病、淋巴瘤、肾细胞癌、转移癌，它们均可引起不明原因发热。还有一部分患者最终也难以明确诊断占10-20％。自身免疫病中血管炎最为多见；肿瘤中65岁以前淋巴瘤多见，65岁后胃肠道肿瘤多见。人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus，hcmv)属疱疹病毒科巨细胞病毒属，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，基因组长度为256kb，可编码165个基因。hcmv基本结构主要包括作为遗传物质双链线性dna核心(包裹于二十面体核衣壳中，外覆多种蛋白基质构成的内膜)和作为保护性的脂质磷脂双分子层外膜(膜上覆盖多种糖蛋白)，成熟的hcmv病毒颗粒直径可达200-300nm。hcmv可引起人类巨细胞病毒感染。通常情况下，很多正常人身上都潜伏有巨细胞病毒，潜伏部位常在唾液腺、乳腺、肾脏、子宫颈、睾丸、白细胞以及其它腺体中，病毒可长期或间歇地自唾液、乳汁、尿液、精液及子宫颈分泌物中排出。在人体内，hcmv可以感染多种不同类型细胞包括单核细胞、巨噬细胞、t淋巴细胞等，并导致多种不同疾病。流行病学调查显示，50％～90％的人群都存在hcmv的感染，且随着年龄增长，hcmv感染率也不断上升。在正常情况下，人体感染hcmv后并无任何症状，但是当人体免疫系统受到抑制/紊乱时，hcmv可被异常激活并导致多种疾病发生。在具备免疫能力的成人人群中，hcmv异常激活可引起的疾病包括单核细胞增多综合征、关节痛和关节炎、溃疡性结肠炎、肺炎、肝炎、无菌性脑膜炎和心肌炎等；在胚胎期和新生儿中感染hcmv可导致新生儿死亡、耳聋、黄疸、肝脾肿大、紫癜、神经发育异常等；对于免疫缺失/受抑个体(如hiv患者、器官移植患者、造血干细胞抑制患者)，hcmv感染和激活可导致视网膜炎、消化系统炎症、器官移植失败等。由于在免疫受抑或免疫低下人群、胎儿、新生儿中，hcmv的感染可导致多种疾病，因此这类人群的hcmv感染激活情况检测和监控对于合适的临床治疗方案确定是十分必要的。因此，寻找对不明原因发热、特别是hcmv感染疾病的检测及生物标志物是该领域亟待解决的问题之一。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种不明原因发热特别是hcmv感染疾病的检测标记物。本发明的另一个目的是提供一种用于检测不明原因发热特别是hcmv感染疾病的标记物的探针。本发明的又一个目的是提供上述不明原因发热特别是hcmv感染疾病标记物的用途，包括制备相应的试剂盒和生物芯片。本发明的另一个目的是提供检测上述不明原因发热特别是hcmv感染疾病的标记物的方法。在本发明的第一方面，提供了一种fuo特异性标记物及其检测试剂的用途，用于制备诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于(i)判断检测对象是否患有不明原因发热，和/或(ii)判断检测对象发生不明原因发热的风险(易感性)，其中，所述的fuo特异性标记物选自下组a：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d、或其组合。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物包含组a中的任意两种、三种、或更多种mirna(如4、5、6种或全部mirna)。在另一优选例中，所述的判断包括辅助判断和/或治疗前判断。在另一优选例中，所述的判断是将来自测试对象的样本的fuo特异性标记物含量a1与正常人群的相应fuo特异性标记物含量a0相比较，若a1显著高于a0，则说明检测对象患有不明原因发热或发生不明原因发热的风险高。在另一优选例中，所述“显著高于”指a1/a0≥2，较佳地a1/a0≥2.5，更佳地a1/a0≥3.0。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物为mir-us4-3p和mir-ul70-5p，较佳地，a1/a0≥4.5。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物为mir-us29-3p、mir-ul122-3p和mir-us33-3p，较佳地，a1/a0≥2.5。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物为mir-us5-2-3p、mir-us4-5p和mir-us25-2-3p，较佳地，a1/a0≥3.5。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物为mir-ul1148d，较佳地，a1/a0≥2。在另一优选例中，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。在另一优选例中，所述的诊断试剂或诊断试剂盒用于检测血液样本、血浆样本、或血清样本，较佳地为外周血样本。在另一优选例中，所述的fuo是指不明原因发热(feverofunknownorigin,fuo)。在另一优选例中，所述的不明原因发热包括感染性疾病、恶性疾病、结缔组织病、炎症性血管疾病引起的疾病，和非感染性非恶性非结缔组织病非炎症性血管疾病引起的不明原因发热。在另一优选例中，所述的不明原因发热为炎症性血管疾病引起的发热。