粪便DNA提取试剂盒的制作方法

本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种粪便dna提取保存液及保存管、试剂盒和提取方法。

背景技术：

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌。近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，同时，其发病年龄趋向老龄化。在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。近年来的一些研究表明k-ras，p53，apc，mmr等一些基因的突变会导致正常结肠黏膜上皮细胞转化成肿瘤细胞(vogelstein，b.andkinzler，k.w.，1993)，对这些基因突变的研究进展，使得通过粪便dna检测诊断结直肠癌成为一种可能。而能否高效提取粪便中人基因组dna成为影响诊断准确性的关键因素。

粪便成分复杂，含有大量多糖、胆酸等对人基因组dna检测可产生抑制作用的成分，且粪便dna绝大部分来源于肠道细菌，人源dna含量很少。所以采集来的粪便样品需尽快保存，目前常用的保存方法一般是低温处理，即冷冻保存。冷冻方法操作复杂，成本高，无法快速便捷采集样本。

另外，试剂盒法是目前临床应用广泛且最简便的方法，商品化的粪便dna提取试剂盒种类繁多，性能迥异，但粪便人基因组dna提取效率不同。另外，由于临床粪便样本量大，采集后通常无法及时进行dna提取即被储存，粪便中含有的大量核酸酶会对粪便dna造成严重降解，因此，储存时间对人基因组dna提取效率的影响很大。

如中国发明专利(公开号cn106967712a，公开日：2017.07.21)粪便dna快速提取试剂盒，该提取试剂原理为：对所提取的粪便用粪便处理液进行前处理，离心除去粪便残渣和吸附去掉部分蛋白等杂质，用磁珠裂解液和蛋白酶k将核酸裂解释放出来，释放出来的核酸特异性的结合到混合了特异性探针的磁珠上，通过1轮洗涤液1和2轮洗涤液2的洗涤后，用洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来并把洗脱后的磁珠弃掉，最后得到粪便基因组。该专利还是重在于如何快速提取，对于如何有效的保存dna，则不再考虑范围。

也有关于粪便dna保存的技术，如中国发明专利(cn108866045a，公开日2018.11.23)公开了一种人类粪便dna提取方法，该方法在人排出粪便后，立即采集2-5g粪便样品放入采集管中，采集管中装有10-15ml粪便保存，所述粪便保持液成分：0.3-0.6medta，3-6mnacl，0.3-1.5mtris。中国发明专利(公开号cn107980763a公开日2018.05.04)公开了粪便保存试剂，包括细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂；细胞缓冲液为tris-hcl，工作ph范围为8-10；细胞固定剂选自sds、tritonx-100和peg-2000中的至少一种；金属离子螯合剂为edta和/或edta-na2；防腐剂为nacl。这两个技术都是采用tris-hcl缓冲体系，nacl作为防腐剂，在实际应用中dna还是容易降解，对人基因组dna提取效率的影响很大。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种粪便dna提取保存液，该保存液在高edta/碱性的条件下，采用酒精作为杀菌剂，同时采用丙氨酸作为高碱性环境的缓冲体系，并采用十二烷基硫酸钠和聚乙烯吡咯烷酮协同作为洗涤剂和去垢剂，能延长粪便保存时间，粪便离体后立即得到保护，确保了基因的完整性。

为了实现上述的目的，本发明的一种粪便dna提取保存液，该保存液包括0.20～0.30medta，0.2～0.8％丙氨酸，20～30％乙醇，0.2～0.8％十二烷基硫酸钠，1.0～5.0％聚乙烯吡咯烷酮，ph10.0～11.0；上述的百分比为质量百分比。

本发明保存液中各个组分的功能：1.edta：作为核酸酶的抑制剂和作为稳定剂。2.丙氨酸：提供高碱性环境的缓冲体系。3.酒精：具有较强的杀菌作用，能起到固定样本材料。4.sds：洗涤剂、阴离子型表面活性剂、去垢剂。5.pvp:洗涤剂。同时本发明的各个组分具有协同作用，能延长粪便保存时间，使粪便离体后立即得到保护，确保了基因的完整性。

作为一个具体的实施方式，该保存液包括0.25medta，0.5％丙氨酸，25％乙醇，0.5％十二烷基硫酸钠，2.0％聚乙烯吡咯烷酮，ph10.5；上述的百分比为质量百分比。

本发明的另外一个目的是提供一种粪便dna提取保存管，该保存管含所述的保存液。

本发明的另外一个目的是提供一种粪便dna提取试剂盒，该试剂盒包括粪便保存液、裂解液、结合缓冲液、洗涤液和洗脱液，所述的粪便保存液采用所述的保存液。

作为a方案，所述的裂解结合液含有：0.1mtris-hcl，15mmedta，1mnacl，3mguscn，1.0％十二烷基硫酸钠，ph8.9；结合缓冲液为质量百分比浓度为80％的异丙醇；所述的洗涤液包括洗涤液i和洗涤液ii，洗涤液i含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，ph8.0；洗涤液ii包括：10mmtris，80％乙醇，ph7.5；洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。

