本发明涉及抗生素的制备方法，尤其涉及一种夫西地酸的制备方法。
背景技术：
：夫西地酸，又名梭链孢酸，是一种典型的高效抗生素。它是由梭链孢属产生的窄谱反抗生素，主要对革兰氏阳性菌特别是对葡萄球菌有很强的抗菌活性。从1962年国外首次报道从梭链孢属真菌的发酵液中发现并提取出夫西地酸，夫西地酸被广泛使用了五十多年，但是仍然对绝大多数葡萄球菌菌株保持较高的抗菌活性和很低的耐药性，特别是对多重耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染有非常好的疗效。尽管夫西地酸在临床的运用多年，但是生产夫西地酸的报道较少，发酵法生产夫酉地酸的研究报道更少。专利号为cn201010150825.3，
专利名称：为《一种夫西地酸的发酵生产方法》的发明专利中，其公开了一种夫西地酸的发酵生产方法。该方法包括：种子的培养、接种前准备以及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段。以多阶段发酵生产梭链孢霉，使得该菌株的次级代谢产物夫西地酸效价有很大提高。该专利公开了通过发酵补加碳源培养基的方式制备夫西地酸，但通过该方法制备夫西地酸发酵水平低，导致夫西地酸产量低，不以利于工业化生产。技术实现要素：为了克服现有技术不足，本发明的目的是提供一种可提高抗生素夫西地酸产量的制备方法。为实现上述目的，发明人提供了一种夫西地酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：13)种子培养：将梭链孢霉菌摇瓶种子液按照10％的接种量接种到灭菌后的种子培养基上，培养周期3天，得到种子液；20)发酵培养:将步骤13)培养好的种子液按照10％的接种量接种到灭菌后的发酵培养基上，培养周期为10天；30)发酵培养过程中，当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，向发酵培养基中添加氮源发酵补料培养基；当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，向发酵培养基中添加碳源发酵补料培养基。本发明采用上述技术方案，在发酵培养过程中，通过向发酵培养基中补加氮源发酵补料培养基，可降低抑制夫西地酸次级代谢的因素，从而提高发酵法生产夫西地酸的产量，即采用补料发酵的方法，减少发酵培养基对夫西地酸次级代谢合成的抑制作用，促进夫西地酸的产物合成，提高发酵单位，整体提高发酵法生产夫西地酸的产量。同时，所述发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，向发酵培养基中添加碳源发酵补料培养基。通过在发酵过程同时控制氨基氮浓度和总糖浓度，可进一步提高发酵单位。进一步，所述氮源包括下列中的一种或任意两种以上：尿素、硫酸铵、玉米浆或酵母粉。本发明所选用的氮源可直接购买，且价格适中，不仅可实现提高发酵法生产夫西地酸的产量，且对生产成本影响不大。进一步，所述碳源包括下列中的一种或任意两种以上：葡萄糖、蔗糖或甘油。由于葡萄糖为单糖，可以快速被菌体利用；蔗糖和甘油为多糖需要转化再利用；上述碳源既可以提供菌体生长所需要的能量物质，又可以提供合成手碳骨架。进一步，所述发酵培养过程中，控制发酵液中氨基氮浓度为40-100ug/ml。由于发酵过程中，若氨基氮过低，则培养基中含氮的营养物不足影响菌体生长代谢；若氨基氮过高，则培养基中含氮的营养物过量，同样影响菌体生长代谢。因此，本发明通过控制培养基中氨基氮浓度为40-100ug/ml，既能满足菌体正常生长，又有利于夫西地酸的代谢合成。进一步，所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，玉米浆40g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。进一步，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，甘油20g/l，玉米浆40g/l，棉子精粉10g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸铵1g/l，七水硫酸镁0.01g/l，七水硫酸亚铁0.1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。进一步，所述步骤13)的种子培养基的灭菌方法为在121℃、0.12mpa条件下灭菌30min。进一步，所述步骤20)的发酵培养基的灭菌方法为在121℃、0.12mpa条件下灭菌30min。进一步，所述步骤13)之前还包括以下步骤：11)将梭链孢霉菌种接种到灭菌后的斜面培养基，在25-27℃培养7-10天，所述斜面培养基为pda培养基；12)将步聚11)培养好的pda斜面加无菌水洗脱制备菌悬液，按1％(v/v)的接种量接种到灭菌后的摇瓶种子培养基中，上旋转摇瓶机，转速250r/min，温度25-27℃，培养2-4天，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，玉米浆40g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。进一步，所述步骤13)种子培养的培养条件为：罐温24-27℃，通入空气，通气量v:v＝1:1.0，罐压0.05mpa，转速300rpm；所述20)发酵培养的培养条件：罐温24-27℃，通入空气，通气量v:v＝1:1.0，罐压0.05mpa，起始转速200rpm，校正溶氧100％；培养过程ph控制6.0-8.0之间，溶氧控制高于或等于40％。本发明的有益效果为：1)本发明采用发酵法制备夫西地酸，通过向发酵培养基中同时补加氮源发酵补料培养基和碳源发酵补料培养基，可大大降低抑制夫西地酸次级代谢的因素，促进夫西地酸的产物合成，提高发酵单位，整体提高发酵法生产夫西地酸的产量。相对现有只添加碳源发酵补料培养基的方案，可大幅度提高发酵单位及夫西地酸的产量。2)本发明在发酵制备夫西地酸过程中，通过控制发酵液中氨基氮浓度为40-100ug/ml，发酵液中总糖浓度大于0.5％，从而促进夫西地酸的产物合成，提高发酵单位。具体实施方式为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。