羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途的制作方法

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其用途。

背景技术：

光学活性(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇是阿斯利康公司研发的药物替格瑞洛(ticagrelor，商品名“brilinta”)的关键手性中间体。替格瑞洛是首个在2011年通过fda认证的可逆的p2y12受体抗结剂，用于阻止动脉硬化，治疗急性冠状动脉综合征。

酮还原酶(ec1.1.1.x，x＝1，2)也被称为羰基还原酶(carbonylreductase，cr)或醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，adh)，它们可逆地催化酮或者醛还原为醇，并需要辅因子的参与。微生物细胞或者微生物来源的羰基还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。天然酶在工业应用中普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造是提高酶学性能的有效手段。羰基还原酶chkred20可以不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮得到替格瑞洛中间体(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(e.e.值>99％)，利用分子进化技术，进一步提高该酶的催化活力，从而推动其在该中间体生产中的工业化应用。

技术实现要素：

本发明利用易错pcr技术和单点饱和突变技术对来源于金黄杆菌ca49(chryseobacteriumsp.ca49)的羰基还原酶chkred20进行分子改造，从而获得活性提高的羰基还原酶chkred20突变体。

为了达到以上目的，首先以易错pcr技术对母本基因进行随机突变，建立突变文库，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，通过高通量筛选体系筛选出2个酶活提高的突变位点(h145l和l205m)，并对这两个位点分别建立饱和突变文库，筛选出活性提高的突变体。其中，突变子l205a的酶活比母本提高10倍。

本发明通过如下方式来实现：

(1)随机突变文库的构建和筛选

羰基还原酶chkred20来源于金黄杆菌ca49(吴中柳，刘艳等，一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产，中国专利，cn103497911b)，该酶基因大小为750bp，编码249个氨基酸，在ncbi的登录号：kc342020。

首先，利用易错pcr技术构建了随机突变文库，得到超过2×10⁴个克隆的突变体文库，将突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。而后离心收集菌体，加入溶菌酶破碎细胞，并离心，取部分上清液(粗酶液)以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，反应适当时间测定酶活。将羰基还原酶chkred20母本作为对照组，筛选得到的活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体dna序列信息。详细方案见实例1。

经上述随机突变库构建和筛选，获得了2个活性提高的突变体，分别为h145l、l205m，其特征如下：

h145l:该酶的第145位的组氨酸突变为亮氨酸(dna序列由cat变为ctt)。

l205m:该酶的第205位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由ctg变为atg)。

(2)对这两个位点进行饱和突变

通过设计兼并引物，利用定点突变试剂盒(stratagene，lajolla，ca，usa)对羰基还原酶chkred20第145，205位点分别进行饱和突变，得到～1000个克隆的突变体文库，将突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3，各挑选100个单克隆于96孔板中表达蛋白进行高通量筛选。进一步筛选到比母本羰基还原酶chkred20酶活提高的突变体h145a、l205t、l205q、l205s和l205a。

由于在第145位饱和突变文库中，突变子h145a的活力较高，因此以突变子h145a为母本，在第205位点进行饱和突变，同上述步骤，筛选到组合突变子h145a/l205a、h145a/l205t、h145a/l205q和h145a/l205v。

上述活力提高的突变体其特征如下：

h145a：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(dna序列由cat变为gct)。

l205t：该酶的第205位的亮氨酸突变为苏氨酸(dna序列由ctg变为acg)。

l205q：该酶的第205位的亮氨酸突变为谷氨酰胺(dna序列由ctg变为cag)。

l205s：该酶的第205位的亮氨酸突变为丝氨酸(dna序列由ctg变为agc)。

l205a：该酶的第205位的亮氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ctg变为gcc)。

h145a/l205a：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(dna序列由cat变为gct)、第205位的亮氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ctg变为gcg)。

h145a/l205t：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(dna序列由cat变为gct)、第205位的亮氨酸突变苏氨酸(dna序列由ctg变为acg)。

h145a/l205q：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(dna序列由cat变为gct)、第205位的亮氨酸突变为谷氨酰胺(dna序列由ctg变为cag)。

h145a/l205v：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(dna序列由cat变为gct)、第205位的亮氨酸突变为缬氨酸(dna序列由ctg变为gtg)。

这些突变体h145l、l205m、h145a、l205t、l205q、l205s、l205a、h145a/l205a、h145a/l205t、h145a/l205qh和h145a/l205v的活性与母本羰基还原酶chkred20相比均有不同程度提高。突变子l205a活性提升幅度最大，稳定性和产物e.e值却未受影响，酶活为178.3μmol/mg/min，是野生型的10倍。

本发明有益效果：上述所有酶活提高的突变子与母本相比，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，催化底物的时空效率均有提高，其中突变子l205a转化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的时空效率高达33.3g/(l.h)，具有良好的工业应用前景。

除此之外，母本羰基还原酶chkred20最多可转化浓度为150g/l的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，而突变子l205a可以在20h内完全转化200g/l的该底物，e.e值不变(>99％)，突变子生物催化大幅度提高了转化能力，可进一步降低生产成本。

