本申请要求于2017年1月13日提交的美国临时专利申请第62/446,106号的优先权，将其内容出于所有目的整体并入本文。发明背景癌症为可以影响身体任意部位的一大类疾病的通用术语。癌症的一个典型特征为异常细胞的快速增殖，所述异常细胞的生长超出其通常的界限。然后，癌细胞可以以被称为转移的过程侵入身体的相邻部位，并扩散到其它器官。转移是癌症死亡的主要原因，并且也可以被癌症周围的细胞(被称为癌症基质细胞)或癌症微环境促进。据世界卫生组织(who)称，癌症是全世界死亡的主要原因，2008年死亡人数为760万(占所有死亡的约13％)。肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌每年导致大部分的癌症死亡。尽管在生物医学中进行了大量的研究工作和技术进步，但预测全世界癌症死亡将持续升高，到2030年估计有1310万例癌症死亡。由于癌症的普遍性及其对人类的显著影响，仍然迫切需要开发新的且更有效的癌症治疗策略。本申请解决了这一需求和其它相关需求，因为其提供了抗癌治疗的新策略：通过遗传修饰的自然杀伤(nk)细胞，使得smad3的表达和/或活性在这些细胞中基本上被阻抑，这些nk细胞的癌症杀伤活性被显著增强。因此，这些smad3-敲低的nk细胞是癌症治疗中新型且有效的工具。发明概述本申请涉及用于癌症免疫治疗的新方法和组合物。具体地，本申请的发明人发现，通过抑制免疫效应细胞，如自然杀伤(nk)细胞中的smad3的内源性表达和活性，效应细胞变得对tgf-β刺激具有抗性并且表现出显著增强的杀癌活性。因此，在第一方面，本申请提供了新的修饰的免疫效应细胞(例如，nk细胞)，其中与相同种类的未修饰的亲本细胞相比，修饰的细胞中的smad3活性被抑制或降低/阻抑，或甚至完全消除。例如，与未修饰的亲本细胞相比，在修饰的细胞中，smad3活性被抑制50％、70％、80％或更多。在一些情况下，smad3活性被去除。smad3活性的变化可能是由于smad3基因组序列已经被改变(如通过取代、缺失、插入或完全除去整个序列被改变)所引起的。在一些情况下，修饰的细胞在其基因组中包含编码对应于smad3基因组序列的至少一个区段或与其互补的多核苷酸序列的外源序列，此类序列的表达(尤其是在rna水平)导致smad3活性的阻抑。例如，可以通过编码smad3-破坏的序列(如shrna、反义、crispr-cas9或smad3的特异性抑制剂)的病毒和/或非病毒载体来实现smad3活性的抑制/消除。在一些情况下，效应细胞为nk细胞，例如，亲本nk细胞为人nk92细胞。在替代方案中，其它细胞类型可以用于产生修饰的smad3敲低的细胞，例如b细胞亚群、t细胞亚群、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞，以及非免疫细胞，包括干细胞或成纤维细胞。用于此类操作的合适的细胞可以为天然存在的细胞以及人工工程化的或重组产生的细胞，例如，遗传修饰的细胞，如嵌合抗原受体(car)t细胞。在第二方面，本申请提供了包含上文和本文所述的修饰的细胞，尤其是修饰的nk细胞，以及生理学可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于注射，例如，其可以被配制用于皮下注射、肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射或瘤内注射。在一些实施方案中，所述组合物被配制成施用于患者的剂型，例如，其可以被配制和包装成多个单位(例如，小瓶)，每个单位对于多天或多周治疗过程而言具有足够的量。在第三方面，本申请提供了治疗癌症的方法。所述方法包括向癌症患者施用有效数量的修饰的细胞，尤其是向有需要的患者施用上文和本文所述的nk细胞的步骤。在一些实施方案中，施用步骤包括注射，例如，皮下注射、肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射或瘤内注射。在一些实施方案中，每天、每两天、每周、每两周或每月进行一次施用。在一些实施方案中，所述方法还包括向患者共同施用(co-administration)第二抗癌治疗剂。在一些实施方案中，癌症是由细菌感染或病毒感染、毒素、药物、遗传学、吸烟、辐射和化学品引起的癌症。待治疗的癌症可以为原发性癌症或转移性癌症，例如，各种类型的皮肤癌(例如，黑色素瘤)、肝癌、肺癌、胃癌和结肠癌、各种类型的白血病、t细胞淋巴瘤和b细胞淋巴瘤、肉瘤以及消化系统、生殖系统和神经系统的其它类型的癌症。在相关方面，本申请提供了修饰的免疫效应细胞的实际应用：根据上文和本文所述的方法，它们可以用于制备治疗癌症的药物。附图简述图1:来自nk-92细胞的smad3的敲低增强体外杀癌活性。a、b，实时pcr和蛋白质印迹分析显示shrna-smad3的转导显著下调nk-92细胞中的smad3mrna和蛋白质表达。c、d，在存在或不存在tgf-β1(5ng/ml)的情况下，nk-92-s3kd细胞和nk-92-ev细胞针对人肝癌hepg2细胞和黑色素瘤a375细胞的杀癌活性的比较。通过细胞介导的细胞毒性测定试剂盒在不同的e:t比率下测量细胞毒性。数据表示针对三个独立实验组的平均值±sd。相对于nk-92-ev细胞，###p<0.001；相对于tgf-β1-处理的细胞，**p<0.01，***p<0.001；相对于tgf-β1-处理的nk-92-ev细胞，§§§p<0.001。图2:smad3的破坏增强nk-92-s3kd细胞中抗癌细胞因子的产生。a-c，实时pcr。d-f，elisa。结果显示来自nk-92细胞的smad3的敲低保护ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素的mrna和蛋白表达免于tgf-β1(5ng/ml)诱导的抑制作用。数据表示针对三个独立实验组的平均值±sd。相对于0ng/ml的tgf-β1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；相对于nk-92-ev细胞，##p<0.01，###p<0.001。图3:使smad3沉默增强hk92-s3kd细胞的体外gm-csf的产生。(a)细胞因子阵列分析；(b)实时rt-pcr；(c)elisa。结果显示tgf-β1的添加阻抑gm-csf在mrna和蛋白水平的表达，这通过使hk92-s3kd细胞中的smad3沉默来防止。示出的数据代表3个独立实验。相对于0ng/ml的tgf-β1，***p<0.001；相对于nk-92-ev，###p<0.001。图4:破坏的smad3大幅增强nk细胞介导的对具有hepg2和a375的nod/scid小鼠的抗肿瘤作用。a，hepg2的肿瘤体积。b，具有hepg2-luc肿瘤的小鼠的荧光素酶强度成像。c，hepg2的肿瘤重量。d，hepg2的肿瘤大小。e，a375的肿瘤体积。f，a375的肿瘤重量。g，a375的肿瘤大小。数据表示针对5-7只小鼠的组的平均值±sd。相对于盐水组，**p<0.01，***p<0.001；相对于nk-92-ev-处理的组，#p<0.05，###p<0.001。图5:nk-92-s3kd细胞的免疫治疗系统性地增加具有hepg2的小鼠中的抗癌细胞因子。a-c，肿瘤组织来源的人ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素。d-f，人ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素的血清水平。结果显示与亲本细胞相比，在肿瘤接种后28天，在具有hepg2的小鼠的肿瘤组织和血清中的ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素水平在用nk-92-s3kd细胞处理的荷瘤小鼠中加倍。