一种密罗木基因MfWRKY7及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种密罗木基因mfwrky7及其应用。
背景技术：
：干旱和盐渍化是当今植物面临的主要非生物灾害之一，其主要作用机理是使植物内外渗透压不一致导致机体脱水。人口的增长，城镇建设的快速发展，不仅导致民用、工业、农业用水竞争日益激烈，也造成污染加剧，生态系统破坏，水资源短缺，土壤盐渍化现象日益加剧等现象。因此，发掘抗逆基因，培育抗逆性强的植物新品种，对加快建设资源节约型、环境友好型社会，大力发展绿色经济，增强可持续发展能力，实现经济发展和生态文明的有机统一具有重要作用。基因工程技术是植物抗逆性改良的重要手段。目前，已有不少抗逆基因被报道和应用，其中转录因子基因通过与其调控的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而调控靶基因的表达，以对外界不良环境做出响应。与植物抗逆性有关的转录因子很多，如myb类、bzip类、wrky类、ap2/erf类和nac类等。wrky转录因子在植物胁迫响应信号转导过程也扮演着重要角色。wrky转录因子属于一类大的转录因子家族，参与调控植物生长发育中的多种信号途径，其典型特征为n端存在着由一段长度大约60个氨基酸所组成的保守wrky结构域。已有大量研究表明wrky转录因子可受到多种逆境条件如干旱、盐、射线、低温、高温等的诱导，并在植物对逆境的抗性反应中发挥作用。密罗木主要分布在南非，是地球上为数不多的极耐旱复苏植物之一，也是唯一的木本复苏植物。它能够像种子一样耐受高度脱水干燥，在组织含水量仅存7％-11％时仍能保持遇水复活的特性。因此，密罗木是一种理想地研究植物抗旱性的材料。然而过去，研究人员主要通过形态学、生理、生化等方面研究了该植物的抗旱机理，但对于其中与抗逆相关的基因及其分子机制还不清楚，也尚未见密罗木中抗逆wrky转录因子及其应用的相关报道。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因mfwrky7及其应用，该基因能在干旱脱水期快速响应，提高作物的抗旱性能。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种密罗木基因mfwrky7，该基因的编码序列如seqidno.1所示或seqidno.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。其中，seqidno.1所示序列为从密罗木叶片rna中通过pcr克隆得到的，全长987bp。采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示或seqidno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。其中，seqidno.2所示的氨基酸序列由328个氨基酸组成，有两个核定位信号：sllkrkcssm和rchcskkrksr；其含有一个wrky保守结构域，位于257～313个氨基酸的位置，并且还含有一个典型c2h2型锌指结构，为第二类wrky转录因子家族。包含上述密罗木mfwrky7基因的质粒。包含上述密罗木mfwrky7基因的重组表达载体。包含上述密罗木mfwrky7基因的转基因细胞系。包含上述密罗木mfwrky7基因的工程菌。密罗木基因mfwrky7在作物抗旱过程中的应用。本发明的有益效果为：1.获得了对干旱及盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥。2.密罗木基因mfwrky7能在干旱脱水期快速响应，为利用该基因提高其他植物的干旱耐受性提供了理论依据及利用价值。附图说明图1为本发明的密罗木基因mfwrky7的系统进化树；图2为转mfwrky7基因植株的阳性鉴定结果；图3为野生型和转基因拟南芥(arabidopsisthaliana)植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图3a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图3b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图3c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；图4为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图4a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图4c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；图5为野生型和转基因拟南芥植株失水率测定；图6为野生型和转基因拟南芥植株的脯氨酸含量测定；图7为野生型和转基因拟南芥植株的气孔测定；其中，图7a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状；图7b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合程度；图8为野生型和转基因拟南芥植株的叶绿素测定；具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
技术领域：
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例1克隆密罗木mfwrky7基因1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总rna；总rna提取采用成都兰博生物公司购买的planttotalrnaisolationkit试剂盒来提取；密罗木cdna的合成使用大连宝生物科技公司的reversetranscriptasem–mlv(rnaseh-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。以上述试剂盒合成的cdna第一链为扩增模板，以设计的f：5’-tcccccgggatggcggttgagcttatgtt-3’(seqidno.3)和r：5’-ggactagtctaagaagattcgaggacca-3’(seqidno.4)为引物，为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时加上smai和spei这两个酶切位点，利用pcr进行cdna扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。