一种pX335-xCas9n载体及其构建方法和应用与流程

文档序号：18198915发布日期：2019-07-17 06:02阅读：437来源：国知局

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种px335-xcas9n载体及其构建方法和应用。

背景技术：

文献hu,j.h.etal.evolvedcas9variantswithbroadpamcompatibilityandhighdnaspecificity.nature.556(7699),57-63,doi:10.1038/nature26155,(2018)中，公开了crispr/xcas9双链断裂基因敲除技术。传统的crispr/cas9系统识别的pam序列是3’-ngg，这限制了它的应用范围。而crispr/xcas9技术将识别范围扩展到了3’-ng(也就是说dna序列当中只要有一个g就可以被识别)，显著扩展了基因敲除的靶标范围。

虽然crispr/xcas9技术相对于传统的crispr/cas9系统特异性有所提高，但是由于它仅仅识别20nt左右的碱基，这就决定了它仍然会存在一定的潜在脱靶效应。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种px335-xcas9n载体及其构建方法和应用，采用本发明提供的px335-xcas9n载体在基因修饰时，可识别40nt的靶标dna序列。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种px335-xcas9n载体，所述px335-xcas9n载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的px335-xcas9n载体的构建方法，包括：将px335载体和px330-xcas9载体分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，将分别得到的酶切产物进行连接，得到px335-xcas9n载体；

所述px330-xcas9质粒的核苷酸序列如seqidno.2所示。

优选的，所述px330-xcas9载体的构建方法包括：将px330质粒和xcas9-39k片段分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，将分别得到的酶切产物进行连接，得到px330-xcas9载体；

所述xcas9-39k片段的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的px335-xcas9n载体在哺乳动物的基因修饰中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链dna寡核苷酸，将所述两对单链dna寡核苷酸分别退火，得到两个双链dna片段；

2)将所述步骤1)得到的两个双链dna片段分别插入到权利要求1所述的px335-xcas9n载体的sgrna表达框中，得到两个载体；

3)将所述步骤2)得到的两个载体共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因修饰。

优选的，所述两个载体的质量比为(1～5):(1～5)。

优选的，所述单链dna寡核苷酸的长度为20～30nt。

优选的，所述基因包括人msh2基因、小鼠tada1基因和猪rela基因。

本发明一种px335-xcas9n载体及其构建方法和应用，所述px335-xcas9n载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。采用本发明提供的px335-xcas9n载体在基因修饰时，可识别40nt的靶标dna序列。在本发明中，需要一对(2个)px335-xcas9n靶标载体互相配合才能够发挥dna双链断裂的功能，一个靶标载体识别20个碱基，一对靶标载体就识别40个的碱基序列。

本发明的有益效果：采用本发明提供的px335-xcas9n基因修饰效率较高，可以识别40bp左右的靶标dna序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。普通的crispr/xcas9系统仅可识别20bp的靶标系列，本发明将识别序列长度提高了一倍，其特异性大大提高。

附图说明

图1为双荧光素酶报告基因活性检测结果；

图2为菌落pcr检测结果；

图3为实施例3的6个单克隆的序列发生改变结果；

图4为实施例4的5个单克隆的序列发生改变结果；

图5为实施例5的6个单克隆的序列发生改变结果。

具体实施方式

本发明提供了一种px335-xcas9n载体，所述px335-xcas9n载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的px335-xcas9n载体的构建方法，包括：将px335载体和px330-xcas9载体分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，将分别得到的酶切产物进行连接，得到px335-xcas9n载体；所述px330-xcas9质粒的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明对所述px335载体和px330-xcas9载体分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切的条件没有特殊限定，采用常规双酶切的条件即可。

本发明对所述酶切产物进行连接的条件没有特殊限定，采用常规酶切产物连接的条件即可。

在本发明中，所述px335载体经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，酶切得到的片段大小为4538bp，序列如seqidno.4所示。

在本发明中，所述px330-xcas9载体经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，酶切得到的片段大小为3911bp，序列如seqidno.3所示。

在本发明中，所述px330-xcas9质粒的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明中，所述px330-xcas9载体的构建方法优选包括：将px330质粒和xcas9-39k片段分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切，将分别得到的酶切产物进行连接，得到px330-xcas9载体；所述xcas9-39k片段的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明对所述px330质粒和xcas9-39k片段分别经bglⅱ与ecorⅰ进行双酶切的条件没有特殊限定，采用常规双酶切的条件即可。本发明对所述酶切产物进行连接的条件没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述xcas9-39k片段的核苷酸序列优选如seqidno.3所示。