数据表示针对至少6只小鼠的组的平均值±sd。相对于盐水组，**p<0.01，***p<0.001；相对于nk-92-ev组，###p<0.001。图6:在体外nk-92细胞中通过smad3依赖的e4bp4途径产生ifn-γ的调控机制。a，在nk-92中smad3磷酸化的蛋白质印迹分析。b，在nk-92-ev细胞中e4bp4mrna表达的实时pcr。c，在用5ng/mltgf-β1处理的nk-92细胞中e4bp4蛋白表达的蛋白质印迹分析。d-f，在用sis3(5μm)处理的nk-92-ev细胞中e4bp4的实时pcr、蛋白质印迹分析和ifn-γ的elisa。数据表示针对3次独立实验的平均值±sd。相对于0ng/ml的tgf-β1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；相对于nk-92-ev或仅tgf-β1-处理的，###p<0.001。图7:ifng为在成熟的人nk细胞中被smad3调控的e4bp4靶基因。a，e4bp4的3’utr上smad3结合位点(nfil3)。b，chip测定在12h检测到响应于tgf-β1(5ng/ml)的增加的smad3-e4bp4结合。c，e4bp4的启动子活性。smad3蛋白的过表达很大程度上阻抑e4bp4的启动子活性，当在e4bp4基因组序列的3’utr上预测的smad3结合位点缺失时，其被阻止。d，通过ecr浏览器(ecrbrowser)预测ifng基因的启动子区域上的e4bp4结合位点。e，chip测定检测infg上的e4bp4结合，其响应于tgf-β1(5ng/ml)在12h被极大地降低。f，e4bp4蛋白的过表达增强ifng的启动子活性，当在ifng启动子序列上的预测的e4bp4结合位点缺失时，其显著地被阻止。数据表示针对3个独立实验的平均值±sd。相对于ifng-空白，***p<0.001。图8:smad3和e4bp4的双重阻滞减弱体外nk-92细胞的ifn-γ的产生。a、b，nk-92细胞中e4bp4mrna和蛋白质表达的实时pcr和蛋白质印迹分析。c、d，nk-92细胞中ifn-γmrna和蛋白水平的实时pcr和elisa。数据表示针对3个独立实验的平均值±sd。相对于nk-92-ev，*p<0.05，***p<0.001；相对于nk-92-s3kd细胞，###p<0.001。图9:表达靶向人smad3mrna的shrna的重组质粒的构建。a，质粒骨架plvx-shrna1-puro的图谱；b，通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离用限制性内切酶xhoi消化的重组质粒的限制性dna产物。泳道m，dna标志物；泳道1，限制性dna产物；c，通过dna测序确认结果。图10:在不存在或存在tgf-β1的情况下，smad3的破坏不影响nk-92细胞的细胞增殖。将nk-92-ev细胞或nk-92-s3kd细胞以1x104/孔的密度接种在具有tgf-β1的96孔板中，保持44小时。添加mtt，并继续孵育4小时。通过在490nm波长的吸光度测定细胞活力。每个柱条代表针对3个独立实验的平均值±sd。相对于0ng/mltgf-β1，*p<0.05，**p<0.01。图11:smad3的破坏不影响tgf-β1对nk-92细胞中nkg2d表达的抑制作用。用tgf-β1刺激nk-92-ev和nk-92-s3kd细胞，持续3小时，并测量nkg2d的mrna水平。每个柱条代表来自3个独立实验的平均值±sd。相对于0ng/mltgf-β1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图12:nk-92-s3kd细胞转移不会在具有hepg2的小鼠中引起显著的不利影响。在开始nk细胞治疗后28天从具有hepg2-luc的小鼠中收集小鼠血清。a，肌酸酐；b，乳酸脱氢酶；c，丙氨酸转氨酶以及d，用商业试剂盒测量天冬氨酸转氨酶。每个柱条代表来自5-7只小鼠的组的平均值±sd。ns意为无显著性。图13:表达靶向人e4bp4mrna的shrna的重组质粒的构建。a，质粒骨架plvx-shrna2-neo的图谱。b，通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离用限制性内切酶miui消化的重组质粒的限制性dna产物。泳道m，dna标志物；泳道1，限制性dna产物，c，通过dna测序确认结果。图14:表达人smad3mrna的质粒(pcdna3.1+smad3)和含有e4bp43’utr的重组质粒(psi-check2-e4bp43’utr)的构建。a，扩增人smad3的cds(编码序列)区，并将其克隆至pcdna3.1+载体中。通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离用xhoi/kpni消化的重组质粒的限制性dna产物，这产生对应于smad3的cds大小的963bp的条带。泳道m，dna标志物；泳道1、2、3，限制性dna产物，突出了阳性克隆的实例；b，将e4bp4的3’utr克隆至psi-check2中。通过用限制性内切酶noti/xhoi消化来验证插入的e4bp43’utr(300bp)。泳道m，dna标志物；泳道1、2、3，限制性dna产物，如所示，突出了阳性克隆的实例。图15:e4bp4表达质粒(pcdna3.1+e4bp4)和含有pgl3-ifng启动子的重组质粒(pgl3-ifng启动子)的构建。a，扩增人e4bp4的cds区，并将其克隆至pcdna3.1+载体中。通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离用xhoi/bamhi消化的重组质粒的限制性dna产物，这产生对应于e4bp4的cds大小的1389bp的条带。泳道m，dna标志物；泳道1、2、3，限制性dna产物，突出了阳性克隆的实例；b，将ifng启动子克隆至pgl3质粒中。通过用限制性内切酶miui/xhoi消化来鉴定插入的ifng启动子(907bp)的准确性。泳道m，dna标志物；泳道1、2、3，限制性dna产物，如所示，突出了阳性克隆的实例。定义本文使用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶标生物过程，如靶基因的rna/蛋白表达、靶蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖、致瘤性和转移潜能的任何可检测的负面影响。通常，当与对照相比时，抑制体现于在靶标过程(例如，smad3的表达或活性、smad3介导的信号传导或癌症增殖)或上文提及的下游参数中的任何一个减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。“抑制”还包括100％的减少，即靶标生物过程或信号的完全消除或去除。其它相关术语，如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“减少(reducing)”和“减少(reduction)”在本公开中以相似的方式用于指靶标生物过程或信号的不同水平的降低(例如，与对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的降低)直至完全消除。另一方面，诸如“增加(increasing)”、“增加(increase)”、“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”的术语在本公开中用于涵盖靶标过程或信号的不同水平的阳性变化(例如，与对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多的增加，如3、5、8、10、20倍的增加)。