表1pcr扩增体系试剂用量dna100～150ng引物f5pmol引物r5pmoltaqplus聚合酶1u10×pcr缓冲液2.5μlmg2+1.5mmddh2oupto25μl2、pcr结束后进行电泳分析，采用omega公司的dna回收试剂盒回收约987bp的扩增片段，将扩增片段连接到peasy-t1simple克隆载体，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落pcr以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因mfwrky7的编码序列，其序如seqidno.1所示，再利用orffinder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例2密罗木mfwrky7的序列同源与同源性分析根据序列测序结果，在ncbi数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与wrky家族转录因子同源关系最近，将该转录因子与其它wrky转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，发现其锌指结构类型为c2h2型，依据该dna结合域的结构特征，该mfwrky7蛋白属于第二类wrky转录因子家族；进一步利用比对的同源性较高物种的氨基酸序列构建系统进化树(如图1)，发现密罗木mfwrky7与其他物种的亲缘关系较远，其结构域较为保守。实施例3：密罗木基因mfwrky7植物表达载体的构建将上述经测序正确的菌液提取质粒，含mfwrky7基因的克隆载体质粒经smai+spei双酶切后，利用dna回收试剂盒回收987bp左右的dna片段，将此片段与相应酶切的pgsa1403表达载体相连，获得的载体命名为35s:mfwrky7-pgsa1403。实施例4：mfwrky7基因的遗传转化将农杆菌lba4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μl重组质粒35s:mfwrky7-pgsa1403于200μl感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μllb液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/ml氯霉素的lb固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mllb液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1ml上述菌液转入50ml含10μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至od600≈1.5。将上述od值达标的菌液4℃，8000r/min离心10min收集菌体，弃掉上清，用等体积的5％蔗糖溶液将菌体重悬，在菌液中加入silwet-77并混匀，使溶液浓度达到0.02％且菌液od600≈0.8。转化前需剪掉成熟的果荚，颠倒植株让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，然后将浸好的植株用滤纸擦干并用塑料薄膜包裹，暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为t0代。继续将t0代拟南芥种子放入含有50μg/ml卡那霉素的培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。因此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取dna并进行pcr检测阳性(如图2)，获得t1代转基因植株，重复筛选步骤直至筛选出阳性过表达纯系植株。实施例5：转基因拟南芥的胁迫处理对于幼苗处理，是将野生型和过表达t3代纯系(oe1，oe2)分别播种于配置含nacl(75mm，100mm，125mm)、甘露醇(200mm，250mm，300mm)的1/2ms培养基中，对照组只添加正常成分，记为ck。每个方形培养皿中三种株系分成两排点播，每排15株左右，每个处理重复三次，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。干旱胁迫下的幼苗表型如图3，其中，图3a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图3b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图3c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态。盐胁迫下的幼苗表型如图4，其中，图4a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图4c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。对于成株的处理，是将野生型拟南芥(wt)和过表达t3代纯系(oe1，oe2)种子播种在1/2ms圆形培养皿，4℃暗处理3d后移入光照培养箱中培养至四叶期后移入花盆中，培养3周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。干旱胁迫处理：对照组(记为ck)正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间不断观察拍照并记录植株生长状况，失水4周左右，处理期间拍照观察。野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态如图3c；每个株系10株重复。盐胁迫处理：对照组不作处理，记为ck，其余组每隔3天浇一次300mm的氯化钠处理液。2周后观察wt与过表达植株表型差异。野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态如图4c；每个株系10株重复。