一种高效提取结核杆菌DNA的方法与流程

本发明属于医药制备技术领域，具体涉及一种高效提取结核杆菌dna的方法。

背景技术：

结核杆菌属于分枝杆菌属，其细胞壁中含有大量类脂，占细菌干重的23.77％，其中40％为蜡质。近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，故结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，提取基因组dna变得更加困难。随着二代测序技术的开展，结核杆菌全基因组测序工作也开展的越来越多。这对获得完整干净的结核杆菌dna提出来更高的要求。

现有技术中，一般采用罗氏固体培养基采用结核分枝杆菌的培养，然而，结核分枝杆菌在罗氏固体培养基上长出菌落后需在bsl3级实验室(生物安全三级实验室)中开盖刮菌后进行菌株灭活和dna提取的操作，因为开盖刮菌的过程有可能造成菌株气溶胶进而污染操作环境，容易造成操作人员菌株感染。并且，我国现在的结核病防治机构中bsl3级实验室数量非常有限，使得操作人员的感染风险大大增加。因此急需一种更加安全的菌株处理方式来进行后续dna提取操作。

目前市面上有一些细菌基因组dna提取试剂盒，可以快速获得dna，但是应用于结核杆菌时，效果往往不理想。

例如，cn201410093113.0公开了一种提取结核杆菌dna的方法以及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性(mμltipledrugresistence，mdr)的试剂盒。该方法包括从由临床样本提取待检dna，应用荧光实时定量pcr确定结核分枝杆菌感染、鉴别是否为耐药性及何种耐药性菌株感染，最终确定病原体感染数量。

cn201510749457.7提供了一种结核杆菌dna的提取纯化方法，包括以下步骤：细菌悬液经ph为8.0的edta洗涤离心弃上清后，加入ph为8.0的tes缓冲液和5％(w/v)的sds溶液，加入ph为8.0的tes缓冲液和5％(w/v)的sds溶液后，置于温水浴30～50min,再置于沸水浴30～50min，最后在冰上放置3～7min，得到混悬液。

前述方案虽对各别样本效果优异，但对于多种实际细菌的提取时，规模化应用受限，效果均不及国内外大型实验室多采用ctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取结核杆菌dna。该方法的原理是在高离子强度的溶液中，ctab与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。ctab法可以得到纯净的dna，但是耗时长，操作误差大。

技术实现要素：

针对以上技术的不足，提供了一种高效、安全、简便的结核杆菌dna提取方法，包括使用液体培养物，报阳之后灭活，然后再开盖，之后采用改良的ctab方法和硅胶膜离心柱法进行细菌dna提取。

dna提取的原理是经溶菌酶、sds破坏细胞壁后，ctab处理，氯仿抽提后离心去除多糖、多酚和蛋白质。上清中还加入异丙醇离心沉淀基因组dna，然后基因组dna在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组dna从硅基质膜上洗脱。

具体地，本发明通过以下技术手段来实现：

一种高效提取结核杆菌dna的方法，包括，使用液体培养物进行结核杆菌培养，报阳之后灭活，然后再开盖，之后采用改良的ctab方法提取，和硅胶膜离心柱法进行细菌dna分离。

具体的，作为本发明的一种优选技术方案，使用液体培养物进行结核杆菌培养步骤包括：

作为本发明的一种优选技术方案，使用美国bd公司bactecmgit960分枝杆菌培养监测仪，待系统报阳后取出mgit管，直接在水浴90-100℃下灭活30分钟以上，优选95度30分钟灭活后将该培养物作为后续提取dna的样品。通过大量的实验研究发现，由于细菌在灭活后才进行的开盖操作，从而避免了生物安全危害。

作为本发明的一种优选技术方案，采用ctab法和硅胶膜离心柱相结合的方法进行细菌dna分离包括以下步骤：

收集灭活后的菌体，离心，弃上清，菌体沉淀用te重悬，加入溶菌酶，混匀，37℃孵育16-20小时；

加入sds和5μl蛋白酶k溶液，混匀，孵育；

加入nacl和预热的ctab/nacl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，孵育；

加入氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；离心；转移上层水相；

加入异丙醇和醋酸钠，混匀；

吸取混匀的液体转入吸附柱中，离心，弃掉废液；

向吸附柱中加入缓冲液gd，离心，弃掉废液；

向吸附柱中加入漂洗液pw，离心，弃掉废液；

将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱滴加洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，离心，收集溶液。

作为前述提取和分离的一种优选技术方案，优选吸附柱cb3、缓冲液gd及漂洗液pw均为天根生物科技有限公司产品，货号分别为rk127，rk118和rk113。

作为前述提取和分离的一种优选技术方案，是通过大量实验研究发现的最佳提取和分离方案，具体地，

(1).13000rcf离心3min，弃上清，菌体沉淀用400μlte重悬，加入50μl溶菌酶(10mg/ml)，混匀，37℃孵育16-20小时；

(2).65℃预热ctab/nacl(室温放置会呈凝胶状，用前先在65℃预热，反复加热会影响其效果)；

(3).加入70μl10％sds和5μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，混匀，65℃孵育10min；(轻轻混匀)；

(4).加入100μl5mnacl和100μl预热的ctab/nacl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，65℃孵育10min；

(5).加入750μl氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；12000rpm离心5min；转移上层水相至另一新的离心管；