术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)以及它们的聚合物。除非特别限定，该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述天然核苷酸类似物具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源体(ortholog)、snp和互补序列以及明确指明的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生这样的序列获得：其中一个或多个所选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等人,mol.cell.probes8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cdna和由基因编码的mrna可互换使用。术语“基因”意为参与产生多肽链的dna区段。它可以包括编码区之前和之后的区域(前导序列(leader)和尾随序列(trailer))，以及单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，结合至氢的α-碳、羧基、氨基和r基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指如下化合物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能。本领域中有多种已知的方法允许以位点特异性方式将非天然氨基酸衍生物或类似物并入多肽链中，参见，例如，wo02/086075。在本文中氨基酸可以通过普遍已知的三字母符号或通过由iupac-iub生物化学命名委员会(iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission)推荐的单字母符号表示。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码表示。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可交换用于指氨基酸残基的聚合物。所有3个术语适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖包括全长蛋白在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本文使用的术语“有效量”或“有效数量”是指施用的物质产生治疗效果的量或数量。效果包括预防、校正或抑制疾病或病况的症状的进展和相关并发症进展至任何可检测的程度。确切的量将取决于治疗剂的性质、施用方式和治疗目的，并且是本领域技术人员使用已知技术可确定的(参见，例如，lieberman,pharmaceuticaldosageforms(第1-3卷,1992)；lloyd,theart,scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding(1999)；和pickar,dosagecalculations(1999))。“表达盒”为重组或合成产生的核酸构建体，具有允许特定的多核苷酸序列在宿主细胞转录的一系列特定核酸元件。表达盒可以为质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包含与启动子可操作连接的待转录的多核苷酸。“抗体”是指基本上由一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其特异性结合和识别抗原(例如，smad3蛋白)的片段编码的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和mu恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、mu、α、δ或ε，其继而分别限定了免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50-70kd)。每条链的n-端限定主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(vl)和可变重链(vh)分别是指这些轻链和重链。抗体可以以各种形式存在，例如，作为完整的免疫球蛋白或作为通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下消化抗体以产生f(ab)'2(fab的二聚体)，其本身为通过二硫键与vh-ch1连接的轻链。在温和条件下，f(ab)'2可以被还原以打断铰链区中的二硫键，从而将f(ab)'2二聚体转变为fab'单体。fab'单体基本上为具有部分铰链区的fab(参见，paul(编辑)fundamentalimmunology,thirdedition,ravenpress,ny(1993))。尽管根据完整抗体的消化限定了各种抗体片段，但本领域技术人员会理解，此类片段可以以化学方法或通过利用重组dna方法从头合成。通过重组技术对抗体进一步修饰也是本领域众所周知的。例如，嵌合抗体将来自一种动物的抗体的抗原结合区(可变区)与来自另一种动物的抗体的恒定区组合。通常，抗原结合区来源于非人动物，而恒定区来自人抗体。人恒定区的存在降低了抗体被人类接受者作为外来物排斥的可能性。另一方面，“人源化”抗体将甚至更小部分的非人抗体与人组分组合。通常，人源化抗体包含移植到人抗体的适当框架区上的非人抗体的高变区或互补决定区(cdr)。抗原结合位点可以是野生型或被一个或多个氨基酸取代修饰，例如被修饰以更接近地类似人免疫球蛋白。嵌合抗体和人源化抗体均使用本领域众所周知的重组技术制备(参见，例如，jones等人(1986)nature321:522-525)。因此，本文使用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段或使用重组dna方法从头合成的抗体(例如，单链fv、嵌合抗体或人源化抗体)。本文使用的术语“smad3-敲低”描述了这样的细胞，其已经被修饰，尤其是遗传修饰，因此与未修饰的亲本细胞相比，表现出抑制的smad3表达和/或活性。使用免疫效应细胞，如nk细胞以产生smad3-敲低细胞，包括经多次传代(例如，至少5、10或20或更多代仍保留低至无smad3表达或活性的特征的稳定细胞系。smad3或母体抗生物皮肤生长因子同源物3(mothersagainstdecapentaplegichomolog3)为由转化生长因子(tgf)-β和1型激活素受体激酶活化的细胞内信号转导和转录调节物。人smad3的氨基酸序列和相应的多核苷酸编码序列分别提供在genbank登录号aab80960和u68019中。smad3-敲低细胞为这样的细胞，其与对照细胞(未被修饰的亲本细胞)相比，其已经被修饰以使内源性smad3表达或活性水平降低至少25％、50％、75％、80％、90％或更多。在一些情况下，smad3-敲低细胞具有阻抑的smad3表达和/或活性水平，但保留可检测的残余表达/活性。在其它情况下，smad3-敲低细胞不具有可检测的smad3表达或活性。由于阻抑的smad3表达和活性，smad3敲低细胞对tgf-β信号传导具有抗性或较小反应性(在一些情况下，完全无反应性)，因此也被称为“tgf-β耐受的”。