通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达mfwrky7基因株系oe1和oe2对干旱及盐的耐受性均明显强于wt，说明过表达mfwrky7基因提高了拟南芥对盐及干旱胁迫的抗性。实施例6：相关生理指标的测定(1)拟南芥的培养将野生型拟南芥(wt)和过表达t3代纯系(oe1，oe2)种子播撒在1/2ms圆形培养皿，4℃暗处理3d后转入光照培养箱中培养7天，移栽至50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。(2)失水率的处理及测定将穴盘中培养的wt，oe1，oe2浇足水分，剪去莲座叶对其取样，在天平上用定量滤纸称取三个株系各0.5g叶片，此时叶片含水量为初始含水量，记为m0，此后将叶片放入恒温光照培养箱中让其自然干旱(25℃，60％相对湿度)，在0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h分别称取叶片即时重量。结果如图5所示。(3)脯氨酸含量的测定在天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内用少量蒸馏水溶解后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg；取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3ml，用蒸馏水定容至刻度并混匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml。拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对wt，oe1，oe2三种植株进行自然干旱和浇灌300mm氯化钠溶液处理(自然干旱处理14d，氯化钠处理2d)，随后取正常条件和经过干旱、氯化钠处理的wt，oe1，oe2植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10ml离心管并定容至10ml，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10ml。吸取2ml提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2ml酸性茚三酮和2ml冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4ml甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次，结果如图6所示。(4)甘露醇处理下气孔开度的测定拟南芥的培养同(1)，取wt，oe1，oe2的莲座叶叶片，每个株系撕取10块下表皮，置于100ml的mes-kcl缓冲液(50mmkcl，0.1mmcacl2，10mmmes，ph6.15)中光诱导2.5h，然后每个株系取5块下表皮分别置于100ml不含以及含300mm甘露醇的mes-kcl缓冲液(50mmkcl，0.1mmcacl2，10mmmes，ph6.15)中光下处理2h，处理完后放在荧光显微镜(10*40)下观察，气孔闭合程度(长与宽的比)作为统计气孔开度的指标，每个表皮条随机选取4个视野，每个视野随机测量10个气孔，总共统计100个气孔细胞，结果如图7所示，其中，图7a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状；图7b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合程度。(5)盐胁迫下叶绿素含量的测定拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对wt，oe1，oe2三种植株浇灌200mm氯化钠溶液处理2天，随后取正常生长和经氯化钠处理的wt，oe1，oe2植株叶片鲜样各0.5g，将其叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50ml的棕色容量瓶中，分别加入上述95％乙醇提取液50ml，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗中提取48h。因为95％乙醇提取液在波长为649nm和665nm处具有最大吸光值a649和a665，所以用紫外分光光度计测量a649和a665，以95％乙醇提取液作为空白对照，此步骤重复两次；结果如图8所示。序列表<110>四川农业大学<120>一种密罗木基因mfwrky7及其应用<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>987<212>dna<213>密罗木(myrothamnusflabellifolia)<400>1atggcggttgagcttatgttaggttacaattttgcatcaagaatggaagatcatgcggtg60gaagaagcggcttcggcggggcttcagagcgtggagaagctgataagattgttatctcaa120aatcaacaacaaaaccaacagtttcaagaggaaaaatcttcaaaccctaaatcgtctgcg180gatatagaaatggattgcaaagctgttgcagatatagcagtgaccaaatttaagaaggtt240atttctttactcgatcgttcgagaactggccacgctcggtttagaagggcgcctttacct300tcttctcctactcctcaacaacaacagcaagaaacacaaaaacctagcgatcttcatcaa360tctgcagaggataaacaagtctctggatctaaggtttatcatcctacgccaattcaacgc420ttgcctcctcttcctcataatcaccaacttaaatctcttgagaggagggaatcaacggcg480acgatcaacttttcttcttcccctgccaattcgttcatttcgtcgctgaccggtgataca540gacagtatacagccatcgttatcgtcggcgtttcagttgacttcatccgctggtcggcct600cctctgtcggcatctttgcttaagaggaagtgttcttccatggatgatgcagcaatcaag660tgcggtg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