在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的检测对象为感染了人类巨细胞病毒的人。在另一优选例中，所述的检测试剂包括核酸芯片或探针。在另一优选例中，所述的探针偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述的fuo特异性标记物用作标准品。在本发明的第二方面，提供了一种检测不明原因发热的标记物组合，所述的标记物组合包含两种或多种选自下组的mirna：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d、或其组合。在另一优选例中，所述的mirna为hcmvmirna，较佳地，所述的mirna在人体血清/血浆中稳定存在。在本发明的第三方面，提供了一种诊断试剂盒，所述的试剂盒含有：(a)检测本发明第二方面所述标记物组合的检测试剂；和(b)说明书，所述说明书注明所述试剂盒用于(i)判断检测对象是否患有不明原因发热，和/或(ii)判断检测对象发生不明原因发热的风险(易感性)。在另一优选例中，所述的试剂盒还包含本发明第二方面所述的标记物组合用作标准品。在另一优选例中，所述的检测试剂包括核酸芯片或探针组合。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括检测配套的样品前处理试剂以及使用说明书。在另一优选例中，所述的说明书记载了检测方法以及根据a1值进行判断的方法。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括fuo特异性标记物用作标准品。在本发明的第四方面，提供了一种探针组合，所述的探针组合包含检测两种或多种选自下组的mirna的探针：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d、或其组合。在另一优选例中，所述的探针为荧光探针。在本发明的第五方面，提供了一种核酸芯片，所述的核酸芯片包含本发明第四方面所述的探针组合。在本发明的第六方面，提供了一种(i)判断检测对象是否患有不明原因发热，和/或(ii)判断检测对象发生不明原因发热的风险(易感性)的方法，包括步骤：(a)提供检测对象的样本；(b)测定所述样本中fuo特异性标记物的含量为a1；和(c)将步骤(b)与正常人群样本的fuo特异性标记物含量a0相比较，若a1显著高于a0，则说明检测对象患有不明原因发热或发生不明原因发热的风险高。在另一优选例中，所述的测试对象为人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述测试样本为血液样本、血浆样本和/或血清样本。在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。在另一优选例中，在步骤(b)中，使用选在下组的方法检测fuo特异性标记物的含量：反转录聚合酶链式反应方法、实时荧光定量聚合酶链式反应方法、流式细胞仪检测方法、生物芯片方法、或其组合。在另一优选例中，所述的检测方法为rt-pcr方法，较佳地，包括以下步骤：1)提取受试者的血清/血浆总rna，通过rna逆转录反应得到cdna样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cdna样品；2)用微小核糖核酸设计引物进行pcr反应；3)进行pcr产物的琼脂糖凝胶电泳；和4)eb染色后在紫外灯下观察结果。在另一优选例中，所述的检测方法为real-timepcr方法，较佳地，包括以下步骤：1)提取受试者的血清/血浆总rna，通过rna逆转录反应得到cdna样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cdna样品；2)用微小核糖核酸设计引物；3)加入荧光探针进行pcr反应；和4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。在本发明的第七方面，提供了一种fuo特异性标记物调控剂的用途，用于治疗不明原因发热，其中，所述的fuo特异性标记物为选自下组的mirna：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d、或其组合。在另一优选例中，所述的调控剂包含抑制剂和促进剂。在另一优选例中，所述的mirna促进免疫反应，并且调控剂为促进剂。在另一优选例中，所述的mirna抑制免疫反应，并且调控剂为抑制剂。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了正常对照、血管炎患者、原因不明发热者血清/血浆中hcmvmirna的绝对浓度。其中，正常对照10例；血管炎(vasculitis)患者4例；fuo代表不明原因发热患者，共10例。其中，各图分别显示了正常对照、血管炎患者、原因不明发热者血清/血浆中hcmv-mir-ul36-3p、hcmv-mir-ul36-5p、hcmv-mir-ul112-5p、hcmv-mir-ul59、hcmv-mir-us4-3p、hcmv-mir-us4-5p、hcmv-mir-us22-3p、hcmv-mir-us29-3p、hcmv-mir-us33-5p的绝对浓度。图2显示了不明原因发热患者血浆hcmvmirna表达结果。