类似地，术语“e4bp4-或ifng-增强的细胞”是指这样的细胞，其已经被修饰，尤其是遗传修饰，以在mrna或蛋白水平具有e4bp4或ifng基因表达的增加，或在活性水平的增加。通常，与未被修饰的亲本细胞相比，增加水平至少为30％、50％、75％、80％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或更多。e4bp4和ifng编码序列的genbank登录号分别为u83148和v00543。如本文所用，术语“自然杀伤细胞”或“nk细胞”用于指先天免疫的一类细胞毒性淋巴细胞或效应细胞。人nk细胞的特征在于表达细胞表面抗原cd16和cd56，但没有泛(pan)t标志物cd3、t-细胞抗原受体(tcr)或表面免疫球蛋白(ig)b细胞受体。nk细胞具有检测并杀伤应激细胞(例如，被病毒感染的细胞或癌细胞)的独特能力：不依赖于抗体或主要组织相容性复合体(mhc)，nk细胞在通过“自我缺失(missingself)”或在此类细胞上改变的/减少的mhc而活化后，检测并杀伤受损细胞，如病毒感染的细胞或肿瘤细胞。发明详述i.引言癌症仍然是人类死亡的主要原因之一。然而，用细胞毒性药物进行的癌症治疗常常是无效的，并呈现具有严重的系统性副作用的高细胞毒性。越来越多的证据显示转化生长因子-β(tgf-β)在形成的癌中充当有效的肿瘤启动子。癌症来源的tgf-β通过在癌症微环境中组成型诱导上皮间质转化和肿瘤相关的血管生成，以及通过阻抑抗肿瘤免疫来驱动恶性进展。基于该信息，研究人员和制药公司已经开发了通过使用可溶的tgf-β受体ii、小分子alk5激酶抑制剂以及中和抗体靶向tgf-β受体的许多治疗方法。它们中的一些(包括sd-093、sd-208和sm16)已经在早期临床前研究中显示是有前景的。然而，tgf-β为基本的抗炎细胞因子，并且tgf-β受体水平上tgf-β的一般阻滞也是有问题的(由于存在引起自身免疫疾病的可能性)。因此，研究tgf-β信号传导的下游以鉴定与癌症进展相关的更具体的治疗靶标可以在临床上提供更好的抗癌治疗。本申请发明人的研究小组先前观察到在两种高度侵袭性癌症模型(包括肺癌(llc)和黑色素瘤(b16f10))中，smad3(tgf-β信号传导的关键下游介质)无效的小鼠免受癌症生长、侵袭、转移(例如，到淋巴结、肝、肺、胃和结肠组织)和死亡。这一发现表明宿主中smad3依赖的癌症微环境决定了癌症进展或退化。这也表明靶向癌症微环境(以及癌症)中的smad3可以提供更好的抗癌治疗。本申请通过使用基因工程化的tgf-β耐受的人nk-92细胞，即一系列smad3敲低人nk-92细胞(nk92-s3kd)提供了用于更有效的癌症治疗策略的新方法。这些细胞虽然具有显著降低的smad3活性，但表现出增强的杀癌活性。本申请通过大幅增强nk细胞的杀癌活性而提供了许多优于当前抗癌治疗的优势，并为癌症提供了更安全和更有效的免疫治疗手段。ii.一般重组技术公开了重组遗传学领域中的一般方法和技术的基础教科书包括sambrook和russell,molecularcloning,alaboratorymanual(第3版.2001)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1990)；和ausubel等人编辑,currentprotocolsinmolecularbiology(1994)。对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些为来源于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、来源于测序的核酸或来源于公开的dna序列的估计数。对于蛋白，大小以千道尔顿(kda)或氨基酸残基数目给出。由凝胶电泳、测序的蛋白、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白序列估算蛋白大小。如vandevanter等人,nucleicacidsres.12:6159-6168(1984)中所述，使用自动合成仪，例如，根据首次由beaucage&caruthers,tetrahedronlett.22:1859-1862(1981)所述的固相亚磷酰胺三酯法，可以化学合成不能商购获得的寡核苷酸。如pearson&reanier,j.chrom.255:137-149(1983)中所述，使用任何本领域公认的策略，例如，天然的丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换hplc进行寡核苷酸的纯化。目标基因、编码目标多肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列可以在克隆或亚克隆之后，使用例如wallace等人,gene16:21-26(1981)的对双链模板进行测序的链终止法进行验证。iii.smad3-敲低细胞本申请的发明人在先前的研究中显示smad3-tgfβ信号传导在肿瘤发生中起关键作用。因此，在癌症微环境中特定靶向smad3用于对其进行阻抑被认为是潜在有效的抗癌疗法。本公开提供了涉及使用工程化tgf-β耐受的人nk-92细胞系进行癌症治疗的新策略，其中内源性smad3表达及因此的活性被敲低，即被显著抑制或完全消除。用于靶向的smad3阻抑的人操作的合适细胞包括各种类型的免疫效应细胞，这包括所有的t细胞亚群、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞以及非免疫细胞(包括干细胞或成纤维细胞)。用于此类操作的合适的细胞可以为天然存在的细胞以及人工设计的或重组产生的细胞，例如，遗传修饰的细胞，如嵌合抗原受体(car)t细胞。可以通过基因操作合适的亲本细胞的基因组smad3序列来产生smad3-敲低细胞。诸如利用病毒载体或crispr系统的基于序列同源性的基因破坏方法的方法可以用于改变smad3基因组序列，例如，通过插入、缺失或取代，这可以在基因的编码区或非编码区(例如，启动子区或其它调控区)发生，并且可以导致完全去除smad3表达、降低smad2表达、或在mrna水平不改变表达但降低smad3蛋白活性。或者，可以通过将编码下述的外源性表达盒引入合适的亲本细胞中来产生smad3-敲低细胞：(1)可以在mrna水平干扰或抑制smad3基因表达的一个或多个多聚核苷酸序列；或(2)可以阻抑smad3蛋白活性的蛋白。例如，可以使用包含能够在mrna水平破坏smad3表达的sirna、微rna、微型rna(minirna)、lncrna或反义寡核苷酸中的至少一种编码序列的载体(如基于病毒基因组结构的病毒载体)。作为另一种可能性，载体可以向受体细胞中引入一个或多个编码序列，所述编码序列编码干扰smad3的生物活性并且因此充当smad3蛋白的抑制剂的蛋白产物。此类蛋白抑制剂的一些实例包括针对smad3的中和抗体、可以结合并使smad3蛋白失活的肽或smad3蛋白的显性负性突变体。上述外源序列中的任一种可以瞬时存在于受体细胞中，或者可以整合到受体细胞的基因组中，因此以永久方式存在。在将外源性多聚核苷酸序列引入亲本细胞后，可以针对阻抑的smad3表达和/或活性的证据筛选细胞。可以进行多种测定，包括多聚核苷酸检测测定(例如，pcr或rt-pcr)、免疫学测定(例如，蛋白质印迹)和smad3功能测定(例如，tgf-β刺激测定)，以鉴定表现出显著减少的或去除的smad3表达和/或活性的所需的转化子。理想地，与未修饰的亲本细胞相比，smad3表达和/或活性降低的水平为至少10％的降低；更优选地，降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或甚至更大，包括完全消除。