对照实施例1发酵过程不补加发酵补料培养基一种夫西地酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：11)将梭链孢霉菌种接种到灭菌后的斜面培养基，在25-27℃培养7-10天，所述斜面培养基为pda培养基；12)将步聚11)培养好的pda斜面加无菌水洗脱制备菌悬液，按1％(v/v)的接种量接种到灭菌后的摇瓶种子培养基中，上旋转摇瓶机，转速250r/min，温度25-27℃，培养2-4天，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，玉米浆40g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。13)种子培养：将梭链孢霉菌摇瓶种子液按照10％的接种量接种到灭菌后的种子培养基上，培养周期3天，得到种子液；所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，玉米浆40g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。培养条件为：罐温24-27℃，通入空气，通气量v:v＝1:1.0，罐压0.05mpa，转速300rpm；20)发酵培养:将步骤13)培养好的种子液按照10％的接种量接种到灭菌后的发酵培养基上，培养周期为10天；所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖40g/l，甘油20g/l，玉米浆40g/l，棉子精粉10g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸铵1g/l，七水硫酸镁0.01g/l，七水硫酸亚铁0.1g/l，轻质碳酸钙2g/l，消沫剂2g/l，ph7.0-7.2。培养条件：罐温24-27℃，通入空气，通气量v:v＝1:1.0，罐压0.05mpa，起始转速200rpm，校正溶氧100％；培养过程ph控制6.0-8.0之间，溶氧控制高于或等于40％；种子培养基和发酵培养基的灭菌方法均为在121℃、0.12mpa条件下灭菌30min。对照实施例2发酵过程只补加碳源发酵补料培养基在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中的总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液的制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对照实施例3发酵过程只补加氮源发酵补料培养基在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，向发酵培养基中添加发酵补料培养基，所述发酵补料培养基为氮源。所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。所述发酵培养过程中，控制发酵液中氨基氮浓度为40-100ug/ml。实施例1发酵过程同时补加氮源和碳源发酵补料培养基在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对上述对照实施例1、对照实施例2、对照实施例3、实施例1的夫西地酸的发酵结果进行检测，检测结果见表1。表1对照实施例1-3、实施例1的夫西地酸发酵结果实施例批次发酵单位ug/ml体积l产量g对照实施例14339630.2102.6对照实施例24455334.1155.3对照实施例34418533.5140.2实施例14562736.0202.6由表1的检测结果可知：对照实施例2及对照实施例3、实施例1的夫西地酸发酵产量远高于对照实施例1；实施例1的夫西地酸发酵产量在四组实施例中最高。从而说明了：夫西地酸发酵培养过程中向发酵培养基中补加发酵补料培养基，所述发酵补料培养基包括碳源或氮源，可提高夫西地酸的发酵单位及发酵产量；当同时补加碳源和氮源两种发酵补料培养基时，可显著提高夫西地酸的发酵单位及发酵产量。实施例2在实施例1的基础上，将氮源替换为尿素的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述尿素的水溶液的制备方法为：尿素与水按w/v20：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例3在实施例1的基础上，将氮源替换为硫酸铵的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述硫酸铵的水溶液的制备方法为：硫酸铵与水按w/v20：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例4在实施例1的基础上，将氮源替换为棉子粉的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述棉子粉的水溶液的制备方法为：棉子粉与水按w/v20：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例5在实施例1的基础上，将氮源替换为黄豆粉的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述黄豆粉的水溶液的制备方法为：黄豆粉与水按w/v20：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制。实施例6在实施例1的基础上，将氮源替换为酵母粉的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述酵母粉的水溶液的制备方法为：酵母粉与水按w/v20：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对上述实施例2-6的夫西地酸的发酵结果进行检测，结合实施例1检测结果见表2。表2实施例2-6夫西地酸发酵结果实施例氮源批次发酵单位ug/ml体积l产量g实施例1玉米浆4568935.8203.7实施例2尿素4486436.0175.1实施例3硫酸铵4507736.2183.8实施例4棉子粉4446536.2161.6实施例5黄豆粉4468736.1169.2实施例6酵母粉4503236.0181.2由表2可知，所述氮源发酵补料培养基为尿素、硫酸铵、玉米浆或酵母粉时，夫西地酸发酵单位与产量都有显著提高，最优的氮源发酵补料培养基为玉米浆。