在本发明中，所述px330-xcas9载体表达的xcas9蛋白具有dna靶标切割活性。在本发明中，所述xcas9蛋白的表达框部分来自px330载体(其中cmv启动子位于px330-xcas9载体全序列seqidno.2的440-725区段，xcas9基因的5’端编码区位于px330-xcas9载体全序列seqidno.2的1251-1619区段，转录终止信号bghpa位于px330-xcas9载体全序列seqidno.2的5553-5760区段，这些元件均来自px330，其在序列seqidno.3的相应位置的数字均依次减去439，详述如下：cmv启动子位于seqidno.3的1-286区段，xcas9基因的5’端编码区位于seqidno.3的812-1180区段，转录终止信号bghpa位于px330-xcas9载体全序列seqidno.3的5114-5321区段)，部分来自生物公司合成(即xcas939k片段，seqidno.3)，所述xcas9蛋白的表达框为px330-xcas9载体全序列seqidno.2的440-5760片段。

本发明还提供了上述技术方案所述的px335-xcas9n载体在哺乳动物的基因修饰中的应用。

在本发明中，所述基因优选包括人msh2基因、小鼠tada1基因和猪rela基因。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：

1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链dna寡核苷酸，将所述两对单链dna寡核苷酸分别退火，得到两个双链dna片段；

2)将所述步骤1)得到的两个双链dna片段分别插入到上述技术方案所述的px335-xcas9n载体的sgrna表达框中，得到两个载体；

3)将所述步骤2)得到的两个载体共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因修饰。

本发明优选根据哺乳动物的基因组上的靶基因设计两对单链dna寡核苷酸，将所述两对单链dna寡核苷酸分别退火，得到两个双链dna片段。本发明对所述设计单链dna寡核苷酸的原则没有特殊限定，采用常规设计寡核苷酸的原则即可。

本发明优选将得到的两个双链dna片段分别插入到上述技术方案所述的px335-xcas9n载体的sgrna表达框中，得到两个载体。

本发明对所述将双链dna片段插入到px335-xcas9n载体的sgrna表达框中的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

在本发明中，所述两个载体的质量比优选为(1～5):(1～5)。在本发明中，所述单链dna寡核苷酸的长度优选为20～30nt。

在本发明中，所述px335-xcas9n载体中的xcas9n具有seqidno.5所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述xcas9n表达的蛋白具有造成靶序列区域单链dna切口的作用。在本发明中，所述xcas9n表达的蛋白的表达框部分来自px335载体(其中cmv启动子位于px335-xcas9n全序列的区段440-725，xcas9n基因5’端编码区位于px335-xcas9n全序列的1251-1566区段，bghpa转录终止信号位于px335-xcas9n全序列的5495-5702区段，这些元件均来自px335,其在序列seqidno.5的相应位置的数字均依次减去439，详述如下：cmv启动子位于seqidno.5的区段1-286，xcas9n基因5’端编码区位于seqidno.5的812-1127区段，bghpa转录终止信号位于seqidno.5的5056-5263区段)，部分来自px330-xcas9载体(即bglⅱ、ecorⅰ双酶切所得3.9kb片段)。在本发明中，xcas9n表达的蛋白的表达框来自两个载体，px330-xcas9提供识别ngnpam靶标的7个氨基酸突变，px335载体提供d10a突变(此突变使得xcas9蛋白失去dna双链切割的功能，但保留制造dna单链切口的功能)，两个载体优势互补，共同提供在ngnpam靶标处制造dna单链切口的功能。在本发明中，所述xcas9n表达的蛋白的表达框的序列如seqidno.6所示。

在本发明中，所述基因优选包括人msh2基因、小鼠tada1基因和猪rela基因。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质粒载体px330-xcas9的构建及效率

1、质粒载体px330-xcas9的构建

合成3911bp的dna片段xcas9-39k(seqidno.3)，通过bglⅱ与ecorⅰ双酶切克隆到px330载体(购自addgene,货号42230)的多克隆位点，通过测序验证，获得质粒载体px330-xcas9(seqidno.2)。测序验证采用常规方法即可，测序验证使用的正向测序引物px330-f(seqidno.7)和反向测序引物px330-r(seqidno8)。