另外，由于本申请的发明人首次阐明了smad3在人成熟nk细胞的e4bp4依赖的抗癌活性中的潜在抑制机制，包括鉴定人e4bp4(nfil3)基因组序列的3’utr上的smad3蛋白的结合位点以及鉴定人ifng基因组序列的启动子区中的e4bp4蛋白的结合位点，可以提供相同或相似抗癌效用的本发明的smad3敲低细胞的替代物是e4bp4-或ifng-增强的细胞，尤其是nk细胞和本节中命名的其它细胞类型。可以采用各种方法来实现增加的e4bp4或ifng表达和/或活性，例如通过引入e4bp4或ifng基因的额外拷贝(例如通过使用载体，如携带额外拷贝的病毒载体)或通过用细胞中e4bp4或ifng基因的外源性更有效的启动子替代内源性启动子。可以进行mrna和/或蛋白水平的测定以确认细胞中e4bp4或ifng表达和/或活性增加。iv.使用修饰的细胞的癌症疗法本申请还提供了包含优选呈有效数量(如适于以预定施用方案给药的数量)的smad3-敲低细胞的药物组合物或生理学组合物。此类药物组合物或生理学组合物通常包含一种或多种药学或生理学可接受的赋形剂或载体。本申请的药物组合物可以配制成适用于多种递送系统。用于本申请的合适制剂见于remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,philadelphia,pa,17thed.(1985)。对于药物递送方法的简要综述，参见langer,science249:1527-1533(1990)。可以通过各种途径，例如，通过全身或局部递送的注射来施用本申请的药物组合物。施用药物组合物的优选途径为皮下注射、肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射和瘤内注射。适当的剂量可以以单次日剂量施用或以适当的间隔，例如以每天一次、或者每周一次或两次、或者每月一次或两次呈现的分份剂量施用。细胞的剂量范围可以从低剂量(0.1-1.0x106个细胞/kg/剂量)至中等剂量(0.1-1x107个细胞/kg/剂量)以及至高剂量(0.1-1x108-9个细胞/kg/剂量)变化。单剂量至多剂量可以重复使用至少一个月至三个月、四个月、五个月、六个月或九个月，或至一年或多年，并且可以单独使用，或与其它抗癌疗法，如化疗、化疗或其它免疫疗法组合使用。为了有效治疗癌症患者，含有smad3-敲低细胞的药物组合物可以与已知为治疗癌症或缓解癌症症状提供益处的一种或多种另外的治疗剂同时施用。实施例下述实施例仅通过示例方式而非通过限制性方式被提供。本领域技术人员将容易地认识到可变化或修改以得到基本上相同或相似结果的多个非关键性参数。自然杀伤(nk)细胞为一线抗癌免疫。然而，其被癌症来源的免疫抑制细胞因子tgf-β1瘫痪。本申请的发明人最近发现针对癌症的nk细胞免疫在缺乏smad3(典型的tgf-β1信号传导的关键下游介质)的小鼠中大幅增强。在本公开中报道了基因工程化的稳定的smad3-敲低人nk细胞系nk-92-s3kd通过促进杀癌活性以及inf-γ、颗粒酶b和穿孔素的产生大幅增强其对人肝癌(hepg2)或黑色素瘤(a375)的两种异种移植小鼠模型的抗癌作用。在机理上，本申请的发明人鉴定了infg为成熟nk细胞中转录因子e4bp4的新的靶基因，其中tgf-β1阻抑nk细胞分化，并且经由smad3-e4bp4轴发挥功能。因此，使smad3沉默缺损(defect)tgf-β1对nk细胞的免疫抑制作用，因此恢复e4bp4依赖的inf-γ产生和nk细胞抗癌活性。总之，通过使smad3沉默已经成功开发了tgf-β1耐受的人自然杀伤细胞系用于有效的抗癌免疫治疗。smad3沉默的人nk细胞系可以代表作为临床上新型且有效的癌症免疫治疗。导言癌症仍然是世界上死亡的主要原因之一。临床上几十年来，包括手术、化疗和放疗在内的传统策略已经被用作癌症的主要治疗；然而，由于严重的副作用、抗药性、复发和转移，结果通常仍不令人满意的。事实上，癌细胞的异质性和多功能性较高，因此最终适应外部环境并导致原发性耐药和继发性耐药(1)。另外，使用细胞毒性药物进行系统抗癌治疗的严重副作用也是临床上的严重问题(2)。最近，靶向肿瘤微环境是针对癌症的新治疗方法，这是因为肿瘤生长、侵袭和转移很大程度上依赖于其基质条件(3)。事实上，基于细胞的免疫疗法(包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和自然杀伤(nk)细胞)已经在临床实践中显示出相当大的进展(4-6)。虽然来自nk细胞过继治疗的临床研究结果是令人鼓舞的(7-11)，但基于nk细胞的癌症免疫治疗最近被认为是针对实体瘤的有前景的治疗选择。数项研究显示瘤内nk细胞的数量与肿瘤进展呈负相关(12、13)。然而，由于实体瘤的微环境中免疫抑制细胞因子的分泌和活化配体的下调，基于nk细胞的治疗在实体瘤中的应用仍面临挑战(14、15)。越来越多的证据显示tgf-β1主要由癌细胞产生，并通过大大限制或瘫痪免疫细胞针对癌症的功能来促进癌症进展(16)。现在清楚的是，tgf-β1在肿瘤发生的进行性阶段充当有效的启动子以通过在肿瘤微环境中诱导上皮间质转化(emt)、肿瘤相关的血管生成以及阻抑抗癌免疫来引发恶性进展。此外，tgf-β信号传导可以经由下调干扰素反应性和cd16-介导的干扰素-γ(ifn-γ)的产生体外阻抑nk细胞的细胞溶解活性(17-19)。因此，用tgf-β中和抗体、反义寡核苷酸和tgf-β受体抑制剂靶向肿瘤微环境中的tgf-β信号传导是消除癌症的新策略(20-26)。然而，tgf-β信号传导的完全阻滞将由于其抗炎特征而引起自身免疫疾病，如通过小鼠模型中不良副作用的发展(包括系统性炎、心血管缺陷和自身免疫)所证实(27)。因此，鉴定tgf-β信号传导下游的精确和可用的治疗靶标将为抗癌治疗提供较好的临床结果。最近显示smad3(tgf-β信号传导的下游介质(28))对于肿瘤微环境促进小鼠中肿瘤生长、侵袭和转移而言是必不可少的。smad3的基因缺失或药理学抑制通过增强肿瘤微环境中nk细胞杀癌活性和nk细胞的产生而显著阻止肺癌和黑色素瘤的致命进展(29)。这些发现表明smad3是消除肿瘤微环境中tgf-β-介导的免疫抑制的新治疗靶标。因此，目前的工作旨在经由开发nk细胞特异性smad3靶向的治疗将我们的研究发现转化为临床应用。如本文所公开，本申请的发明人基因工程化改造了稳定的smad3-敲低人nk细胞系(nk-92-s3kd)。与nk-92-s3kd的亲本细胞系相比，用nk-92-s3kd进行的处理对具有人肝癌(hepg2)或黑色素瘤(a375)的nod/scid小鼠产生更好的体内抗癌效果。机理研究揭露smad3的敲低经由阻断tgf-β1/smad3/e4bp4抑制轴来增强成熟的人nk细胞的杀癌活性。由于亲本细胞系nk-92已经加入到临床试验中，这种新的nk92-s3kd将在临床上进一步提高基于nk细胞的免疫治疗的抗癌效率。结果smad3的敲低大幅增强人nk细胞系nk-92的体外杀癌活性。为了检测smad3在nk细胞抗癌活性中的功能作用，本申请的发明人通过用含有特异性针对人smad3mrna的shrna(shrna-hsmad3)的慢病毒转导nk-92细胞而首次开发了稳定的smad3-敲低的人nk细胞系(图9)。实时pcr显示shrna-hsmad3转导大幅下调nk-92细胞中smad3的mrna表达(图1a)，这通过蛋白质印迹分析被进一步确认，其中检测到smad3蛋白减少超过70％(图1b)。在克隆选择的shrna-hsmad3转导的nk-92细胞中smad3的降低维持超过六个月，成功开发了稳定的smad3-敲低nk-92细胞系(nk-92-s3kd)。然后，通过ldh释放测定体外检测nk-92-s3kd针对人肝癌和黑色素瘤细胞的抗癌作用。