一种月见草叶多糖及其制备方法与流程

本发明属于农副产品综合加工利用及植物活性成分技术领域，具体涉及一种月见草叶多糖及其制备方法。

背景技术：

月见草(oenotherabiennisl.)又名山芝麻、夜来香，原产自南北美洲，为柳叶菜科二年生的草本植物。我国已知月见草种类有二十多种，主要分布于贵州、华北、东北等地。月见草中含有类黄酮、酚类、多糖、脂质等活性成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等多种功能活性。目前对于月见草的开发利用主要集中在月见草(籽)油，而对其茎叶几乎全部废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

植物多糖具有促进免疫，抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗辐射、抗氧化等多种生理活性。植物多糖的传统提取方法为热水浸提，而该法耗时长、温度高、产率低。因此近年来超声波、微波、超高压提取等高新技术已成为活性物质提取领域的研究热点。微波具有选择性强、提取效率高等优点，但提取时间不宜过长，功率不宜过高，否则会使多糖溶出受阻。超高压可实现常温提取，对提取物质活性影响较小，但设备成本高，目前仍难以实现工业化大规模生产。超声波可通过空穴作用破坏植物细胞壁，并产生质量传递，不仅可以提高提取效率，而且可提高多糖的生物活性。因此，超声辅助提取技术近年来在活性物质提取中得到了较广泛的应用。

目前对于月见草多糖的研究较少，仅个别学者对月见草多糖的抑制肿瘤作用进行了初步研究，而对月见草叶多糖的研究则鲜见报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于针对上述问题，提供一种由月见草叶制备的植物多糖。

本发明的目的之二在于提供一种超声辅助热水浸提，并结合deae-52纤维素柱层析纯化等工艺制备月见草叶多糖的方法。

.一种月见草叶多糖，其特征在于：多糖纯度为80％～90％，糖醛酸含量2％～8％，不含蛋白、核酸、淀粉及酚类物质，主要组分平均分子量为5000～6000da的非单一组分的月见草叶多糖。

本发明所述月见草叶多糖的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)原料预处理：清洗月见草鲜叶，干燥，粉碎，加入石油醚脱脂；

(2)提取：将脱脂后粉末加水超声提取，离心，收集上清液；

(3)醇沉：将步骤(2)所得上清液真空浓缩，乙醇醇沉除去水溶性杂质，并依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤去除小分子杂质得月见草叶粗多糖；

(4)脱蛋白：采用sevage法对步骤(3)所得月见草叶粗多糖进行处理，进一步脱除蛋白类杂质，浓缩，再次醇沉；

(5)纯化：采用deae-52纤维柱层析技术对步骤(4)所得醇沉后样品溶液进行进一步分离纯化；

(6)透析、干燥：收集步骤(5)纯化后洗脱液进行透析12～36h，浓缩透析液，冻干，得月见草叶多糖。

进一步地，所述步骤(1)中，月见草叶在45～50℃温度下烘干48～72h后粉碎，过40目筛，向月见草叶粉末中加入石油醚，回流脱脂6h，备用；所述石油醚用量按每克月见草叶粉末计为3～4ml。

进一步地，在所述步骤(2)中超声功率为240～400w，液料比为10～30ml/g，超声时间为10～50min，超声温度为35～75℃。

进一步地，所述步骤(3)中根据液体量真空浓缩(采用浓缩罐或旋转蒸发仪)，向浓缩液中加入一定浓度乙醇至混合液乙醇终体积分数为80％，于4℃静置12～15h，离心(4000r/min，10min)，沉淀依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗脱，离心(4000r/min，10min)，得月见草叶粗多糖。

进一步地，所述步骤步骤(4)中采用sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，按照多糖溶液：sevage试剂为4：1(v/v)，对月见草叶粗多糖萃取3～5次，萃取过程可在萃取罐中充分搅拌或用分液漏斗充分震荡后，静置分离或离心分离。

进一步地，所述步骤(5)中，上样量为柱体积的1/10～1/12，控制洗脱流速1ml/min～1.5ml/min，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.3mol/l的nacl溶液洗脱，每2min～4min收集一管，并用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线，并收集单一峰洗脱液。

进一步地，所述步骤(6)中，采用膜截留分子量为3500da超滤装置或透析袋进行，浓缩后，真空冷冻干燥，可得月见草叶多糖。

本发明所用月见草(oenotherabiennisl.)叶，由吉林市圣基实业有限公司提供。

本发明具有如下优点及有益效果：

本发明提供了一种以农产品废弃物——月见草叶为原料，采用超声辅助热水浸提结合柱层析技术的月见草叶多糖的工艺方法，可制备得到一种新的植物活性多糖——月见草叶多糖。相对于传统提取方法，提取时间短、能耗低、成本低廉，产品纯度高。不仅为开发相关功能保健食品奠定了基础，而且实现了农产品废弃物资源化利用，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为实施例1中月见草叶粗多糖脱蛋白后紫外扫描结果。