2、sgrna靶标载体的构建

针对绵羊dkk2第一外显子序列(seqidno.9)设计xcas9的sgrna寡核苷酸。

合成6段dna寡核苷酸，如下：

tx1-f(seqidno.10)：

caccgtgcctgctcctactggccgc(205-224)，205-224表示该靶标在绵羊dkk2第一外显子序列中的相应位置，以下也表明相应位置，不再解释；

tx1-r(seqidno.11)：

aaacgcggccagtaggagcaggcac

tx2-f(seqidno.12):

caccgatcaagtcctctctgggcgg(280-299)

tx2-r(seqidno.13):

aaacccgcccagagaggacttgatc

tx3-f(seqidno.14):

caccgcccgcgagctgccgaactg(266-247)

tx3-r(seqidno.15):

aaaccagttcggcagctcgcgggc

tx1-f与tx1-r、tx2-f与tx2-r、tx3-f与tx3-r两两退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)，获得三条双链dna寡核苷酸(tx1、tx2、tx3)，同时使用bbsⅰ内切酶切割px330-xcas9载体并纯化，将tx1、tx2、tx3分别与切割后的px330-xcas9载体连接并转化，经pcr检测(pcr检测采用常规方法即可)、测序获得xcas9-tx1、xcas9-tx2、xcas9-tx3载体。

pcr检测引物：tx1-f、tx2-f、tx3-f分别与测序引物bbsr配对，检测相应载体。

测序引物bbsr(seqidno.16)：aaagtccctattggcgttac。

空载体检测引物：

330f(seqidno.17):5'cgggtcttcgagaagacct3'

bbsr(seqidno.18)：5'aaagtccctattggcgttac3'

3、双荧光素酶报告基因活性检测

使用xcas9-tx1、xcas9-tx2和xcas9-tx3载体分别与双荧光素酶报告载体ssa-dkk2(seqidno.19)以1:1的比例共转染猪血管内皮细胞系piec(购自中国科学院上海细胞库，目录号：gno15)，48小时后使用试剂盒检测双荧光素酶报告基因活性(结果如图1，数值的高低反映的是海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性的比值，比值越高，说明基因编辑的效率越高)。结果说明，px330-xcas9载体表达的xcas9蛋白确实具有dna靶标切割活性。

实施例2

质粒载体px335-xcas9n的构建

通过bglⅱ与ecorⅰ对px335质粒和实施例1获得的px330-xcas9质粒实施双酶切，将前者的4.5kb片段(seqidno.4)与后者的3.9kb片段(seqidno.3)分别切胶回收并连接、转化、涂板、挑菌、摇菌，使用两对引物(f1和r1、f2和r2)进行pcr检测(pcr检测采用常规方法)，选取扩增片段分别为107bp、192bp的单菌落(如图2所示)送公司测序，获得px335-xcas9n载体。

f1(seqidno.20)、r1(seqidno.21)、f2(seqidno.22)和r2(seqidno.23)。

实施例3

质粒载体px335-xcas9n在人细胞系293t中的基因修饰效率

人细胞系293t，购自中国科学院上海细胞库，目录号：scsp-502。人msh2基因的第一外显子序列如seqidno.24所示。

选取人msh2基因的第一外显子序列的120-190bp区段作为靶标，针对这一靶标设计并合成2对dna寡核苷酸(如下所示)，

msh2t1-f(seqidno.25)、msh2t1-r(seqidno.26)、msh2t2-f(seqidno.27)和msh2t2-r(seqidno.28)。

其中msh2t1-f与msh2t1-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-f1载体；msh2t2-f与msh2t2-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-r1载体。两个质粒均送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物bbsr的序列为(seqidno.29)。

将px335-xcas9n-f1与px335-xcas9n-r1载体按照1:1的比例转染人细胞系293t，48小时后，提取细胞基因组dna，使用引物对msh2f、msh2r进行pcr扩增(扩增条件：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min)(msh2f序列seqidno.30；msh2r序列seqidno.31，对获得的258bp的pcr产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如图3所示)。该结果表明，px335-xcas9n-msh2tf、px335-xcas9n-msh2tr载体混合转染对人细胞系293t的敲除效率达到30％。这一结果说明，本发明构建的px335-xcas9n载体效率较高，可以识别40bp左右的靶标dna序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。而普通的crispr/xcas9系统仅可识别20bp的靶标系列，本发明将识别序列长度提高了一倍，其特异性大大提高。