如图1c和图1d所示，smad3的敲低很大程度上改善nk-92细胞的杀癌活性。为模拟具有高tgf-β1条件的肿瘤微环境，将5ng/ml剂量的tgf-β1添加至培养物中。如所预期的，在不同e/t比率下，tgf-β1的添加显著抑制nk-92-ev细胞(空载体对照)对hepg2和a375细胞的杀癌能力。值得注意的是，在高tgf-β1条件下，smad3的稳定敲低显著增强了nk-92-s3kd细胞的细胞毒性(图1c和图1d)。此外，实时pcr和elisa还显示，当与nk-92-ev细胞相比时，tgf-β1介导的抗癌细胞因子(即ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素)的阻抑在nk-92-s3kd中减弱(图2)。类似地，图4显示nk细胞中smad3阻抑对响应于tgf-β的gm-csf表达的作用：暴露于tgf-β1在mrna水平和蛋白水平均阻抑了gm-csf表达，这通过hk92-s3kd细胞中smad3的阻抑来阻止。这些结果明确地显示成熟的人nk细胞中smad3的稳定敲低能够减弱tgf-β1介导的免疫抑制，因此大幅增强nk-92-s3kd细胞的杀癌作用和抗癌细胞因子产生。然而，smad3的敲低不影响nk-92的增殖和分化，这是如通过mtt测定和nkg2d的表达(图10和图11)所确定的。用nk-92-s3kd治疗阻抑了具有人肝癌(hepg2)和黑色素瘤(a375)的小鼠中的癌症进展为了评估nk-92-s3kd的体内抗肿瘤作用，在宿主nk细胞缺陷的nod/scid小鼠中产生人肝癌(hepg2)和黑色素瘤(a375)的异种移植肿瘤模型。在皮下肿瘤接种后第7天，用盐水、nk-92-ev或nk-92-s3kd细胞(2×107个细胞/小鼠)以一周两次处理具有hepg2-或a375-肿瘤的小鼠，每隔一天进行il-2施用(200ng/小鼠)。用nk-92-ev细胞处理有效地抑制hepg2和a375肿瘤的生长(如通过肿瘤体积确定)，在接受nk-92-s3kd细胞的那些小鼠中进一步阻抑了肿瘤的生长(图4a和4e)。类似地，用nk-92-ev处理在第35天显著降低hepg2和a375肿瘤的大小和重量，其在nk-92-s3kd处理组中进一步被降低(图4b-d和图4f-g)。与体外发现一致，如图5所示，与盐水-以及空载体-对照相比，用nk-92-s3kd细胞处理大大增加了具有hepg2-肿瘤的小鼠中ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素的瘤内和血清水平；明确地显示smad3的破坏大幅增强成熟nk细胞的体内抗癌活性。而且，用nk-92-ev或nk-92-s3kd处理不会对肾脏、心脏和肝脏引起不良副作用，因为与盐水对照相比，在第28天，在这两种处理的小鼠中未检测到肌酸酐、乳酸脱氢酶(ldh)、丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)的血清水平的显著变化(图12)。因此，nk-92-s3kd可以代表作为针对癌症的新的、安全的和有效的抗癌免疫治疗。靶向smad3增强成熟nk细胞中e4bp4依赖的杀癌活性接下来检测通过smad3的破坏促进成熟的人nk细胞的抗癌活性的潜在机制。最近显示tgf-β1可以经由smad3/e4bp4-依赖的机制(29)阻抑鼠nk细胞的分化，但其在成熟nk细胞中的潜在作用是未知的。在本研究中，进一步检测tgf-β1/smad3/e4bp4轴在成熟nk细胞活性中的调控作用。如图6(a和b)所示，实时pcr和蛋白质印迹检测到tgf-β1(5ng/ml)的添加能够以剂量依赖的方式诱导smad3的磷酸化和e4bp4mrna表达的抑制。在高tgf-β1条件下，用smad3抑制剂(sis3)(30)或病毒介导的敲低(smad3-kd)阻滞smad3导致nk-92细胞中e4bp4mrna和蛋白表达以及ifn-γ产生的显著增加(图6d-f)。这些发现显示tgf-β1/smad3/e4bp4轴在成熟nk细胞活性中起重要作用。ifng为成熟的人nk细胞中smad3调控的e4bp4靶基因在nk细胞分化中首次发现转录因子e4bp4(31)，然而，其在成熟nk细胞中的作用和调控机制仍然在很大程度上未被探索。在本研究中，通过鉴定smad3蛋白在人e4bp4(nfil3)基因组序列的3’utr上的结合位点，进一步阐明smad3在人成熟nk细胞的e4bp4依赖的抗癌活性中的潜在抑制机制(图7a)。事实上，chip和荧光素酶报告子测定揭示了tgf-β1促进smad3蛋白在e4bp4基因的3’utr上的物理结合，因此抑制e4bp4的转录(图7b和7c)。更重要的是，通过ecr浏览器在人ifng基因组序列的启动子区上进一步预测e4bp4蛋白的结合位点(32)(图7d)。有趣的是，如图7e所示，tgf-β1很大程度上阻抑ifng启动子上e4bp4蛋白的结合。因此，tgf-β1通过经由tgf-β1/smad3/e4bp4抑制轴减少e4bp4蛋白的可用性而能够抑制ifng的启动子活性，从而阻断nk-92细胞中ifng基因的转录(图7e和7f)。双荧光素酶报告子测定显示smad3或e4bp4结合位点的突变分别去除了其对e4bp4或ifng启动子活性的转录调控作用(图7c和7f)。这在体外进一步通过以下确认：使smad3沉默而以e4bp4依赖的方式显著增加nk-92细胞(nk-92-s3kd)中e4bp4和ifn-γ的mrna和蛋白质表达水平，如在双重smad3和e4bp4敲低nk细胞(nk-92-s3/e4kd)中所确认的(图8)。因此，这些发现明确显示成熟nk细胞中smad3/e4bp4/ifng轴的直接调控机制。因此，在肿瘤微环境中，在tgf-β1介导的免疫抑制下，靶向smad3恢复了人成熟nk细胞的ifn-γ产生。讨论靶向肿瘤微环境是消除癌症的新策略。越来越多的证据显示与基于t细胞的过继免疫治疗的局限性(35)相比，基于nk细胞的先天免疫治疗由于其独特的特征(例如抗原非依赖的、非mhc限制的、无先前免疫需要和诱导gvhd的可能性较低)而更容易获得(33、34)。然而，使用基于nk细胞的过继细胞疗法的临床试验的结果并不一致(36、37)。在本研究中，本申请的发明人通过靶向smad3显著改善了登记的人nk细胞系nk-92(nk-92-s3kd)的临床试验的杀癌作用。这些发现显示smad3敲低大幅增强nk细胞的体内抗癌作用，而没有显著的副作用。在机理上，smad3的消耗避免了tgf-β1对成熟nk细胞中e4bp4-ifng轴的抑制作用，从而促进了肿瘤微环境中的抗癌细胞因子的产生。因此，本工作开发了克服tgf-β1介导的免疫抑制的新策略，其可以代表作为临床上针对癌症有效的smad3靶向的免疫治疗。最近，研究人员进行了许多尝试以增强基于nk细胞的免疫治疗的抗癌作用。nagashima和imamura证明稳定的il-2和il-15表达分别增加nk细胞免疫治疗的抗癌反应(38、39)。增强nk细胞介导的细胞毒性的其它策略包括过表达nk活化的受体nkg2d、下调nk抑制性受体nkg2a和将高亲和力cd16(ha-cd16)基因递送到nk细胞(40-42)。somanshi等人关注于经由基因递送ccr7加强nk细胞的迁移能力(43)。此外，一些研究人员关注于经由转导靶向各种肿瘤抗原(如cd19、cd20、her2/neu、erbb2、cea、gpa7、epcam)的嵌合抗原受体(car)来改善nk细胞的肿瘤识别和活化的能力(44-50)。不幸的是，所有这些工作不能阻止以下事实：癌细胞来源的tgf-β1可以在多个方面大幅阻抑nk细胞的抗癌作用，这包括增殖、成熟、细胞因子产生以及受体活化(51-53)。因此，修饰的nk细胞在富含tgf-β1的肿瘤微环境中仍为瘫痪的。