实施例7在实施例1的基础上，将碳源替换为蔗糖的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述蔗糖的水溶液的制备方法为：蔗糖与水按w/v40：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例8在实施例1的基础上，将碳源替换为甘油的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述甘油的水溶液的制备方法为：甘油与水按w/v40：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例9在实施例1的基础上，将碳源替换为可溶性淀粉的水溶液，其他步骤均与实施例1一致；所述可溶性淀粉的水溶液的制备方法为：可溶性淀粉与水按w/v30：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对上述实施例7-9的夫西地酸的发酵结果进行检测，结合实施例1检测结果见表3。表3实施例1、实施例7-9夫西地酸发酵结果实施例碳源批次发酵单位ug/ml体积l产量g碳源1葡萄糖4543035.9194.9碳源7蔗糖4499335.8178.7碳源8甘油4521636.0187.8碳源9可溶性淀粉4487636.0175.5由表3可知：所述碳源发酵补料培养基为葡萄糖、蔗糖、甘油或可溶性淀粉，夫西地酸发酵单位与产量都有显著提高，最优的碳源发酵补料培养基为葡萄糖。实施例10在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于20ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例11在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于60ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例12在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于80ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例13在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于100ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例14在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于120ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例15在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于0.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于140ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对上述实施例10-15的夫西地酸的发酵结果进行检测，结合实施例1检测结果见表4。表4实施例1、实施例10-15夫西地酸发酵结果由表4可知，补加发酵补料培养基氮源使发酵液中氨基氮控制在40-120ug/ml，夫西地酸发酵单位与产量都有显著提高。实施例16在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于1.0％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例17在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于1.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例18在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于2.0％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例19在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于2.5％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。实施例20在对照实施例1的基础上，增加以下步骤：30)发酵培养过程中，当发酵液中总糖浓度低于3.0％时，连续补加碳源，所述碳源为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖的水溶液制备方法为：葡萄糖与水按w/v60：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得；当发酵液中氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源为玉米浆的水溶液，所述玉米浆的水溶液的制备方法为：玉米浆与水按w/v50：100的比例混合经高温蒸汽121℃灭菌30min后冷却制得。对上述实施例16-20的夫西地酸的发酵结果进行检测，结合实施例1检测结果见表5。表5实施例1、实施例16-20夫西地酸发酵结果实施例总糖浓度％批次发酵单位ug/ml体积l产量g实施例10.54469935.5166.8实施例161.04558636.0201.1实施例171.54553736.0199.3实施例182.04556636.1200.9实施例192.54560136.2202.8实施例203.04557936.0200.8由表5可知：补发酵补料培养基碳源使发酵液中总糖浓度控制不低于0.5％，夫西地酸发酵单位与产量都有显著提高。由上述实施例可知，本发明采用发酵法制备夫西地酸，发酵过程中，当发酵液的氨基氮浓度低于40ug/ml时，连续补加氮源，所述氮源优选为玉米浆，发酵过程控制氨基氮浓度为40-120ug/ml；同时，当发酵液的总糖浓度控制低于0.5％，补加发酵补料培养基碳源，所述碳源最优选为葡萄糖。本发明采用上述技术方案，在发酵培养过程中，通过向发酵培养基中同时补加氮源和碳源发酵补料培养基，可降低抑制夫西地酸次级代谢的因素，从而提高发酵法生产夫西地酸的产量，即采用补料发酵的方法，减少发酵培养基对夫西地酸次级代谢合成的抑制作用，促进夫西地酸的产物合成，提高发酵单位，整体提高发酵法生产夫西地酸的产量。需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的
技术领域：
，均包括在本发明的专利保护范围之内。当前第1页12