纵坐标表示的是循环数的差异，一般循环数差1表示变化2倍。其中，图2a显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul1148d的ct值。图2b显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul70-5p的ct值。图2c显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul22-5p的ct值。图2d显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul36-3p的ct值。图2e显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-us33-5p的ct值。图2f显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-us4-5p的ct值。图2g显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul122-3p的ct值。图2h显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-us5的ct值。图2i显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-ul122-5p的ct值。图2j显示了不明原因发热患者血浆hcmv-mir-us25-5p的ct值。图3显示了hcmvmirna潜在人源靶基因的生物信息学结果。其中，图3a显示了hcmv-mir-ul36-3p与靶基因bves的比对结果。图3b显示了hcmv-mir-ul59与靶基因bves的比对结果。图3c显示了hcmv-mir-ul36-3p与靶基因vapa的比对结果。图3d显示了hcmv-mir-us33-5p与靶基因vapa的比对结果。图3e显示了hcmv-mir-ul69与靶基因ceacm1的比对结果。图3f显示了hcmv-mir-ul59与靶基因ceacm1的比对结果。图4显示了109例不明原因发热患者的年龄和患病时间统计结果。图5显示了不明原因发热者、正常对照组血浆hcmvmirna相对于mir2911的表达量。正常对照组38例，不明原因发热者43例。图6显示了不明原因发热者、正常对照组血浆hcmvmirna相对于mir2911的表达量。正常对照组68例，不明原因发热者66例。图7显示了fuo患者不同hcmvmirna阳性个数对应外周血白细胞的含量。图8显示了fuo患者不同hcmvmirna阳性个数对应外周血淋巴细胞的含量。图9显示了fuo患者不同hcmvmirna阳性个数对应外周血c反应蛋白的含量。具体实施方式本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现不明原因发热患者血清中hcmvmirna的表达显著高于正常对照，参与炎症反应调节、逃避宿主免疫监控、维持自身潜伏和复制，表明血清中hcmvmirna具有重要的生理病理功能，其对于hcmv感染疾病的诊断、病情监控及发病机制研究具有重要意义。为寻找不明原因发热特别是hcmv感染疾病的检测标记物并对其进行准确检测，本发明人研究不明原因发热患者血清/血浆中hcmvmirna的特异性变化，提出了以血清/血浆hcmvmirna作为不明原因发热的检测标记物，建立一种体外检测血清/血浆hcmvmirna的方法，通过检测特定hcmvmirna的特异性变化来进行诊断，疾病鉴定和病程监控，复发及预后、并发症发生的预测。不明原因发热不明原因发热(feverunknownorigin,fuo)的医学标准为:1)发热持续时间≥3周；2)体温多次>38.3℃；3)经≥1周完整的病史询问，体格检查和常规实验室检查后仍不能确诊。不明原因发热的诊断关键在找出病因，从诊断学角度临床上将发热分为4类：即感染性疾病、恶性疾病、结缔组织病和炎症性血管疾病及其他可引起发热的疾病。其中以感染性疾病最为常见，能够占到所有不明原因发热的60-70％左右；相关的感染性疾病中，结核(尤其是肺外结核)、腹腔脓肿及盆腔脓肿最为常见。腹内脓肿见于穿孔后的空腔脏器(如阑尾炎)、憩室炎、恶性肿瘤及创伤，也见于亚急性细菌性心内膜炎、窦炎、骨髓炎及口腔脓肿。另外肿瘤和自身免疫病各占10-15％左右；恶性肿瘤有时难以诊断，如慢性白血病、淋巴瘤、肾细胞癌、转移癌，它们均可引起不明原因发热。还有一部分患者最终也难以明确诊断占10-20％。自身免疫病中血管炎最为多见；肿瘤中65岁以前淋巴瘤多见，65岁后胃肠道肿瘤多见。超过65岁老年不明原因发热患者常患多系统炎症，如颞动脉炎或风湿性、多发性肌病。肝硬化及肝炎(酒精性、肉芽肿性及类狼疮性)的并发症也可能引起不明原因发热。人类巨细胞病毒已知人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus，hcmv)可引起人类巨细胞病毒感染；在人体内，hcmv可以感染多种不同类型细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、t淋巴细胞等，并导致多种疾病。hcmv能编码mirna，hcmvmirna在宿主生理病理过程中发挥重要作用，参与炎症反应调节、逃避宿主免疫监控、维持自身潜伏和复制等。