组织DNA提取试剂盒的制作方法

本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种组织dna提取工作液及保存管、试剂盒和提取方法。
背景技术：
：核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取dna是pcr扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥；由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。组织提取与血液提取相比较而言，采集动物组织操作简单、不需要抗凝剂，便于保存和携带运输。所以组织提取dna更具优势。不过在pcr分子诊断过程中，获得的dna的总拷贝数和质量会直接影响到后续检验实验的结果，所以，获得有效、可靠的dna是pcr分子诊断的关键。试剂盒法是目前临床应用广泛且最简便的方法，商品化的dna提取试剂盒种类繁多，性能迥异，但基因组dna提取效率不同。另外，由于临床组织样本量大，采集后通常无法及时进行dna提取即被储存，组织中含有的大量核酸酶会对粪便dna造成严重降解，因此，储存时间对基因组dna提取效率的影响很大。中国发明专利申请(公开号：cn107099527a，公开日：2017.08.29)公开了一种组织dna快速提取试剂盒，包括组分有：组织消化液、裂解液、蛋白酶k、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液。所述裂解液中各成分分别为：tris-hcl的浓度为5～11mmol/l，ph为3.5-4.5；异硫氰酸胍的浓度为5～10mmol/l；氢氧化钠浓度为3～5mmol/l；np-40的浓度为1％～5％；edta-2na的浓度为2～5mmol/l。所述结合液中各成分分别为：tris-hcl的浓度为2～5mmol/l，ph为5.0-6.0；乙醇的浓度为85％～100％。中国发明专利申请(公开号：cn105002159a，公开日：2015.10.28)公开了一种提取人体/动物血液和组织dna的dna提取试剂盒，该试剂盒由ctab细胞裂解液、蛋白质消化酶k、tris-hcl缓冲液和阳离子dna层析柱组成，其中，每100ml的ctab细胞裂解液含有1.5g的ctab、7.5ml的1m、ph为8.0的tris-hcl，5.85g的nacl和3ml的0.5m、ph为8.0的edta。上述两个现有技术中都是忽视了储存时间对基因组dna提取效率的影响，并且这两个现有技术种采用的裂解液和结合液都是不同的液体，在使用的时候增加了配制的工作量，也不利于精简操作流程。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种组织dna保存、裂解、结合三合一工作液，该工作液一个试剂同时具备保存,裂解和结合三大功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的dna进行结合，省时省力，提高效率，便于上机操作。为了实现上述的目的，本发明的一种组织dna保存、裂解、结合三合一工作液，该工作液包括以下的组分：0.1-0.2mtris，20-30mmedta，3-5mguscn，1.0-2.0mnacl，0.8-1.5％sds，1.0-4.0％pvp，ph8.5-9.5；上述的百分比为质量百分比。作为一个具体的实施方式，该工作液包括以下的组分：0.1mtris，25mmedta，4mguscn，1.2mnacl，1％sds，2％pvp，ph9.0；上述的百分比为质量百分比。本发明的guscn和sds能起到裂解的作用；guscn和nacl能起到结合的作用；guscn、edta和pvp能起到保存的作用。guscn和sds在裂解细胞释放出核酸之后，guscn和sds和edta能有效的抑制核酸酶对核酸的降解，同时起到稳定的作用，还能一定程度上洗涤和去垢。各组分相互协同，共同起作用，起到一个试剂同时具备保存裂解和结合三大功能。本发明的另外一个目的是提供一种组织dna保存管，该保存管含所述的工作液。本发明的另外一个目的是提供一种组织dna提取试剂盒，该试剂盒包括保存液、裂解液、结合液、蛋白酶k溶液、洗涤液和洗脱液，所述的保存液、裂解液、结合液均采用所述的工作液。作为本发明的a方案，所述的蛋白酶k溶液包括蛋白酶k17-22mg/ml；所述的洗涤液包括洗涤液i、洗涤液ii和洗涤液ⅳ，洗涤液i含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，ph8.0；洗涤液ii包括：10mmtris，80％乙醇；洗涤液ⅳ包括：85％乙醇；洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。作为本发明的b方案，所述的工作液中加入0.5-1.0％十二烷基-n-甜菜碱；所述的蛋白酶k溶液包括蛋白酶k17-22mg/ml；所述的洗涤液含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，碳酸氢钠35mm，ph9.0；洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。目前，磁珠法提取dna中均要经过2-4次不等的洗涤，不仅消耗时间，而且洗涤后吸取上清时需要较为精细的操作，容易产生污染/不适合实验室外现场操作)和提取效果上也有很多待改进之处，洗涤次数，申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠(碱性略强于醋酸钠和氯化钠)的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂十二烷基-n-甜菜碱，可以实现一步洗涤(申请人的专利：申请号：2019102093130，进行了详细的记载)。本发明的另外一个目的是提供所述的试剂盒提取组织dna的方法。