(6).加入0.6倍体积(约450μl)的异丙醇和0.1体积(约75μl)3mol/l的醋酸钠，轻轻颠倒混匀；

(7).600-700μl混匀的液体转入吸附柱cb3中，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，弃掉废液；

(8).重复步骤5；

(9).向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

(10).向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

(11).重复操作步骤7；

(12).将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(13).将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:

1.采用临床上检验中所用的mgit液体培养物，灭活后再开盖进行dna提取的方式，由于灭活后菌株已经没有生物活性，从而避免了生物安全危害。

2.液体培养物与固体培养基相比，培养时间更短，且因为细菌分散在培养基中，更加容易裂解，可提供dna的得率。

3.与商用试剂盒相比，本发明提供的提取方法提取率高，经济实惠。

4.与传统ctab法相比，本方法操作简单，大大节约了实验时间，尤其在处理较大样本量时该优点更加明显。

附图说明

图1，本发明实施例和对比实施例的电泳图，其中，1是传统ctab方法，2是新方法，3是天根试剂盒。

图2，前述实验方法dna拷贝数，纯度及耗时、成本对比表1。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1

使用本发明方法与现有商用试剂盒、传统ctab方法提取结核杆菌dna

使用美国bd公司bactecmgit960分枝杆菌培养监测仪，待系统报阳后取出mgit管。将管子放于水浴锅内，95℃灭活30分钟。取菌株a/b/c/d，样本充分吹打混匀，平均分为三份，分别标记a-1、a-2、a-3，b-1、b-2、b-3，c-1、c-2、c-3，d-1、d-2、d-3。a-1、b-1、c-1、d-1采用传统ctab法提取，a-2、b-2、c-2、d-2采用本发明中的方法提取提取，a-3、b-3、c-3、d-3采用天根细菌基因组提取试剂盒提取。

(1)传统ctab法提取结核杆菌dna

1.13000rcf离心3min，弃上清，菌体沉淀用400μlte重悬，加入50μl溶菌酶(10mg/ml)，混匀，37℃孵育16-20小时。

2.65℃预热ctab/nacl(室温放置会呈凝胶状，用前先在65℃预热，反复加热会影响其效果).

3.加入70μl10％sds和5μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，混匀，65℃孵育10min；(轻轻混匀)

4.加入100μl5mnacl和100μl预热的ctab/nacl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，65℃孵育10min；

5.加入750μl氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；13000rcf离心5min；转移上层水相至另一新的离心管.

6.加入0.6倍体积(大约450μl)的异丙醇以沉淀dna；-20℃放置30min，3000rcf离心15min；

7.弃上清，留20μl；13000rcf离心5min，移液器吸出剩余液体；

8.60℃干燥20min。

9.用50μlte溶解dna沉淀，60℃孵育20min后4℃备用。

(2)采用天根细菌基因组提取试剂盒(货号dp302)提取

1.13000rcf离心3min，弃上清。

2.加入180μl缓冲液(20mmtris，ph8.0；2mmna2-edta；1.2％triton；终浓度为20mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃过夜处理。

3.向管中加入20μlproteinasek溶液，混匀。

4.加入220μl缓冲液gb，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

7.向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8.向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。

9.重复操作步骤8。

10.将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱

cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。

11.将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

(3)本发明中的方法提取结核杆菌dna

1.13000rcf离心3min，弃上清，菌体沉淀用400μlte重悬，加入50μl溶菌酶(10mg/ml)，混匀，37℃孵育16-20小时。

2.65℃预热ctab/nacl(室温放置会呈凝胶状，用前先在65℃预热，反复加热会影响其效果).

3.加入70μl10％sds和5μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，混匀，65℃孵育10min；(轻轻混匀)

4.加入100μl5mnacl和100μl预热的ctab/nacl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，65℃孵育10min；

5.加入750μl氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；12000rpm离心5min；转移上层水相至另一新的离心管.

6.加入0.6倍体积(约450μl)的异丙醇和0.1体积(约75μl)3mol/l的醋酸钠，轻轻颠倒混匀。

7.600-700μl混匀的液体转入吸附柱cb3中，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，弃掉废液。

8.重复步骤5。

9.向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

10.向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

11.重复操作步骤7.

12.将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

13.将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm(～13，400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

注：为增加基因组dna的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm(～13，400×g)离心2min。

实验结果参照图2的表1所示，从结果可以得知：

1.采用临床上检验中所用的mgit液体培养物，灭活后再开盖进行dna提取的方式，由于灭活后菌株已经没有生物活性，从而避免了生物安全危害。

2.液体培养物与固体培养基相比，培养时间更短，且因为细菌分散在培养基中，更加容易裂解，可提高dna的得率。

3.与商用试剂盒相比，本发明提供的提取方法提取率高，纯度高，经济实惠。

4.与传统ctab法相比，本方法操作简单，大大节约了实验时间，尤其在处理较大样本量时该优点更加明显。

其中，od260/280比值指260nm和280nm下吸光光度比值。od是opticaldensity(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，od＝lg(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。一般来说od260代表核酸的吸光度，od280代表蛋白质的吸光度。当比值为1.7-2.0之间表示没有被蛋白污染，，而污染值越小，蛋白污染越多，纯度越差。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。