在本实施例中，对hcmv进行研究，表明经hcmv感染后，血清/血浆中mirna水平会发生应答变化。并且利用这些应答mirna可辅助诊断感染原，具较高诊断价值。hcmvmirna如本文所用，术语“hcmvmirna”、“hcmv来源mirna”、“hcmv应答mirna”是指人类巨细胞病毒编码的mirna,这些mirna在hcmv感染过程中作用于信使mrna使其蛋白翻译终止甚至降解。hcmv编码mirna参与炎症反应调节、逃避宿主免疫监控、维持自身潜伏和复制。血清/血浆中的hcmvmirna包括：hcmv-mir-ul22a-5p(hcmvmirnaid：mimat0001574)、hcmv-mir-ul22a-3p(hcmvmirnaid：mimat0001575)、hcmv-mir-ul36-5p(hcmvmirnaid：mimat0001576)、hcmv-mir-ul36-3p(hcmvmirnaid：mimat0004754)、hcmv-mir-ul112-5p(hcmvmirnaid：mimat0026552)、hcmv-mir-ul112-3p(hcmvmirnaid：mimat0001577)、hcmv-mir-ul148d(hcmvmirnaid：mimat0001578)、hcmv-mir-us33-5p(hcmvmirnaid：mimat0001584)、hcmv-mir-us33-3p(hcmvmirnaid：mimat0004756)、hcmv-mir-us5-1(hcmvmirnaid：mimat0001579)、hcmv-mir-us25-1-5p(hcmvmirnaid：mimat0001581)、hcmv-mir-us25-1-3p(hcmvmirnaid：mimat0004755)、hcmv-mir-us25-2-5p(hcmvmirnaid：mimat0001582)、hcmv-mir-us5-2-3p(hcmvmirnaid：mimat0001580)、hcmv-mir-us5-2-5p(hcmvmirnaid：mimat0026553)、hcmv-mir-us25-2-3p(hcmvmirnaid：mimat0001583)、hcmv-mir-us4-3p(hcmvmirnaid：mimat0026628)、hcmv-mir-us4-5p(hcmvmirnaid：mimat0003341)、hcmv-mir-us29-5p(hcmvmirnaid：mimat0028167)、hcmv-mir-us29-3p(hcmvmirnaid：mimat0028168)、hcmv-mir-us22-3p(hcmvmirnaid：mimat0028166)、hcmv-mir-us22-5p(hcmvmirnaid：mimat0028165)、hcmv-mir-ul70-5p(hcmvmirnaid：mimat0003342)、hcmv-mir-ul70-3p(hcmvmirnaid：mimat0003343)、hcmv-mir-ul59(hcmvmirnaid：mimat0029122)、hcmv-mir-ul69(hcmvmirnaid：mimat0029123)。在一优选例中，作为不明原因发热标志物的hcmvmirna包括：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d中的一种或多种。检测试剂本发明的检测试剂包括探针组合、核酸芯片。探针，是指基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。核酸芯片，又名dna芯片、基因芯片(genechip)或基因微阵列(microarray)，指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的dna探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。换言之，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的dna片段(基因探针)有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的dna探针阵列，与电子计算机上的电子芯片十分相似所以被称为基因芯片。优选的，本发明的探针组合或基因芯片检测两种或多种选自下组的mirna的探针：mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d、或其组合。本发明的主要优点包括：(a)本发明提供的特异的hcmvmirna作为诊断不明原因发热的标记物，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。(b)血清/血浆中的hcmvmirna作为新的疾病标记物，将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。(c)基于此制备的用于检测血清/血浆hcmvmirna的试剂盒投入实践使用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通过最精简的探针库来检测血清/血浆hcmvmirna水平能拓展不明原因发热的诊断方法，具有极重要的临床应用潜力和价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。