作为a方案试剂盒，本发明采用手动提取的方法提取组织dna，包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.050g的新鲜组织于2ml的ep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液，加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；3)从2mlep管中取500ul的工作液加入到1.5mlep管中，加入10ul的磁珠，充分混匀10分钟；将离心管放到磁力架上1分钟，直到管内的磁珠完全被吸附；用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部液体；4)将离心管从磁力架中取出，加入500ul洗涤液i，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；5)加入500ul洗涤液ii，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；6)加入500ul洗涤液iii，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；室温晾干5-10min；加入100ul洗脱液，在60℃温度下震荡5分钟；然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；7)回收得到的dna；dna应保存于-20℃。作为a方案试剂盒，本发明采用机器自动化的方法提取组织dna，包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.050g的新鲜组织于2mlep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液；3)加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；4)从2mlep管中取500ul的工作液加入到96深孔板第1列或者第七列；参照下表向96孔板中加入相应试剂：5)将96深孔板按要求放入ajpure48型核酸提取纯化仪中；6)将对应的磁针套插入针套卡槽；7)关闭ajpure48型核酸提取纯化仪舱门，按要求选择合适的模板程序或根据提取要求自行编辑程序，运行实验；8)实验完成后，可进行紫外灯消毒，防止污染。作为b方案试剂盒，本发明采用手动提取的方法提取组织dna，包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.050g的新鲜组织于2ml的ep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液，加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；3)从2mlep管中取500ul的工作液加入到1.5mlep管中，加入10ul的磁珠，充分混匀10分钟；将离心管放到磁力架上1分钟，直到管内的磁珠完全被吸附；用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部液体；4)将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；5)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；6)回收得到的dna，保存于-20℃。本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下的特点：(1)保存液能使组织离体后立即得到保护，确保了基因的完整性；(2)一个工作液试剂同时具备保存,裂解和结合三大功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的dna进行结合，省时省力，提高效率，便于上机操作；(3)既适用于手动提取，也能在微孔板中以自动化的方式配套核酸提取仪使用，提取纯度高且操作简便安全，有效避免粪便提取过程中易降解，提取质量差的问题；(4)高浓度、纯度：与磁珠相结合，提取的dna浓度、纯度很高，可直接用于下游实验；(5)试剂盒具有良好的稳定性；(6)试剂不含酚、氯仿等有毒溶剂。附图说明图1为按实施例1手动提取的方法提取组织dna，对提取所得dna采用2％琼脂糖凝胶电泳图片(依次为猪肝、猪肾、猪肠、猪心、猪胃)。图2～4分别为按实施例1手动提取的方法提取组织dna，分别在第一天、第七天、第十四天提取所得dna采用2％琼脂糖凝胶电泳图片。具体实施方式主要试剂和仪器tris、edta、guscn、guhcl、nacl、sds、pvp、guhcl和蛋白酶k溶液由sigma提供；乙醇由国药集团生产；本申请检测方法中所用磁珠由qiagen生产(取自magattractdnakit，enriching试剂盒中的磁珠为试剂盒自带)。检测样本来源验证本申请试剂盒dna提取效果时使用的粪便样本来源来自合作医疗检测机构正常采集的样本。实施例1一、配方：1、工作液包括以下的组分：0.1mtris，25mmedta，4mguscn，1.2mnacl，1％sds，2％pvp，ph9.0；上述的百分比为质量百分比；2、蛋白酶k溶液包括蛋白酶k20mg/ml；3、洗涤液包括洗涤液i、洗涤液ii和洗涤液ⅳ，洗涤液i含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，ph8.0；洗涤液ii包括：10mmtris，80％乙醇；洗涤液ⅳ包括：85％乙醇；4、洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。