作为b方案，所述的裂解结合液含有：0.1mtris-hcl，15mmedta，1mnacl，3mguscn，1.0％十二烷基-n-甜菜碱，ph8.9；结合缓冲液为质量百分比浓度为80％的异丙醇；所述的洗涤液含有：3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，碳酸氢钠35mm,ph9.0；洗脱液含有：10mmtris，0.1mmedta，ph9.0。目前，磁珠法提取dna中均要经过2-4次不等的洗涤，不仅消耗时间，而且洗涤后吸取上清时需要较为精细的操作，容易产生污染/不适合实验室外现场操作)和提取效果上也有很多待改进之处，洗涤次数，申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠(碱性略强于醋酸钠和氯化钠)的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂十二烷基-n-甜菜碱，可以实现一步洗涤(申请人的专利：申请号：2019102093130，进行了详细的记载)。

本发明的另外一个目的是提供所述的试剂盒提取粪便dna的方法。

作为一个具体的实施方式，该方法a方案的试剂盒，该方法包括以下的步骤：

1)含1ml粪便保存液离心管内中加入0.2g粪便，震荡混匀；

2)将离心管加热70℃涡旋震荡20min；

3)将离心管12000rpm离心5min，弃上清留沉淀；

4)沉淀中加入1ml的裂解液，10ulenhancer，15ulinhibitorremover，涡旋震荡为悬浮液；

5)将离心管加热55℃震荡20min；

6)将离心管12000rpm离心取上清，10ul磁珠，65℃震荡5min；

7)加入洗涤液i洗两次；

8)加入洗涤液ii洗两次；

9)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；回收得到的dna，保存于-20℃。

作为一个具体的实施方式，该方法b方案的试剂盒，包括以下的步骤：

1)含1ml粪便保存液离心管内中加入0.2g粪便，震荡混匀；

2)将离心管加热70℃涡旋震荡20min；

3)将离心管12000rpm离心5min，弃上清留沉淀；

4)沉淀中加入1ml的裂解液，10ulenhancer，15ulinhibitorremover，涡旋震荡为悬浮液；

5)将离心管加热55℃震荡20min；

6)将离心管12000rpm离心取上清，10ul磁珠，65℃震荡5min；

7)将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

8)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；回收得到的dna，保存于-20℃。

本发明的另外一个目的是提供所述的保存液或所述的保存管或粪便dna提取试剂盒在基因筛查和法医鉴定中的应用。

本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下的特点：

(1)高edta/碱性的保存液能延长粪便保存时间，粪便离体后立即得到保护，确保了基因的完整性；

(2)裂解液裂解效果快速稳定，常温下即可将样本核酸释放出来，同时对释放出的dna进行结合，一个步骤完成裂解和结合两大功能；省时省力，提高效率，便于上机操作；

(3)既适用于手动提取，也能在微孔板中以自动化的方式配套核酸提取仪使用，提取纯度高且操作简便安全，有效避免粪便提取过程中易降解，提取质量差的问题；

(4)高浓度、纯度：与磁珠相结合，提取的dna浓度、纯度很高，可直接用于下游实验；

(5)试剂盒具有良好的稳定性；

(6)试剂不含酚、氯仿等有毒溶剂，操作安全环保。

附图说明

图1为实施例1方法五人的粪便样本提取dna的电泳图片。

图2为实施例1方法五个粪便样本提取的dna浓度图。

图3为实施例1方法粪便常温放置1d、3d、7d、14d的样本dna的电泳图片。

图4为实施例1方不同保存时间提取的dna浓度图。

图5为实施例2方法五人的粪便样本提取dna的电泳图片。

图6为实施例2方法粪便常温放置1d、3d、7d、14d的样本dna的电泳图片。

图7为实施例1方法部分扩增产物电泳图片。

具体实施方式

主要试剂和仪器

tris-hcl、tris、edta、alanine、nacl、sds、pvp和guhcl由sigma提供；

乙醇、异丙醇由国药集团生产；

本申请检测方法中所用磁珠由qiagen生产(取自magattractdnakit，enriching试剂盒中的磁珠为试剂盒自带)。

检测样本来源

验证本申请试剂盒dna提取效果时使用的粪便样本来源来自合作医疗检测机构正常采集的样本。

实施例1

一、配方：

1、粪便保存液:0.25medta,0.5％丙氨酸,25％乙醇,0.5％十二烷基硫酸钠,2％pvp；ph10.5；

2、裂解液:0.1mtris-hcl，15mmedta，1mnacl，3mguscn，1％十二烷基硫酸钠，20％异丙醇；ph8.9；

3、washi:3mguhcl，10mmtris，50％乙醇；ph8.0；

4、washii:10mmtris，80％乙醇；ph7.5；

5、elution:10mmtris，0.1mmedta；ph9.0。

二、取粪便dna的方法，该方法包括以下的步骤：

1)含1ml粪便保存液离心管内中加入0.2g粪便，震荡混匀；

2)将离心管加热70℃涡旋震荡20min；

3)将离心管12000rpm离心5min，弃上清留沉淀；

4)沉淀中加入1ml的裂解液，10ulenhancer，15ulinhibitorremover，涡旋震荡为悬浮液；