通用方法对于本发明的实施例，通用方法如下：1.血清/血浆样本要求及处理方法1.1样本要求(1)样本类型：血清。血清以空腹静脉血分离为好。采血半小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无rna酶的无菌微量离心管中。(2)血清样本置室温可稳定保存24小时，2℃-8℃可稳定保存7天，-20℃长期保存。(3)血清样本提取出的rna溶液，rna溶于rnaase-free的水置于-80℃保存1.2处理方法：(1)将全血样本处理成血清：采集静脉血2ml，于5ml洁净离心管中，不抗凝。静置30分钟后，5000rpm离心5分钟，取其上清。如果样本不立即使用，需-18℃以下保存。本试剂盒所需血清样本体积为300μl。(2)血清样本的rna提取用酚氯仿方法抽提血清样本的rna。血浆样本提取、保存、处理方法与血清操作相同。2.real-timepcr方法real-timepcr方法可采用taqman法、荧光染料法。具体操作步骤如下：2.1收集血清/血浆样本，制备cdna样品(1)取100ul样品加入到300ul水中，充分混匀后加入200ul(ph＝4.7-5.5)酸性酚，剧烈震荡混匀后加入200ul氯仿，再次充分震荡后16000g室温离心15分钟。(2)小心吸取上清液(约400ul)加入到800ul异丙醇中，再加入ph＝5.2,3m醋酸钠40ul,充分混匀后-20℃静置1h后,16000g,4度离心20分钟。(3)充分弃上清后，加入75％乙醇1ml,轻柔颠倒数次,16000g,4度离心20分钟。(4)充分弃上清,室温干燥后，加入20uldepc水溶解沉淀，-80度保存。逆转录的反应体系包括rt-pcr的反应体系10μl包括：2μlamv5×buffer、0.5μlamv、1μldntpsmixture(10mmol)、1μlrt-primer、2μlrna、3.5μldepc水。反应程序：step1:16℃30minstep2:42℃30minstep3:85℃5minstep4:4℃forever。2.2设计微小核糖核酸引物2.3pcr反应taqman探针法，包括以下步骤：(1)收集血清/血浆样本；(2)通过酚氯仿方法提取血清/血浆总rna；(3)利用taqmanmicrorna探针、amv反转录酶、茎环rt引物，总rna反转录成cdna。(4)使用taqmanpcr试剂盒和appliedbiosystems7300荧光定量pcr仪进行定量pcr。(5)数据处理方法为△ct法，ct设为反应达到域值时的循环数，一系列已知浓度的合成mirna反转录和扩增，每个mirna的绝对量绘制成标准曲线，血清/血浆mirna表达以u6snrna作为标准化内参或外源性植物小rnamir2911作为外参。提取血清/血浆样本中rna，进行逆转录反应，通过定量pcr反应比较其中所含mirna的量。荧光染料法(evagreen),包括以下步骤：(1)收集血清/血浆样本；(2)通过酚氯仿方法提取血清/血浆总rna；(3)利用amv反转录酶、茎环rt引物，总rna反转录成cdna。(4)使用荧光染料evagreenpcr试剂盒和abiprism7300荧光定量pcr仪进行定量pcr，反应条件为95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。(5)数据处理方法为△ct法，ct设为反应达到域值时的循环数，，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-δct表示，其中δct＝ct样品-ct内参。一系列已知浓度的合成mirna反转录和扩增，每个mirna的绝对量绘制成标准曲线，血清/血浆mirna表达以u6snrna作为标准化内参或外源性植物小rnamir2911作为外参。提取血清/血浆样本中rna，进行逆转录反应，通过定量pcr反应比较其中所含mirna的量。2.4分析处理数据具体地，检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。所有计量资料采用表示。采用spss16.0软件包进行统计学分析处理，多组间比较采用方差分析f检验，组间比较采用成组t检验，p<0.05为具有统计学意义，﹡代表p<0.05，﹡﹡代表p<0.01，﹡﹡﹡代表p<0.001。实施例1不明原因发热患者血清/血浆中应答mirna的筛选本发明征集(从南京总医院检验科收集的废血清)了正常人10例、血管炎患者4例、不明原因发热者10例，利用real-timepcr的方法检测正常对照、血管炎患者、不明原因发热者血清/血浆中hcmvmirna的表达水平。结果如图1所示，血管炎患者血清/血浆中多种hcmvmirna表达水平高于正常对照，如：mir-ul36-3p、mir-ul36-5p、mir-us4-3p、mir-us4-5p、mir-us22-3p、mir-us-29-3p、mir-us33-5p、mir-ul59；原因不明发热者血清/血浆中多种hcmv应答mirna表达水平高于正常对照，如：mir-ul36-3p、mir-ul36-5p、mir-us4-3p、mir-us4-5p、mir-us22-3p、mir-us-29-3p、mir-us33-5p、mir-ul59。结果表明，hcmvmirna可能在上述疾病中发挥重要作用，其对于疾病的诊断、监控及发病机制具有重要作用。