二、方法1、本发明采用手动提取的方法提取组织dna，包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.050g的新鲜组织于2ml的ep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液，加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；3)从2mlep管中取500ul的工作液加入到1.5mlep管中，加入10ul的磁珠，充分混匀10分钟；将离心管放到磁力架上1分钟，直到管内的磁珠完全被吸附；用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部液体；4)将离心管从磁力架中取出，加入500ul洗涤液i，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；5)加入500ul洗涤液ii，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；6)加入500ul洗涤液iii，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀；然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；室温晾干5-10min；加入100ul洗脱液，在60℃温度下震荡5分钟；然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；7)回收得到的dna；dna应保存于-20℃。2、本发明采用机器自动化的方法提取组织dna，包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.050g的新鲜组织于2mlep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液；3)加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；4)从2mlep管中取500ul的工作液加入到96深孔板第1列或者第七列；参照下表向96孔板中加入相应试剂：5)将96深孔板按要求放入ajpure48型核酸提取纯化仪中；6)将对应的磁针套插入针套卡槽；7)关闭ajpure48型核酸提取纯化仪舱门，按要求选择合适的模板程序或根据提取要求自行编辑程序，运行实验；8)实验完成后，可进行紫外灯消毒，防止污染。实施例2一、配方：1、工作液包括以下的组分：0.1mtris，25mmedta，4mguscn，1.2mnacl，1％sds，1.0％十二烷基-n-甜菜碱，2％pvp，ph9.0；上述的百分比为质量百分比；2、蛋白酶k溶液包括蛋白酶k20mg/ml；3、所述的洗涤液含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，碳酸氢钠35mm，ph9.0；4、洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。二、方法包括以下的步骤：1)分别取0.010g-0.040g的新鲜组织于2ml的ep离心管中，分别加入20ul的蛋白酶k溶液，用1ml的枪头适当研磨；2)加入600ul的工作液，加入钢珠，将ep管置于涡旋震荡仪上高速旋转5min，观察组织是否被打散，若无明显组织块，置于65℃下震荡30min；3)从2mlep管中取500ul的工作液加入到1.5mlep管中，加入10ul的磁珠，充分混匀10分钟；将离心管放到磁力架上1分钟，直到管内的磁珠完全被吸附；用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部液体；4)将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；5)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；6)回收得到的dna，保存于-20℃。试验例1、dna溶液浓度及纯度测定取待测dna2ul加入比色皿，再加入双蒸水至100ul后充分混匀，经uv-7504紫外可见光光度计，检测dna的od260、od280及od260与od280的比值。dna浓度计算公式：dna浓度＝od260×稀释倍数×50/1000(ug/u1)；dna纯度：od260/od280比值为1.8-2.0，认为dna纯度比较好；od260/od280比值明显大于2.0，认为dna中可能有rna污染或dna片段断裂；od260/od280比值明显低于1.8，认为dna中可能有蛋白质或残余抽提时的酚。2、2％琼脂糖凝胶电泳判断所提取的dna的浓度及完整性取5ul提取的dna+lul的loadingbuffer(总体积6u1)，加入2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min，在kh-uvi型紫外透射分析仪中观察条带的纯度并估计浓度，并拍摄照片，作记录。3、结果1)组织dna的提取结果分别取0.01g的猪肝和猪肾、0.02g的猪肠、猪心、猪胃按实施例1手动提取的方法提取组织dna，对提取所得dna采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图1(依次为猪肝、猪肾、猪肠、猪心、猪胃)。从图中可以看出，即使不同组织提取得到的dna量有所差异，但是各组织提取效果很好。2)保存效果：分别取0.4g的新鲜猪肉组织和0.2g的新鲜猪肾组织于两个10ml的ep离心管中，分别加入200ul的蛋白酶k，每管加入6ml的工作液，研磨机研磨打散组织。分别在第一天、第七天、第十四天从10ml管中取出，采用实施例1手动提取的方法提取组织dna，对提取所得dna采用2％琼脂糖凝胶电泳，1、7、14天的电泳图片见图2、图3、图4，从条带图和浓度纯度测定图可以看出保存效果很好，且一个试剂能很好的做到保存、裂解和结合。(左一、左二为猪肉组织，为重复实验)(左三、左四为猪肾组织，为重复实验)。第一天：条带位置(从左至右)浓度(ng/ul)od260/od280od260/od230左一42.151.9451.932左二49.771.9291.903左三142.381.9141.646左四196.381.9501.582第七天：条带位置(从左至右)浓度(ng/ul)od260/od280od260/od230左一33.151.9621.864左二39.621.9921.872左三130.062.0071.447左四176.292.0321.492第十四天：条带位置(从左至右)浓度(ng/ul)od260/od280od260/od230左一32.151.9001.758左二59.892.0121.748左三128.921.9751.432左四158.621.9851.410以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。当前第1页12