本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基和生产杆菌霉素d的方法。
背景技术：
近年来，玉米秸秆的不合理处理方式引发的环境问题日益恶化，如何有效利用玉米秸秆已成为国内外研究的焦点。
杆菌霉素d(bacillomyicind)是由枯草芽孢杆菌产生的一种次生代谢产物，属环状脂肽类化合物，具有抑制病原菌生长和抗肿瘤等生理活性，有望将来开发成天然食品防腐剂，具有广阔的应用前景。目前，最常见的利用枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的方法，是采用landy培养基作为发酵培养基。landy培养基成分很复杂，价格昂贵。landy培养基发酵生产杆菌霉素d的能力仍然有限，且杆菌霉素d的提取工艺复杂，很难实现杆菌霉素d的大规模工业化应用。因此，创制简易杆菌霉素d发酵培养基，减低成本，简化杆菌霉素d制备工艺，对绿色生产杆菌霉素d和有效提高玉米秸秆的附加值，显得十分重要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基和生产杆菌霉素d的方法；杆菌霉素d的生产成本低，且能提高玉米秸秆的附加值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基，所述发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
(1)将玉米秸秆烘干后粉碎，得到玉米秸秆粉末；
(2)将所述玉米秸秆粉末、纤维素酶和无菌水混合，40～60℃酶解60～100h，得到酶解液；
(3)将所述酶解液离心，得到酶解上清液；
(4)将所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4混合，得到用于生产杆菌霉素d的发酵培养基；
步骤(4)所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4的混合比例为80～120ml：1～3g：5～15g：0.5～1.5g。
优选的，步骤(1)所述烘干的温度为60～70℃，所述粉碎的程度为过50～80目筛。
优选的，步骤(2)所述玉米秸秆粉末与所述纤维素酶的比例为1g：500～600u；所述玉米秸秆粉末酶解时的料液比为1g：16～26ml。
优选的，步骤(3)所述离心的转速为6000～10000r/min，离心的时间为5～15min。
优选的，步骤(1)得到玉米秸秆粉末后，还包括第一灭菌；所述第一灭菌的灭菌温度为118～124℃，灭菌时间为20～40min；步骤(4)所述混合后，还包括第二灭菌；所述第二灭菌的灭菌温度为111～119℃，灭菌时间为15～25min。
本发明还提供了一种生产杆菌霉素d的方法，包括如下步骤：
i，将枯草芽孢杆菌扩繁液接种于上述发酵培养基中，28～38℃发酵培养72～168h，得到发酵液；
ii，将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
iii，调节所述发酵上清液的ph值≤3，静置2～8h，离心收集沉淀、干燥，得到杆菌霉素d干燥粗肽固体。
优选的，步骤i所述枯草芽孢杆菌扩繁液的od600为0.8～1.0；所述接种的量为4～8％。
优选的，步骤ii所述离心的转速为4000～8000r/min，离心的时间为10～20min。
优选的，步骤iii所述离心的转速为4000～8000r/min，离心的时间为5～15min。
优选的，步骤iii使用2～3mol/lhcl溶液调节ph值；步骤iii所述干燥的温度为50～70℃。
有益效果：
本发明提供了一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基和生产杆菌霉素d的方法。所述发酵培养基的制备方法包括：(1)将玉米秸秆烘干后粉碎，得到玉米秸秆粉末；(2)将所述玉米秸秆粉末、纤维素酶和无菌水混合，40～60℃酶解60～100h，得到酶解液；(3)将所述酶解液离心，得到酶解上清液；(4)将所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4混合，得到用于生产杆菌霉素d的发酵培养基；所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4的混合比例为：80～120ml：1～3g：5～15g：0.5～1.5g。本发明利用纤维素酶酶解玉米秸秆，再以玉米秸秆酶解液制备得到发酵培养基，实现了有效发酵生产杆菌霉素d，并对杆菌霉素d制备工艺进行了简化。本发明还提供一种生产杆菌霉素d的方法，该方法利用上述发酵培养基生产杆菌霉素d，降低了杆菌霉素d的生产成本，提升了玉米秸秆的附加值。
具体实施方式
本发明提供了一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基，所述发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
(1)将玉米秸秆烘干后粉碎，得到玉米秸秆粉末；
(2)将所述玉米秸秆粉末、纤维素酶和无菌水混合，40～60℃酶解60～100h，得到酶解液；
(3)将所述酶解液离心，得到酶解上清液；
(4)将所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4混合，得到用于生产杆菌霉素d的发酵培养基；
步骤(4)所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4的混合比例为80～120ml：1～3g：5～15g：0.5～1.5g。
本发明先将玉米秸秆烘干后粉碎，得到玉米秸秆粉末。在本发明中，所述玉米秸秆优选为成熟、无病虫害、去除灰尘、清洗干净的玉米秸秆。所述玉米秸秆在烘干前，优选用剪刀剪至1～2cm小段。所述烘干优选使用电热鼓风干燥箱。所述烘干的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。在本发明中，所述粉碎优选使用固体告诉粉碎机。所述粉碎的程度优选为过50～80目筛，更优选过60目筛。得到玉米秸秆粉末后，本发明优选进行第一灭菌。所述第一灭菌的灭菌温度优选为118～124℃，更优选为121℃；灭菌时间优选为20～40min，更优选为30min。