实施例2不明原因发热患者标记mirna的验证为了对hcmvmirna的作用进行验证，进一步分析实施例1中正常人、不明原因发热患者(患者表现为发热，发病原因不清)hcmvmirna表达情况，患者基本信息见表1。表1实验所用患者基本信息然后，运用real-timepcr技术对上述患者血清/血浆中全部hcmvmirna(共26种，mirbase19.0)的水平进行检测。结果如图2所示，患者血清/血浆中多种hcmvmirna，比如hcmv-mir-ul148d、hcmv-mir-ul22-5p、hcmv-mir-ul36-3p、hcmv-mir-us33-5p、hcmv-mir-us5、hcmv-mir-ul122-5p、hcmv-mir-us25-5p，表达水平高于正常对照，此结果再次证实hcmvmirna可能在上述疾病中发挥重要作用，其对于疾病的诊断、监控及发病机制具有重要作用。图2中，纵坐标表示的是循环数的差异，一般循环数差一表示变化两倍。不明原因发热(feverunknownorigin,fuo)的医学标准为:1)发热持续时间≥3周；2)体温多次>38.3℃；3)经≥1周完整的病史询问，体格检查和常规实验室检查后仍不能确诊。实施例3对应答mirna的验证/鉴定为进一步探讨hcmvmirna的生理功能及与一些原因不明发热、原因不明免疫性疾病(血管炎、风湿热、原发性胆汁性肝硬化等)发生发展的关系。运用生物信息学方法(http://www.targetscan.org/)对hcmvmirna潜在人源靶基因进行预测生物信息学预测结果见表2和图3，发现hcmv编码mirna可调控多种人源基因的表达。表2生物信息学预测hcmvmirna可调控人源靶基因数目及潜在靶基因从表2和图3可以看出，通过对上述靶基因进行分析显示，多种hcmvmirna靶基因与细胞凋亡、增殖和免疫反应相关(如bcl2l11、cdc42、pdcd4、ccnt2、cd80等)，还有多种hcmvmirna潜在靶基因与内皮细胞特别是血管内皮细胞的功能维持及细胞生理密切相关(见表2中标红色部分及图3)，并且有多个hcmv应答mirna可调控相同血管内皮功能相关靶基因(包括bves、ceacam、vegfa等)，结果表明，hcmvmirna对于人体或宿主功能可能具有重要作用；hcmv本身可能参与了一些自身免疫性疾病如血管炎等疾病发生发展，具有极大的临床研究价值。综合上述研究结果，本发明证实hcmv感染人体后，会分泌一些自身的mirna并进入循环系统如血清/血浆，这些血清/血浆中hcmv来源mirna可以作为hcmv感染疾病诊断标志物，同时，hcmvmirna还可调控多种人类基因的表达，具有重要生理病理功能，可参与多种疾病的发生发展。实施例4不明原因发热患者血清中hcmvmirna表达谱测定及临床价值分析收集较大样本用于研究不明原因发热患者血清中hcmvmirna表达谱测定及分析，包括106例对照组(年龄-性别匹配)；109例不明原因发热患者，其中63例男性患者，46例女性患者。109例不明原因发热患者包括：58例感染疾病患者，19例风湿免疫疾病患者，5例肿瘤疾病患者，13例杂病患者，14例未确诊者。109例不明原因发热患者，年龄、患病时间见图4。从图4可以看出，患者年龄段为18-98岁，发热时间从21天到764天不等，提示患者符合不明原因发热的情况。利用real-timepcr的方法检测正常对照、不明原因发热者血清中hcmvmirna的表达水平。mir2911是作为real-timepcr的标准化外参。在本实施例中，在rna提取过程中加入20μl106fmol/l的人工合成的外源植物mir2911(序列为5’-ggccgggggacgggcuggga-3’，seqidno.:11)作为外参，用于校正rna提取效率和误差，并将待测mirna与mir2911同时进行检测，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，并用仪器自带sds2.0分析软件对扩增曲线进行分析，获得待测mirna和外参mir2911的ct值。根据待测mirna和mir2911的ct值计算出待测样本及对照中血清mirna的相对表达量，计算公式为2-δct，其中δct＝ct待测mirna-ctmir2911。序列信息见表3。表3hcmvmirna序列信息hcmvmirnaid序列seqidno.mir-us4-3pugacagcccgcuacaccucuseqidno.:1mir-us29-3pcccacgguccgggcacaaucaseqidno.:2mir-ul70-5pugcgucucggccucguccagaseqidno.:3mir-us5-2-3puaugauaggugugacgaugucuseqidno.:4mir-ul112-3paagugacggugagauccaggcuseqidno.:5mir-us4-5puggacgugcagggggaugucugseqidno.:6mir-us25-2-3pauccacuuggagagcucccgcgguseqidno.:7mir-us33-3pucacgguccgagcacauccaaseqidno.:8mir-ul1148ducguccuccccuucuucaccgseqidno.:9结果如图5所示，与对照组相比，不明原因发热者中mir-us4-3p、mir-us29-3p、mir-ul70-5p、mir-us5-2-3p、mir-ul122-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p、mir-us33-3p、mir-ul1148d的表达水平高于正常对照，此结果再次证实hcmvmirna可能在上述疾病中发挥重要作用，其对于疾病的诊断、监控及发病机制具有重要作用。