实施例4

实施例2制备的质粒载体px335-xcas9n在小鼠细胞系nih/3t3中的基因修饰效率

小鼠细胞系nih/3t3,购自中国科学院上海细胞库，目录号：scsp-515。

小鼠tada1基因的第一外显子序列seqidno.32。

选取小鼠tada1基因的第一外显子序列的200-280bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计并合成2对dna寡核苷酸(如下)：

tada1t1-f(seqidno.33)、tada1t1-r(seqidno.34)、tada1t2-f(seqidno.35)和tada1t2-r(seqidno.36)。

其中tada1t1-f与tada1t1-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-f2载体；tada1t2-f与tada1t2-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-r2载体。两个质粒均送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物bbsr的序列为(seqidno.37)。

测序验证方法(常规方法)：使用测序引物bbsr进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸tada1t1-f、tada1t2-f进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将px335-xcas9n-f2与px335-xcas9n-r2载体按照1:1的比例转染小鼠细胞系nih/3t3，48小时后，提取细胞基因组dna，使用引物对tada1f、tada1r进行pcr扩增(tada1f序列见序列seqidno.38；tada1r序列seqidno.39，扩增条件同实施例2)，对获得的157bp的pcr产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如图4所示)。该结果表明，px335-xcas9n-f2与px335-xcas9n-r2载体混合转染对小鼠细胞系nih/3t3的敲除效率达到25％。这一结果说明，本实验构建的px335-xcas9n效率较高，可以识别40bp左右的靶标dna序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。而普通的crispr/xcas9系统仅可识别20bp的靶标系列，本发明将识别序列长度提高了一倍，其特异性大大提高。

实施例5

实施例2制备的质粒载体px335-xcas9n在猪细胞系piec中的基因修饰效率

猪血管内皮细胞系，购自中国科学院上海细胞库，目录号：gno15。

猪rela基因的第二外显子序列seqidno.40。

选取猪rela基因的第二外显子序列180-240bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成2对dna寡核苷酸，如下：

relat1-f(seqidno.41)、relat1-r(seqidno.42)、relat2-f(seqidno.43)和relat2-r(seqidno.44)。

其中relatf-f与relatf-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-f3载体；relatr-f与relatr-r退火获得带粘性末端的双链dna片段，经bbsⅰ酶切，连入px335-xcas9n载体中，获得px335-xcas9n-r3载体。两个质粒均送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物bbsr的序列为(seqidno.45)。测序验证方法：使用测序引物bbsr进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸relat1-f、relat2-f进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将px335-xcas9n-f3与px335-xcas9n-r3载体按照1:1的比例转染猪细胞系piec，48小时后，提取细胞基因组dna，使用引物对relaf、relar进行pcr扩增(relaf序列(seqidno.46)；relar序列(seqidno.47)，扩增条件同实施例2)，对获得的316bp的pcr产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如图5所示)。该结果表明，px335-xcas9n-f3与px335-xcas9n-r3载体混合转染对猪细胞系piec的敲除效率达到30％。这一结果说明，本发明构建的px335-xcas9n效率较高，可以识别40bp左右的靶标dna序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。而普通的crispr/xcas9系统仅可识别20bp的靶标系列，本发明将识别序列长度提高了一倍，其特异性大大提高。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的px335-xcas9n基因修饰效率较高，可以识别40bp左右的靶标dna序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。普通的crispr/xcas9系统仅可识别20bp的靶标系列，本发明将识别序列长度提高了一倍，其特异性大大提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一种px335-xcas9n载体及其构建方法和应用

<160>47

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8449

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60

ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120

aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180

atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240

cgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataag300

gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagct360

agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagac420

aaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc480

ccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtc540

aatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgc600

caagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagt660

acatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctatta720

ccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccac780

ccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggg840

ggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcgga900

gaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggc960

ggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgc1020

tgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactg1080

accgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattag1140

ctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattac1200

ctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgtacccat1260

acgatgttccagattacgcttcgccgaagaaaaagcgcaaggtcgaagcgtccgacaaga1320

agtacagcatcggcctggccatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacg1380

agtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatca1440

agaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggc1500

tgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaag1560

agatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagt1620

ccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtgg1680

acgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtgg1740

acagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagt1800

tccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagc1860

tgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgcca1920

gcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaa1980

atctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccc2040

tgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggataccaaac2100

tgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcg2160

accagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcg2220

acatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagc2280

tgtacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgc2340

ctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattg2400

acggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatgg2460

acggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcgga2520

ccttcgacaacggcatcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgc2580

ggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcc2640

tgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcct2700

ggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgagaaggtggtggaca2760

agggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgccca2820

acgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagc2880

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<210>2

<211>8506

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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