附图说明

图1为母本羰基还原酶chkred20与所筛选出的突变体的比活力比较

图2为母本羰基还原酶chkred20与突变体l205a的最适反应温度测定图，母本羰基还原酶chkred20的最适反应温度测定曲线用□表示；突变体l205a的最适反应温度测定曲线用■表示。

图3为母本羰基还原酶chkred20与突变体l205a在40℃条件下转化底物的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮时间曲线，母本羰基还原酶chkred20转化底物的浓度分别为100g/l(○)，150g/l(□)和200g/l(◇)；以及突变体l205a的转化浓度为100g/l(●)，150g/l(■)和200g/l(◆)。

具体实施方法

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

实施例1易错pcr(error–pronepcr)方法构建羰基还原酶随机突变文库

利用iirandommutagenesiskit对羰基还原酶chkred20基因进行随机突变。

所用引物为：t7：5′–taatacgactcactataggg–3′

t7ter：5′–tgctagttattgctcagcgg–3′

反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸90s，共25个循环，电泳后以胶回收试剂盒回收基因片段。

将回收片段用ecori和sali双酶切消化后，与经过相同酶切的pet28a(+)载体(卡那霉素抗性基因)进行连接反应，反应条件为：载体和片段按摩尔比1：3的比例混合，加入400个单位的t4dna连接酶，16℃过夜连接。电击法转入大肠杆菌dh10b，得到超过2×10⁴个克隆的突变体库。

实施例2羰基还原酶chkred20突变体库的筛选

将实施例1中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3，涂布含有卡那霉素的lb平板，培养12h。挑取单克隆于96孔板，每孔含有200μltb培养基(含有50μg/ml卡那霉素，0.5mmiptg)，30℃，180rpm，震荡培养18h。用96孔板复制器复制各单克隆于lb固体培养基平板，37℃培养12h后，4℃冰箱保存。将菌体诱导表达后的96孔板在4000rpm下离心10min，弃去上清，各孔加入200μl的溶菌缓冲液重悬细胞(溶菌缓冲液的配制：0.1m、ph8.0的磷酸钾缓冲液，10mg/ml溶菌酶，1μg/mldnasei，10mmmgcl2)。将加有溶菌液的96孔板在37℃放置60min后，在4000rpm下离心10min，取上清用于生物催化反应。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的上清液(各50μl)，再在96孔板各孔中加入150μl反应液(1mm的nadh，0.1m、ph8.0的磷酸钾缓冲液和0.02倍体积的含有1mm2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的二甲基亚砜溶液)，30℃反应1h后，在340nm下测定nadh的吸光度。在96孔板高通量筛选中，获得活力比野生型chkred20高出50％的菌株h145l、l205m，通过进一步纯酶复筛(实施例3)，测得其活力分别是野生型对照的3.1倍和1.65倍。分别挑取单克隆送上海英骏生物技术公司测序。

实施例3母本及突变体比活力的测定

3.1纯酶液的制备

母本羰基还原酶chkred20和突变体h145l、l205m的纯化采用镍柱亲和层析(bio-rad)。

挑取单克隆至lb(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至tb(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mmiptg诱导后，30℃继续培养至18h。4℃、6000rpm离心收集菌体。重悬于buffera(50mm磷酸钠缓冲液，ph8.0，300mmnacl，10mm咪唑)，细胞均质机破碎，之后以13000rpm，4℃离心20min，将上清液加入已用buffera平衡的柱料中，轻微混匀30min，用含有20mm咪唑的buffera漂洗杂蛋白，再用含250mm咪唑的buffera的缓冲液洗脱目的蛋白，并以磷酸钠缓冲液透析除去咪唑(0.1m，ph8.0)，最后电泳鉴定纯度。蛋白质浓度的测定采用核酸蛋白微量定量仪测定。

3.2蛋白比活力的测定

反应体系：体积占反应体系70％的水相和体积占反应体系30％的有机相组成。水相包含有0.02mg/ml的纯酶液，0.2g/l的nad⁺，0.1m、ph8.0的磷酸钾缓冲液。有机相包含有20mm底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮和异丙醇。40℃、150rpm反应5min。反应结束后，等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的生成量。

经测定，突变体h145l、l205m的活力分别是野生型对照的3.1倍和1.65倍。

实施例4构建羰基还原酶chkred20饱和突变文库

分别对羰基还原酶chkred20第145，205位点进行饱和突变。利用nns兼并性引物(n代表a，t，c，g；s代表g，c。)，饱和文库分别命名为sm145，sm205。