进一步验证分析不明原因发热者血清中表达水平上调的hcmvmirna，具体结果见图6。从图6可以看出，与对照组相比，mir-us4-3p、mir-ul70-5p的表达水平约高于对照组5倍，mir-us29-3p、mir-ul122-3p、mir-us33-3p的表达水平约高于对照组3倍，mir-us5-2-3p、mir-us4-5p、mir-us25-2-3p的表达水平约高于对照组4倍，mir-ul1148d的表达水平约高于对照组2.5倍。进一步证实hcmvmirna可能在上述疾病中发挥重要作用，其对于疾病的诊断、监控及发病机制具有重要作用。实施例5hcmvmirna与血液学参数的相关性本实施例分析hcmvmirna与血液学参数的相关性。通过检测分析白细胞、淋巴细胞、c反应蛋白的含量与hcmvmirna表达水平的相关性，验证hcmvmirna参与一些自身免疫性疾病如炎症等疾病发生发展，具有极大的临床研究价值。利用流式细胞仪技术检测白细胞的含量。结果如图7所示，hcmvmirna表达水平增高，白细胞数量增加。hcmvmirna表达水平与白细胞的数量正相关。进一步提示可能是hcmv感染，通过白细胞的变化分析hcmv感染。利用全自动血液分析仪检测淋巴细胞的含量。结果如图8所示，淋巴细胞数量增加，hcmvmirna表达水平降低。hcmvmirna表达水平与淋巴细胞的数量负相关。进一步提示可能是hcmv感染，因为病毒感染淋巴细胞会降低。利用这些应答mirna可辅助诊断感染原，具较高诊断价值。利用特定蛋白分析仪测定c反应蛋白的含量。工作原理为血清c反应蛋白(crp)与试剂中抗人crp抗体结合，形成免疫复合物，一起吸光度增加，在波长340nm和700nm处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加量，可定量检测血清中crp的含量。结果如图9所示，c反应蛋白的含量增加，hcmvmirna表达水平降低。hcmvmirna表达水平与c反应蛋白的含量负相关。说明是hcmv与免疫反应或炎症有关，利用这些应答mirna可辅助诊断感染原，具较高诊断价值。实施例6应答mirna抑制剂可调控免疫反应将hcmv的应答mirna,mir-ul36-3p的抑制剂，人工合成mir-ul36-3p抑制剂转染进细胞。转染随机人工合成mirna抑制剂作为对照(购自lifetechnologies公司)。转染48小时后，提取rna并检测mir-ul36-3p含量，确认mir-ul36-3p表达已被有效下调。随机人工合成mirna抑制剂的序列：guagggaacguaccaccuccc(seqidno.:10)。确认后，使用hcmv感染细胞。感染7小时后，使用western印迹法方法检测靶基因pdcd4含量。程序性细胞凋亡因子4(programmedcelldeath4，简称pdcd4)是一种新的抑癌基因，也是一种与细胞凋亡相关的基因。结果表明，抑制mir-ul36-3p表达，可使pdcd4表达明显降低。hcmvmirna在宿主生理病理过程中发挥重要作用，参与调控体内免疫反应等。实施例7用于诊断不明原因发热的血清/血浆标记物的应用本发明所述hcmvmirna的用途，用于制备检测不明原因发热的试剂、检测芯片或试剂盒。其中，检测不明原因发热的核酸芯片，包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获本发明所述的hcmvmirna。本发明的所述检测不明原因发热的核酸芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的mirna探针，同时通过血清中mirna的整体变化预测和诊断疾病。我们首先通过测序的方法或定量pcr方法确定血清中有一个以上拷贝的mirna，然后合成这些mirna的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪smartarraytm点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括作为内标的u6、trna，人工制备的30个碱基长度的外标，阳性对照hex等。整个点阵分成4个亚阵，每个亚阵有23行，21列，点间距为185μm，点的直径约为130μm，每条探针重复三次。芯片操作流程为：(1)提取血清/血浆中总rna，甲醛变性胶电泳检测总rna的质量；(2)mirna的分离：取50-100μg总rna用ambion’smirnaisolationkit(cat#.1560)分离mirna；(3)mirna样品的荧光标记：利用t4rna连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂交与清洗：将rna溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺；0.2％sds；3×ssc；50×denhardt’ssolution)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％sds，2×ssc的液体中洗4分钟，而后在0.2×ssc液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描：芯片用luxscan10k/a双通道激光扫描仪进行扫描；(6)数据提取及分析：采用luxscan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用sam分析挑选差异表达基因。