5)将离心管加热55℃震荡20min；

6)将离心管12000rpm离心取上清，10ul磁珠，65℃震荡5min；

7)加入洗涤液i洗两次；

8)加入洗涤液ii洗两次；

9)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；回收得到的dna，保存于-20℃。

实施例2

一、配方：

1、粪便保存液:0.25medta,0.5％丙氨酸,25％乙醇,0.5％十二烷基硫酸钠,2％pvp；ph10.5；

2、裂解液:0.1mtris-hcl，15mmedta，1mnacl，3mguscn，1％十二烷基硫酸钠，20％异丙醇；ph8.9；

3、wash:3mguhcl，10mmtris，50％乙醇，碳酸氢钠35mm,ph9.0；

4、elution:10mmtris，0.1mmedta；ph9.0。

二、取粪便dna的方法，该方法包括以下的步骤：

1)含1ml粪便保存液离心管内中加入0.2g粪便，震荡混匀；

2)将离心管加热70℃涡旋震荡20min；

3)将离心管12000rpm离心5min，弃上清留沉淀；

4)沉淀中加入1ml的裂解液，10ulenhancer，15ulinhibitorremover，涡旋震荡为悬浮液；

5)将离心管加热55℃震荡20min；

6)将离心管12000rpm离心取上清，10ul磁珠，65℃震荡5min；

7)将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

8)加入洗脱液洗脱，60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；回收得到的dna，保存于-20℃。

试验例

1、dna溶液浓度及纯度测定

取待测dna2ul加入比色皿，再加入双蒸水至100ul后充分混匀，经uv-7504紫外可见光光度计，检测dna的od260、od280及od260与od280的比值。

dna浓度计算公式：dna浓度＝od260×稀释倍数×50/1000(ug/u1)；

dna纯度：od260/od280比值为1.8-2.0，认为dna纯度比较好；od260/od280比值明显大于2.0，认为dna中可能有rna污染或dna片段断裂；od260/od280比值明显低于1.8，认为dna中可能有蛋白质或残余抽提时的酚。

2、2％琼脂糖凝胶电泳判断所提取的dna的浓度及完整性

取5ul提取的dna+lul的loadingbuffer(总体积6u1)，加入2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min，在kh-uvi型紫外透射分析仪中观察条带的纯度并估计浓度，并拍摄照片，作记录。

3.人体基因组dna的确认

因为粪便中人体基因组dna只占dna总量的1％左右，实施例1所提供的实验流程只是尽可能提高人体基因组在说提取的dna中的比例，但不能完全排除非人类dna。一般用扩增人类特有的基因来判断，根据文献报道，本实验用β-actin基因。

1)β-actin基因扩增：

人基因组β-actin基因扩增反应液配制及反应条件设置见下表1、表2，引物、退火温度及产物见表3。

表1β-actin基因扩增反应液组成

表2β-actin基因扩增反应条件

表3pcr反应的引物、退火温度及产物大小

2)pcr扩增结果的检测：

扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，在kh—uvi型紫外透射分析仪中观察扩增条带的纯度并估计浓度，并拍摄照片，作记录。

4、结果

1)粪便dna的提取结果

提取粪便dna按实施例1步骤操作，所得产物使用分光光度计测量260rim波长下od值，再换算成dsdna浓度。共提取粪便样本100例，200mg粪便所提取的dna量波动于20-105ug，平均56ug。dna的od260/od280比值小于18为8例，1.8～2.0之m为90例，大于2.0为2例。

取五组，对提取所得粪便dna采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图1，dna浓度如图2所示。其中一组粪便常温放置1d、3d、7d、14d的样本采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图3，dna浓度如图4所示。

提取粪便dna按实施例2步骤操作，所得产物使用分光光度计测量260rim波长下od值，再换算成dsdna浓度。共提取粪便样本100例，200mg粪便所提取的dna量波动于30-85ug，平均45ug。dna的od260/od280比值小于18为11例，1.8～20之m为86例，大于2.0为3例。

取五组，对提取所得粪便dna采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图5。其中一组粪便常温放置1d、3d、7d、14d的样本采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图6。

2)人基因组dna的确认

对实施例1样本提取的粪便dna为确认人基因组的存在，进行pcr反应扩增人基因β-actin片段，扩增产物用15％琼脂糖凝胶电泳，扩增出目的片段后进行下一步亚硫酸氧盐处理及ms-pcr反应。100例粪便dna全部可以扩增出人基因β-actin段，部分扩增产物电泳结果见图7。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。