越来越多的证据表明tgf-β1抑制nk细胞中的ifn-γ产生，尽管潜在的机制仍然在很大程度上未被探索。据报道，tgf-β1通过作为转录抑制子直接结合ifng的启动子区或间接阻抑t-bet，经由smad3依赖的信号传导来调控ifn-γ表达(54、55)。更重要的是，目前的工作揭示了通过转录阻抑e4bp4(nk细胞发育的主要转录因子)进行tgf-β/smad3-介导的ifn-γ阻抑的新机制(56)。在目前的工作中，本申请的发明人还鉴定了tgf-β1-介导的nk细胞阻抑的新型smad3/e4bp4/ifng抑制轴。因此，通过使nk细胞上tgf-β/smad3信号传导途径失活来靶向该抑制轴可以代表临床上针对癌症的新型且有效的免疫治疗。目前，仅一项研究表明tgf-β耐受的nk细胞系的发展(57)，其中经由基因过表达显性负性tgf-β受体ii，tgf-β信号传导途径在nk-92细胞中被特异性阻断。在具有calu-1细胞的裸鼠上证明了该tgf-β不敏感细胞系的增强的抗癌活性。然而，非典范途径在nk细胞活性中的作用在很大程度上是未知的；在受体水平任意阻断tgf-β也可能在nk细胞上引起不利的免疫应答。已知从smad3缺陷型小鼠分离的t细胞耐受tgf-β1抑制(58)。相反，smad3的过表达增加nk细胞中对tgf-β的抑制作用的敏感性(19、54)。因此，通过靶向smad3开发这种新的tgf-β1耐受的nk细胞系可以为癌症提供更特异的且有效的免疫治疗，具有许多优于靶向tgf-β受体水平的优势。本文中，基于数个原因选择用于基因操作的临床试验登记的nk细胞系nk-92。首先，与原代nk细胞相比，nk-92细胞系对于大规模扩增和质量控制更为实用。第二，nk-92细胞由于缺乏抑制性kir而诱导较少的kir-mhci依赖的抑制。第三，该细胞系中免疫原性的缺乏导致被接受者的免疫系统排斥的机会较少(59)。此外，作为临床试验中广泛测试的过继效应细胞，nk-92细胞的安全性可以在某些程度上被保证(60、61)。遗传修饰已经被广泛用作改善t细胞的抗癌作用的有前景的策略(62、63)。然而，由于基因转移的技术挑战，已经在nk细胞中进行了有限的基因操作(64)。用慢病毒转导的nk细胞系中基因递送的不稳定效率范围为2-97％，在一些情况下，可能需要多轮病毒转导(50、65)。为了稳定下调nk-92细胞中的smad3表达，将重组慢病毒用于目前研究中。用重组慢病毒将靶向smad3mrna的shrna成功递送至nk-92细胞中，最终将编码smad3shrna的序列整合到宿主基因组中。在nk-92细胞(nk-92-s3kd)中，smad3蛋白的表达被稳定敲低，这表现出对tgf-β1的耐受性特性和增强的体外和体内抗癌作用。对于临床应用的潜在可行性，必须考虑临床背景中使用慢病毒载体的安全性。迄今为止，已经批准了至少40个使用慢病毒载体的临床试验。gerardj.mcgarrity等人追踪了263例慢病毒诱导的细胞的输注以评估慢病毒载体的安全性，部分对象已经被随访8年以上，在随访期间未观察到显著的不良事件(66)。在本研究中，在接受nk-92-s3kd细胞的具有肿瘤的小鼠中未检测到明显的器官损伤。在过继免疫治疗方面，新开发的nk-92-s3kd细胞系可以促进未来的临床应用。为了使来自荷瘤小鼠的免疫系统的影响最小化，本研究中采用nk细胞和t细胞缺陷的nod/scid小鼠。然而，在该异种移植模型中，nk-92-s3kd细胞的抗癌作用可能被低估。事实上，这些数据显示smad3的破坏显著增强ifn-γ的产生，ifn-γ的抗癌作用至少部分取决于巨噬细胞(67)和细胞毒性t细胞(68)的活化。不幸的是，t细胞的不存在和巨噬细胞的缺乏是nod/scid小鼠的独特特征(69、70)。因此，在应用于临床试验之前，使用人源化小鼠肿瘤模型进一步验证nk-92-s3kd细胞的抗癌作用可能是必要的。总之，这是经由基因靶向smad3以产生tgf-β耐受的nk-92细胞系的首个工作。在小鼠中明确证明在该nk-92-s3kd细胞系中增强的抗癌活性。在成熟的人nk细胞中还鉴定了新的tgf-β1介导的smad3/e4bp4/ifng抑制轴。该新的tgf-β耐受的nk-92细胞系可以代表临床上针对癌症的有前景的免疫治疗。材料和方法抗体、细胞系和小鼠本研究中使用的抗体列于表1中。人nk-92细胞系、人a375细胞系和293t细胞系获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。人hepg2-luc细胞系保存在本发明人的实验室中。nod/scid(nod.cb17-prkdcscid/j)(6-8周龄)小鼠购自jakson实验室(库存编号：001303)，关在微隔离笼中的无病原体设施中，并喂食高压灭菌的食物和水。细胞培养在37℃下，于5％co2中，将nk-92细胞在补充有12.5％胎牛血清(lifetechnologies)、12.5％马血清(rockland)、50μmol/lβ-巯基乙醇、0.2mmol/l肌醇、0.02mmol/l叶酸和20ng/ml人ril-2(lifetechnologies)的memα培养基(lifetechnologies)中培养。在37℃下，于5％co2中，将hepg2-luc细胞和a375细胞在补充有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的dmem/f12培养基(lifetechnologies)中培养。在37℃下，于5％co2中，将293t细胞保持在补充有10％胎牛血清的dmem-高葡萄糖培养基(lifetechnologies)中。重组质粒plvx-shrna1-puro-hsmad3的构建在本实验中，将载体plvx-shrna1-puro(biowittechnologies)(图9a)用作质粒骨架。该慢病毒载体允许目标基因和嘌呤霉素抗性基因的表达。编码特异性靶向人smad3mrna的shrna的cdna序列列于表3中。然后，将片段克隆至骨架的bamhⅰ/ecorⅰ限制性位点，用于重组质粒plvx-shrna1-puro-hsmad3的构建。通过用xhoⅰ进行限制酶消化和dna测序来鉴定插入的dna片段的准确性。重组慢病毒颗粒rlv-hsmad3的产生按照制造商的慢病毒包装试剂盒(biowittechnologies)的说明，将重组质粒plvx-shrna1-puro-hsmad3递送到包装细胞293t中以产生重组慢病毒颗粒(rlv-hsmad3)。在转染后48小时收获病毒上清液，并测定慢病毒颗粒的滴度。然后，将产生的慢病毒颗粒保存在-80℃用于进一步使用。用rlv-hsmad3对nk-92细胞中的smad3的基因操作用rlv-hsmad3转导nk-92细胞，并用嘌呤霉素(invivogen)对其进行选择。简言之，将nk-92细胞以1×106个/ml的密度接种在24孔板中，并与终浓度为5ug/ml的聚凝胺(ploybrene)(santacruz)和rlv-hsmad3在moi(感染复数)等于50时混合，于37℃过夜。然后，将转导的细胞在完全培养基中扩增，并用终浓度为2ug/ml的嘌呤霉素对其进行选择。分别通过用相应引物(表2)的实时pcr和用兔抗人smad3抗体(abcam)的蛋白质印迹分析测定嘌呤霉素抗性克隆中smad3的表达水平。细胞毒性测定用4小时-乳酸脱氢酶(ldh)释放细胞毒性测定(cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay,promega)来测定nk-92细胞介导的细胞毒性。分别以5:1、10:1和20:1的不同效应子/靶标(e/t)比率测量针对人肝细胞癌细胞(hepg2)和恶性黑色素瘤细胞(a375)的细胞毒性。简言之，将靶细胞以1×104个细胞/孔接种在96孔板中。