将定量pcr技术和生物芯片技术双重验证的在不明原因发热及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清/血浆mirna探针，用于制备生物芯片，方法同上。此芯片与传统芯片相比，制作工艺和操作流程没有很大改进，但是此芯片简化了探针库，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备。同时也增加了芯片的针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人的血清/血浆而不需要任何其它组织就可以在早期发现疾病，帮助指导诊断和治疗。另外，本发明所述核酸芯片的用途，用于制备检测不明原因发热的试剂盒。检测不明原因发热的试剂盒中含有本发明所述的核酸芯片或本发明所述的hcmvmirna。用于不明原因发热的诊断，疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价的mirna试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量和半定量pcr技术和生物芯片技术。首先通过测序的方法或pcr方法确定正常血清/血浆中有一个以上拷贝的mirna。然后通过定量pcr技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清/血浆mirna，作为预测是否发生不明原因发热以及诊断病变程度的指标。最后筛选出对应的血清/血浆mirna的数量，这是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括血清/血浆mirna引物，taq酶、dntp等试剂。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的探针库检测mirna的变化趋势，再通过该变化趋势预测不明原因发热发生的可能性或诊断不明原因发热的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加诊断不明原因发热的可能，帮助指导诊断和治疗。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>江苏命码生物科技有限公司<120>不明原因发热的标记物、检测方法及其应用<130>p2017-2436<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>1ugacagcccgcuacaccucu20<210>2<211>21<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>2cccacgguccgggcacaauca21<210>3<211>21<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>3ugcgucucggccucguccaga21<210>4<211>22<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>4uaugauaggugugacgaugucu22<210>5<211>22<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>5aagugacggugagauccaggcu22<210>6<211>22<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>6uggacgugcagggggaugucug22<210>7<211>24<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>7auccacuuggagagcucccgcggu24<210>8<211>21<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>8ucacgguccgagcacauccaa21<210>9<211>21<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>9ucguccuccccuucuucaccg21<210>10<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10guagggaacguaccaccuccc21<210>11<211>20<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggccgggggacgggcuggga20当前第1页12