得到玉米秸秆粉末后，本发明将所述玉米秸秆粉末、纤维素酶和无菌水混合，利用纤维素酶对玉米秸秆粉末进行酶解，得到酶解液。在本发明中，所述玉米秸秆粉末与所述纤维素酶的比例优选为1g：500～600u，更优选为1g：550u；所述玉米秸秆粉末酶解时的料液比为1g：16～26ml；更优选为1g：18～24ml，更优选为1g：21ml。所述酶解的温度优选为40～60℃，更优选为50℃。所述酶解的ph优选为5.0。所述酶解的时间优选为60～100h，更优选为70～90h，更优选为79.8h。
酶解后，本发明将所述酶解液离心，得到酶解上清液。在本步骤中，所述离心的转速优选为6000～10000r/min，更优选为8000r/min。所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。
得到酶解上清液后，本发明将所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4混合，得到杆菌霉素d发酵培养基。在本发明中，所述酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4的混合比例为80～120ml：1～3g：5～15g：0.5～1.5g，优选为90～110ml：1.5～2.5g：8～12g：0.8～1.2g，更优选为100ml：2g：10g：1.0g。在本发明中，所述混合后优选进行第二灭菌，所述第二灭菌的灭菌温度优选为111～119℃，更优选为115℃；灭菌时间优选为15～25min，更优选为15min。
本发明还提供了一种生产杆菌霉素d的方法，包括如下步骤：
i，将枯草芽孢杆菌扩繁液接种于上述发酵培养基中，28～38℃发酵培养72～168h，得到发酵液；
ii，将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
iii，调节所述发酵上清液的ph值≤3，静置2～8h，离心、干燥，得到杆菌霉素d干燥粗肽固体。
本发明先将枯草芽孢杆菌扩繁液接种于上述发酵培养基中发酵培养，得到发酵液。本发明对具体的枯草芽孢杆菌种类没有特别限制，本领域用于生产杆菌霉素d的枯草芽孢杆菌均可。为了说明本发明发酵培养基的作用，在本发明更具体的实施方式中，所述枯草芽孢杆菌扩繁液优选使用实验室保存的枯草芽孢杆菌hsbs-177经活化、扩繁得到。所述枯草芽孢杆菌扩繁液的od600优选为0.8～1.0，更优选为0.9；所述接种的量优选为4～8％，更优选为6％。在本发明中，所述发酵培养的温度为28～38℃，优选为30～35℃，更优选为33℃。所述发酵培养的振荡频率优选为160～200r/min，更优选为180r/min。所述发酵培养的时间为72～168h，更优选为96～144h，更优选为120h。
得到发酵液后，本发明将所述发酵液离心，得到发酵上清液。在本步骤中，所述离心的转速优选为4000～8000r/min，更优选为6000r/min；离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
得到发酵上清液后，本发明优选使用2～3mol/lhcl溶液，更优选使用2.5mol/lhcl溶液调节所述发酵上清液的ph值，所述ph值≤3，优选≤2。调完ph值后室温静置，所述静置的时间优选为2～8h，更优选为4h。静置后离心收集沉淀、干燥，得到杆菌霉素d干燥粗肽固体。在本步骤中，所述离心的转速优选为4000～8000r/min，更优选为6000r/min；离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。所述干燥的温度优选为50～70℃，更优选为60℃。
本发明采用纤维素酶酶解玉米秸秆，制备的杆菌霉素d发酵培养基配方简单，能有效发酵生产杆菌霉素d，减低了杆菌霉素d的生产成本。利用本发明创制的简易发酵培养基发酵生产杆菌霉素d，成本低廉，杆菌霉素d制备方法操作简单，实用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选择无病虫害的成熟玉米秸秆，除去灰尘，清洗干净，用剪刀剪至1～2cm小段，放入电热鼓风干燥箱中，温度控制在65℃，烘干至恒重。
取出干燥后的玉米秸秆小段，置室温下，适当冷却(放置20分钟)后，用固体高速粉碎机粉碎，过60目筛，制成粉末备用。
精确称取2.00g玉米秸秆粉末，置于高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌30min后取出，冷却至室温。向灭菌后的玉米秸秆粉末中添加纤维素酶(10000u/g)和无菌水，并充分摇匀，在温度为50℃条件下进行充分酶解，酶解条件为：纤维素酶添加量0.11g，酶解时间79.8h，液料比21：1(酶解液体积：玉米秸秆粉末质量，ml/g)。
酶解后，取出酶解液，8000r/min离心10min，得到酶解上清液。向100ml酶解上清液中加入酵母提取物2.0g，l-谷氨酸钠(味精)10g和kh2po41.0g，115℃灭菌20min，冷却至室温，制成杆菌霉素d发酵培养基。
实施例2
将实验室保存的枯草芽孢杆菌hsbs-177，接种至斜面培养基上，于37℃恒温培养24h，挑取单菌落，接入种子培养基，于37℃摇瓶培养至od600为0.8～1.0，按6％的接种量接入实施例1制备的发酵培养基，于33℃，180r/min发酵培养120h。
取10.0ml发酵液于6000r/min离心15min，弃菌体，取上清液，用hcl将上清液ph调至2.0以下，室温静置4h，6000r/min离心10min，取沉淀，60℃烘干至恒重，制成杆菌霉素d干燥粗肽固体。
取少量杆菌霉素d干燥粗肽固体，研成粉末，加入1.0ml甲醇进行萃取，10000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱(hplc)法对杆菌霉素d进行含量测定，具体hplc条件和测定方法参照qian等文献进行。测得杆菌霉素d粗肽固体中杆菌霉素d(杆菌霉素d，mg；杆菌霉素d粗肽固体质量，g。)的含量为9.42mg/g。实验重复5次，相对误差为1.82％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。