将用5ng/mltgf-β(r&dsystems)预处理24小时或不用其进行预处理的效应细胞(包括nk-92-s3kd和nk-92-ev细胞)与靶细胞在指定的e/t比率下在37℃于5％co2中共培养4小时。通过在490nm波长的吸光度测定共培养上清液中的ldh释放，其与溶解的肿瘤细胞数量成比例。用下式评价细胞毒性：％细胞毒性＝(实验的细胞毒性–效应子自发的细胞毒性–靶标自发的细胞毒性)/(靶标最大的细胞毒性–靶标自发的细胞毒性)×100。实时rt-pcr根据制造商的说明，使用purelinktmrna微型试剂盒(lifetechnologies)，从细胞中分离总rna。用c1000热循环仪进行逆转录反应。然后，用40ul无核糖核酸酶(rnase)的水稀释cdna，并将其用作实时聚合酶链式反应中的模板。使用的相关引物组列于表2。酶联免疫吸附测定(elisa)为测量细胞培养物上清液、肿瘤组织和小鼠血清中的细胞因子水平，使用用于检测人ifn-γ(biolegend)、颗粒酶b(mabtech)和穿孔素(abcam)的elisa商业试剂盒。简言之，在存在或不存在tgf-β1下，将nk-92-ev和nk-92-s3kd细胞(1×106/ml)在6孔板中培养12小时，并收集上清液用于elisa。为了制备肿瘤组织样品，在肿瘤组织样品中以100mg组织/毫升的比率添加冷冻的pbs。然后，将混合物均化。通过在4℃以14,000rpm离心10分钟，收集肿瘤组织液用于elisa。为了制备血清样品，在指定日期处死荷瘤小鼠，并经由在4℃以3000rpm离心血液15min收集小鼠血清。mtt测定将nk-92-ev细胞或nk-92-s3kd细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，并用tgf-β1处理44小时。随后，以0.5mg/ml的终浓度添加mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，invitrogen)，并在37℃孵育4小时。在清理孔中的培养基后，添加dmso以使甲臜溶解。使用读板分光光度计通过在波长为490nm的吸光度记录代表细胞活力的甲臜的量。异种移植肿瘤模型中nk-92细胞的过继转移由香港中文大学动物实验伦理委员会(议定编号13/049/grf)批准动物实验。所有处理和实验程序按照实验动物指南进行。用5×106个hepg2-luc细胞或a375细胞对小鼠进行皮下接种。肿瘤接种后7天，当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠随机分成3组。在肿瘤细胞接种后第7、10、14、17、21、24、28和31天，将盐水、2×107个nk-92-ev细胞或相同数量的nk-92-s3kd细胞静脉内注射到小鼠中。所有小鼠每隔一天经由腹膜内注射接受rhil-2(200ng/小鼠)。每四天测量一次肿瘤大小，并用下式体积(v)＝宽度(w)×长度(l)×高度(h)×π/6来计算体积。在肿瘤接种后第35天，在具有hepg2-luc的小鼠上进行体内成像系统(ivis)分析。在第35天处死小鼠并对肿瘤进行称重。收集肿瘤组织和小鼠血清用于进一步研究。小鼠血清中肌酸酐、乳酸脱氢酶(ldh)、丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)水平的测量商业试剂盒，其包括购自stanbio实验室的stanbio-creatininetest(endpoint)、alt/sgpttest(rate)和ast/sgottest(rate)分别用于肌酸酐、alt和ast的测量。用于ldh检测的quantichromtm乳酸脱氢酶试剂盒(dldh-100)购自bioassay。按照制造商提供的说明进行所有程序。免疫荧光在肿瘤接种后第35天杀死具有hepg2的小鼠，并收集肿瘤组织用于免疫荧光染色。通过fitc缀合的抗人cd56抗体来鉴定浸润在肿瘤部位的nk-92细胞。用dapi复染细胞核。结果表示为总dapi阳性细胞中cd56阳性细胞的平均比例。用sis3抑制smad3为了显示smad3和e4bp4在nk-92细胞中的ifn-γ产生中的调控作用，在本研究中使用被称为sis3(sigma)的特异性smad3抑制剂。简言之，用不同浓度的sis3预处理nk-92细胞2小时。然后，用终浓度为5ng/ml的tgf-β1处理该细胞45min并收获，用于使用蛋白质印迹来检测smad3的磷酸化水平。将诱导smad3最大磷酸化抑制作用的sis3的剂量确定为用于进一步实验的sis3的最佳剂量。然后用确定浓度的sis3预处理nk-92细胞2小时或不用其预处理nk-92细胞，然后以终浓度为5ng/ml的tgf-β1刺激12小时。收获该细胞以检测e4bp4和ifn-γ的水平。敲低nk-92-s3kd细胞中的e4bp4类似于在nk-92细胞中基因敲低smad3，在nk-92-s3kd细胞中敲低e4bp4。简言之，用表达靶向人e4bp4的shrna的重组慢病毒转导nk-92-s3kd细胞。重组质粒构建中所用的骨架为plvx-shrna2-neo(图13a)。编码shrna-e4bp4的cdna序列列于表3。将g418(geneticin)用于阳性克隆选择。然后，扩增选择的菌落，并用实时rt-pcr和蛋白质印迹分析e4bp4表达水平。染色质免疫沉淀(chip)测定为了检测蛋白质与dna特定区域的物理结合，用酶促染色质ip试剂盒(cellsignaling)进行染色质免疫沉淀测定(chip测定)。将2×107个nk-92细胞用tgf-β1处理1小时或不用其处理，用于smad3/e4bp4chip测定，或者，用tgf-β1处理12小时或不用其处理，用于e4bp4/ifngchip测定。按照制造商的说明，进行chip测定。chip测定中所用的兔抗人抗体列于表1。基于ecr浏览器数据库提供的预测的结合位点设计引物组，并将其列于表2。双荧光素酶报告子测定为了评价物理的蛋白质-dna结合是否能够诱导可测量的调控作用，进行双荧光素酶报告子测定。简言之，对于smad3/e4bp4报告子测定，扩增人smad3的cds(编码序列)区，并克隆至pcdna3.1+载体中以构建表达smad3的质粒pcdna3.1+smad3。然后，用psi-check2构建表达e4bp43’utr的报告子质粒。此外，对预测的结合位点tatctgact进行突变，并获得表达e4bp43’utr的突变体的质粒。类似地，对于e4bp4/ifng报告子测定，将人e4bp4的cds区克隆至pcdna3.1+中。将ifng启动子克隆至载体pgl-3basic中。在ifng启动子的预测的结合位点gattacgtattt内进行突变。表2中列出了突变实验中所用的引物组。随后，将这些重组质粒以各种组合递送到293t细胞中。根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告子测定系统(e1910)，测量荧光素酶活性。统计分析使用graphpadprism5.0软件(prism5.0graphpadsoftware,sandiego,ca)通过单向anova、双向anova或t检验进行统计分析。本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物，包括genbank登录号出于所有目的通过引用整体并入本文。表1本研究中使用的抗体表2引物序列表3shrna的序列靶基因shrna序列(5’-3’)hsmad3ggagaaatggtgcgagaaghe4bp4ttagatgtcatgtcaataggtgagg参考文献1.calafgm,ze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