图2为实施例1中月见草叶粗多糖脱蛋白后经deae-52纤维素柱层析洗脱曲线。

图3为实施例1所得月见草叶多糖傅里叶红外光谱扫描结果。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例1超声波法制备月见草叶多糖

本实例中超声波提取所用设备为kq-400kde高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

(1)原料预处理：月见草叶在50℃温度下烘干48h后粉碎，过40目筛，向月见草叶粉末中加入石油醚，回流脱脂6h，备用；所述石油醚用量按每克月见草叶粉末计为4ml。

(2)提取：取脱脂后粉末40.00g，超声功率400w，加一定量蒸馏水使其液料比23ml/g，超声时间36min，超声温度53℃，离心(4000r/min,10min)，收集上清液。

(3)醇沉：所述上清液浓缩至原溶液体积的1/4，加入体积分数95％乙醇使其乙醇体积分数为80％，于4℃静置12h，离心除去水溶性杂质后并依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤(依次4000r/min离心，10min)去除小分子杂质得月见草叶粗多糖。

(4)脱蛋白：采用sevage法(氯仿：正丁醇＝4:1)，多糖溶液：sevage试剂为4：1(v/v)，对上述月见草叶粗多糖溶液处理3次，浓缩溶液，再次醇沉。通过紫外扫描(扫描曲线见图1)，在260nm和280nm处无吸收峰，证明所得月见草叶多糖不含蛋白质、核酸杂质。

(5)纯化：将deae-52纤维素预处理后装柱平衡，上样量为柱体积的1/10，控制洗脱流速1ml/min，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.3mol/l的nacl溶液洗脱，每3min收集一管，并用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线(图2)，并收集单一峰洗脱液。

(6)透析、干燥：收集0.2mol/lnacl溶液洗脱后较大峰洗脱液，透析24h，浓缩透析液，冻干，得纯度为85.91％的月见草叶多糖。

实施例2月见草叶多糖傅里叶红外光谱扫描分析

取实施1中月见草叶多糖，进行傅里叶红外光谱扫描分析。采用kbr压片法。分别取烘干至恒重的kbr200mg、月见草叶多糖2mg，混合研磨、压片，置于红外光谱仪4000-400cm^-1波长下扫描。

月见草叶多糖傅里叶红外光谱图(图3)，3425cm^-1处出现的较宽而大的峰是糖分子内或分子间氢键o-h伸缩振动而引起的；2917cm^-1处的吸收峰为c-h振动吸收峰；1644cm^-1是糖醛酸c＝o的振动吸收峰，可能是羧基或羧酸盐；1403cm^-1处的吸收峰可能是由-cooh中c-o键伸缩振动或是c-h键的反对称伸缩振动和变角振动引起的；1154cm^-1和1104cm^-1处吸收峰可能是由c-o-c和c-o-h的伸缩振动引起的。表明其具有多糖特征吸收峰。

实施例3月见草叶多糖组分及分子量鉴定

取实施1中月见草叶多糖，用碘-碘化钾法鉴定是否含淀粉，fecl3法鉴定是否含酚类物质，硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量；并用高效液相色谱法测定多糖分子量，色谱柱条件：色谱柱tsk-gelg3000pw×1(300mm×7.8mm)，流动相为超纯水，柱温为40℃，流速为0.5ml/min，样品含量2mg/ml，进样量20μl。

结果表明，所得月见草叶多糖不含淀粉、酚类物质，糖醛酸含量5.11％。且纯化后月见草叶多糖仍不是单一多糖组分，其主要多糖组分平均分子量为5435da。

实施例4月见草叶多糖抗氧化活性测定

取实施1中月见草叶多糖，进行抗氧化活性试验。

总抗氧化力试验：取1ml不同浓度的样液，依次加入1ml0.6m硫酸溶液，1ml28mm磷酸钠溶液，1ml4mm钼酸铵溶液，在90℃条件下水浴90min，冷却至室温。在波长695nm处测量吸光度值。

abts自由基清除试验：取不同质量浓度的样液2ml，分别加入2ml配制好的abts试剂(调整abts试剂在734nm处读数为0.7±0.02)，混匀溶液，于黑暗条件下静置1h，在734nm处量吸光度。

式中：a1为2ml样液与2mlabts溶液吸光度；a2为2mlabts溶液与2ml蒸馏水吸光度。

结果表明，在多糖质量浓度为1～3mg/ml范围内，总抗氧化力和abts自由基的清除率随月见草叶多糖浓度增加而逐渐增加。在多糖质量浓度为3mg/ml，总抗氧化力与abts自由基的清除率分别为0.349(吸光度值)和94.44％，表明月见草叶多糖具有较好的抗氧化能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，并非对本发明的构思和范围进行限定。本领域中专业技术人员理解，在不脱离本发明思想的前提下可对其技术方案作出各种改变和修改，但都属于本发明的保护范围。