同时，以突变子h145a为母本，对该基因的205位氨基酸残基进行饱和突变，建立sm205/h145a文库。所用的145位和205位兼并引物如下所示：

145s-f:5′-gaatatggcctctattnnsggtattgttgctgcaccgc-3′

145s-r:5′-gcggtgcagcaacaataccsnnaatagaggccatattc-3′

205s-f:5′-ggaaatgaaggaagcannsatttcaaaacatccgatgggaag-3′

205s-r:5′-cttcccatcggatgttttgaaatsnntgcttccttcatttcc-3′

pcr条件为：10×buffer5μl，引物(10mm)各6μl，dntp(2.5mm)4μl，pfu酶(2.5u/ml)1μl，质粒10ng，超纯水补足50μl，条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16个循环。pcr产物用1μldpni在37℃处理1h。然后将pcr产物10μl化学法转入e.colidh5a。送于上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确后，提取质粒转入表达菌株e.colibl21-de3。

突变子的蛋白表达纯化方法和比活力测定方法见实施例3.1。

本轮突变获得的9个突变子h145a、l205t、l205q、l205s、l205a、h145a/l205a、h145a/l205t、h145a/l205q、h145a/l205v和实施例2获得的2个突变子h145l、l205m与母本相比的比活力见说明书附图1。

野生型羰基还原酶chkred20的比活力为17.8μmol/mg/min，突变子h145a、l205t、l205q、l205s、l205a、h145a/l205a、h145a/l205t、h145a/l205q、h145a/l205v比活力分别为118.9、103.7、125.4、96.5、178.3、97.3、123.8、73.2、104.8μmol/mg/min。其中，突变体l205a活力最高，是母本羰基还原酶chkred20的10倍。

实施例5母本和突变体l205a的最适反应温度和热稳定性

5.1母本和组合突变体的最适反应温度的测定

在ph8.0条件下，测定羰基还原酶野生型和突变体在不同温度下的最大反应速率，反应温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃。反应体系为(1ml的反应液)：30％体积的有机相，包含有20mm底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮和异丙醇，以及70％体积的水相包含有0.2g/l的nad⁺，0.1m、ph8.0的磷酸钾缓冲液，0.075mg/ml的母本chkred20纯酶液或0.015mg/ml的l205a纯酶液，在不同温度下反应5min。等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的生成量。以比活力为纵坐标，反应温度为横坐标，绘制酶活随反应温度变化的曲线。结果见说明书附图2。突变体l205a和母本都在50℃具有最大反应速率，而且突变体l205a在不同温度下的比活力都远高于母本。

5.2母本和突变体l205a的热稳定性测定

将蛋白浓度1mg/ml的纯酶液100μl置于容量250μl的pcr管，每个样品3个重复，用pcr仪在50℃处理不同的时间，然后将样品管放置于冰上冷却，4℃，12000rpm，离心10min，取适量处理后的酶液测定酶活力，测定方法同3.2。以未经过高温处理的酶液为参比，得到相对活力。以处理时间为x轴，残余酶活百分比的自然对数为y轴，用origin75软件做散点图，添加趋势线，得到酶热处理时间与相对活力的线性方程，以相对活力50％的自然对数为3.912023来计算得到相应的时间，此时间即为酶的热失活半衰期t1/2。在50℃条件下，母本羰基还原酶chkred20的t1/2为9.3h，突变体l205a的t1/2为15.8h，从而说明与母本相比，突变体l205a的热稳定性有所提高。

实施例6突变体在生物催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮中的应用

突变体l205a是在母本羰基还原酶chkred20的基础上将第205位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基产生的。野生型chkred20的最适反应温度是50℃，但在此温度下稳定性不理想，因此实际反应温度一般采用40℃。

该反应体系的底物浓度是基于反应的总体积计算所得。在40℃、180rpm条件下进行反应。反应为10ml两相体系：25％的水相包含有0.1m，ph8.0的磷酸钾缓冲液，0.2g/lnad⁺，3g/l粗酶液；75％的有机相包含有2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮100-200g/l和异丙醇。

突变体l205a转化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的时空产率比母本有很大程度的提高，3g/l的粗酶液可在3h内完全转化100g/l2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成(s)-型醇，e.e值>99％，时空产率33.3g/(l.h)，相比之下，母本则需要16h。结果见说明书附图3。母本羰基还原酶chkred20最多可转化浓度为150g/l的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，而突变子l205a可以在20h内完全转化200g/l的该底物，从而说明突变子l205a增强了底物耐受度。

实施例7突变子在生物催化2’-氟苯乙酮中的应用

该反应在40℃、180rpm条件进行，10ml反应体系为：25％的水相包含有0.1m，ph8.0的磷酸钾缓冲液，0.2g/lnad⁺，3g/l粗酶液；75％的有机相包含有20g/l的2’-氟苯乙酮和异丙醇。在40℃条件下，3g/l的母本羰基还原酶chkred20粗酶液可在12h内转化20g/l的2’-氟苯乙酮生成r型醇，转化率>99％，e.e值>99％。突变体l205a在该条件下转化底物的时空产率比母本大大提高。突变子l205a完全还原浓度为20g/l的2’-氟苯乙酮生成r型醇仅需4h，时空产率是野生型的3倍。