一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法与流程

本发明涉及胚胎工程领域，具体是一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法。

背景技术：

随着胚胎工程技术的发展和成熟，目前卵母细胞已实现体外成熟、体外受精、体外培养以及克隆胚胎的生产和培养，而这些技术的发展促使胚胎工程技术商业化成为可能。但体外成熟的卵母细胞数量和质量不能得到保证，从而影响了体外受精、克隆胚胎和胚胎发育的效率，最终影响了胚胎工程技术在生产中的应用与推广。一般，体外获得的卵母细胞都是由不同层数的卵丘细胞包裹而成的，包裹层数越多卵母细胞质量就越好。只有优质的卵母细胞才会发育成熟并成功受精从而形成胚胎。同样地，卵母细胞外周包裹的卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中发挥了重要作用，它与卵母细胞之间会进行信息交流，即：旁分泌和缝隙连接，从而促进了卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育。

要深入发明卵丘细胞中某个基因或蛋白对卵母细胞成熟的影响时，就需要上调或下调处理该基因或蛋白水平的表达，从而观察卵母细胞的成熟是否受到影响，主要是成熟率是否发生变化、一些mrna和蛋白水平是否发生变化以及相关的信号通路是否受到了影响。一般地，此类发明都是通过显微注射实现基因或蛋白表达上调或下调。但是，包裹在卵母细胞外周的卵丘细胞数量比较多，并且卵丘细胞不同于卵母细胞无法实现显微注射，因此无法实现基因或蛋白表达量的上调或下调，从而给实验发明带来了一定程度的困难和影响。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于，提供一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法，包括如下步骤：

(1)成熟碟的制备

取20.83ul卵母细胞体外成熟培养液于200ul离心管中，再加入1ul慢病毒，吹打混匀；将混匀后的成熟液在培养皿中做培养滴，并加入3ml矿物油，将培养皿放在培养箱平衡3-5h；

(2)慢病毒转染卵丘-卵母细胞复合物(cocs)

从卵泡中的挑选出cocs，再用成熟液ivm将cocs清洗三遍；把清洗好的cocs转染30-50h，并在荧光倒置显微镜下拍荧光图片。

优选地，步骤(1)中，培养箱内的温度为38.5℃，co2的体积分数为5％。

优选地，步骤(1)中，培养皿放在培养箱平衡4h。

优选地，步骤(2)中，cocs是从直径为3-5mm卵泡中选出，挑选卵丘包裹层数相同且质量一致的cocs。

优选地，步骤(2)中，cocs转染时间为42h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过慢病毒转染卵丘-卵母细胞复合物来研究卵母细胞成熟中卵丘基因功能的方法，通过慢病毒转染实现干扰卵丘细胞中目的基因或蛋白的表达，从而有效地解决卵丘细胞不能进行显微注射的问题，同时又能很好地发挥卵丘基因在卵母细胞成熟过程中发挥的作用。本发明利用慢病毒转染卵丘-卵母细胞复合物来发明卵母细胞成熟中卵丘基因功能的方法具有实际意义和利用价值：一方面，从成本来看，相比较于显微注射，慢病毒转染只需要消耗一定的试剂和材料，不需要投入大量的人力物力财力。另一方面，从实验操作来看，操作简单，不受实验条件的限制，便于实验者随时进行操作。

综上所述，本发明利用慢病毒转染卵丘-卵母细胞复合物来研究卵母细胞成熟中卵丘基因功能的方法，可以在胚胎工程实验室的科学发明广泛使用，从而促进胚胎生物技术在畜牧业和人类生殖医学中的应用。

附图说明

图1为慢病毒转染前入碟图片,其中a为空白对照组-明场，b为慢病毒阴性对照组-明场，c为慢病毒实验组-明场；

图2为慢病毒转染后入碟图片，其中1a为空白对照组-明场，1b慢病毒阴性对照组-明场,1c慢病毒实验组-明场,2a空白对照组-荧光，2b慢病毒阴性对照组-荧光,2c慢病毒实验组-荧光。

具体实施方式

以下实施例所使用的材料、试剂及其来源。

材料

本发明使用的材料有：国产蓝枪头、黄枪头、白枪头，移液枪2.5μl(eppendorfresearchplus)，100ul(dragonlab，10-100μl)，1ml(dragonlab，100-1000μl)，离心管(200μl，axygen)，35mm×10mm皿(falcon，351008)，记号笔，倒置荧光显微镜(olympus)。

试剂

本发明使用到的试剂有：成熟液ivm(invitromaturationsolution)，lentivirus(吉玛公司)，矿物油(sigma，m8410)。

一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法，包括如下步骤：

1.1.成熟碟的制备

①分别取20.83ul成熟液于3个200ul离心管中，并标记为空白对照组、慢病毒阴性对照组、慢病毒实验组；

②分别加入1ul成熟液、1ul阴性对照慢病毒、1ul实验慢病毒于①中，吹打混匀；

③在35mm培养皿中做培养滴，并加入3ml矿物油；

④在培养皿上做好组别标记，并将培养皿放在38.5℃5％co2培养箱平衡4h。

1.2.慢病毒转染卵丘-卵母细胞复合物(cocs)

①拣出直径在3-5mm卵泡中的cocs，挑选卵丘包裹层数相同且质量一致的cocs；

②用ivm液体将挑选出的cocs清洗三遍；

③把清洗好的cocs随机并平均分在三组中；

④转染42h，并在荧光倒置显微镜下拍荧光图片。

1.3.慢病毒转染cocs实验结果

结果如图1和图2所示，本次实验共分为三组，空白对照组、慢病毒阴性对照组和慢病毒实验组。其中，空白对照组是不做任何处理的，慢病毒阴性对照组是添加了只含绿色荧光标签的lentivirus，慢病毒实验组则是添加了针对目的基因的shrna和带有绿色荧光标签的慢病毒。

在倒置荧光显微镜下观察发现，空白对照组中囊胚滋养层细胞的细胞核均无绿色荧光，慢病毒阴性对照组和慢病毒实验组中囊胚滋养层细胞的细胞核上均有绿色荧光。本发明通过慢病毒转染cocs实现目的基因在卵丘细胞中特异性表达，可以有效实现目的基因敲低，进而可以深入研究该目的基因在卵母细胞成熟过程中是否会影响卵丘的扩散和减数分裂的进程，最终可以确定该目的基因是否在卵母细胞成熟过程中所发挥的重要作用，同时也为后续的深入研究奠定基础。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。