专利名称：一种富含脂肪酸的菌丝体的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种发酵法生产的富含脂肪酸的菌丝体，及其方法。
现有技术中的脂肪酸组合物，大多是来自于天然的动植物，经提炼而得；但某些脂肪酸，例如γ-亚麻酸，在传统的方法中是将月见草种子进行冷榨提取，其设备简单，投资少，操作便利，但所得油质量差，出油率低，并且月见草油含量不稳定，又受产地、气候的影响，且精炼成本高，不能满足社会的需求。
利用微生物发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体，尤其是富含γ-亚麻酸的菌丝体是近几年国内外开辟的新途径。
在部分细菌、真菌及微藻类的细胞中，含有较高量的脂肪酸，日本Onacls Cement公司生物研究所和东京农业大学生物技术工程系对新鲜海水中的蓝丝藻和小球藻进行光照培养均可获得含26.25％的总脂肪酸，其中含有约10％的γ-亚麻酸。
本发明的目的在于利用中国上海工业微生物研究所通过毛霉目下有关菌种筛选诱变获得的菌种，经发酵制备富含脂肪酸的菌丝体。此菌种是接合菌纲(Zygomycetes)毛霉目(Mucorales)被孢霉科(Mortierellaceae)被孢霉属(Mortierilla Coemans)的一种，分离自吉林安国，基物是革菌。该菌株具有以下优良的生产性能1、具有较高的菌株系数(消耗100克碳源时生成的菌体克数)和脂质系数(消耗100克碳源时生成的脂质的克数)。例如大罐生产时菌体系数和脂质系数分别为30和15，均得到很高的值。
2、适于高密度培养，菌体分离容易。
3、脂肪酸含量高，在菌丝体中含有大于等于30％的脂肪；所述的脂肪中γ-亚麻酸含量也高，通过合适的培养条件和合适的培养基，γ-亚麻酸在菌株的脂质中含量超过4-21％(而且月见草种子油中γ-亚麻酸含量为67％左右。)本发明提供的发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的具体工艺如下一、培养基配方土豆培养基(做斜面)土豆 20-30％琼脂 1.5-2％葡萄糖2-3％
2、种子培养基葡萄糖 6-8％尿素 0.5-1％(NH4)2 SO4 0.5-1％麦芽汁 0.1％酵母膏 0.05-0.1％KH2 PO4 0.1-0.2％MgSO40.04-0.08mg/L柠檬酸三钠 0.4-0.6％3、发酵培养基葡萄糖 8-10％KH2 PO4 0.2-0.3％NH4 NO3 0.2-0.3％MgSO40.03-0.05％酵母粉 0.03-0.05％Fe2+(FeSO4) 10-30mg/LCa(CaCL2)10-30mg/LCu(CuSO4)0.4-0.8％Zn(ZnSO4)1-3mgMn(MnCL2)1-3mg柠檬酸三钠 1.0-1.2％柠檬酸 0.3-0.6％制备所述的菌丝体的工艺流程见图11。
将在土豆培养基中经斜面培养的菌种AS.3410，从斜面转到种子瓶(内含种子培养基)，上摇床，28-30℃，24hr，摇床频率为45-50HZ；待种子瓶中生长旺盛时，以10％接种量接到50L一级种子罐(内装种子培养基)，28-30℃，搅拌通风，培养24hr，后转500L二级种子罐(内装种子培养基)，搅拌通风，培养24hr，温度为28-30℃；然后转到5吨发酵罐(内含发酵培养基)，28-30℃通风搅拌，培养72-96hr。上种子罐、发酵罐期间，每隔4hr取样检验，测定糖度、PH值、菌丝体湿重，并显微镜观察菌体生长情况，培养液保持PH3.7-4.1之间，待发酵液糖度降到1％左右，菌丝体湿重30％以上时，放罐，再进行离心分离，即得到γ-亚麻酸菌丝体，再用蒸馏水清洗菌丝体，然后用切片机切碎菌丝体，用真空低湿干燥器烘干，真空度0.1大气压左右，温度45-50℃，烘干时间4hr，得到含水量在5％以下的富含脂肪酸的菌丝体。
下面是
，通过附图及其后面的详细叙述，可以更好的理解本发明，具体如下附图1为亚麻酸甲脂标准红外光谱图；附图2为菌丝体分离、甲酯化产物的红外光谱图；附图3为菌丝体分离、甲酯化产物的紫外光谱图；附图4为亚麻酸甲脂标准H核磁共振图；附图5为菌丝体分离、甲酯化产物的H核磁共振图；附图6为γ-亚麻酸甲脂标准质谱图；附图7为菌丝体分离、甲酯化产物的质谱图；附图8为高分辩质谱图；附图9为菌丝体分离、甲酯化产物的气相色谱图；附图10为菌丝体分离、甲酯化产物的液相色谱图；将上述方法制得的菌丝体以其甲脂形式分离，并加以鉴定，分离方法如下
γ-亚麻酸甲脂分子式C19 H32 O2分子量292.2402结构式CH3(CH2)3(CH2 CH＝CH)3(CH2)4COCH3γ-亚麻酸甲脂的确证一、红外吸收光谱(1R)仪器型号Perkin-Elmer 983型红外光谱仪测试条件液膜法测定Resolution 3.0 Ordinate mode％TORD High 100.00，ORD LOW 10.00RANCE 4000-800.0 Abso.scale 0.50
红外光谱图如附图1、附图2附图1为亚麻酸甲脂标准红外光谱图，附图2为菌丝体分离、甲酯化产物的产物的红外光谱图。
菌丝体分离、甲酯化产物的的测定的数据吸收峰cm-1 振动类型 基团 吸引强度3009伸缩振动 C＝C64.002926伸缩振动 -CH2- 35.172855伸缩振动 CH3- 46.981742伸缩振动 -C-O-CH339.701459剪式振动 -CH2- 64.001434伸缩振动 C-O63.971362伸缩振动 C-O-C 71.941172面内弯曲振动 C＝C 60.901018面外弯曲振动 C＝C 76.03722弯曲振动 -CH2- 70.30解析结果由本发明所述的菌丝体经上述方法分离、甲酯化后的的产物中含CH3CH2CH＝CHC-O等基团，并与文献(J.Chem Soc2779(1961))报告的γ-亚麻酸甲脂的主要吸收峰3040，1735 720相符，与亚麻酸标准图谱相同。
结论本发明所述的菌丝体经上述方法分、甲酯化后的的产物为γ-亚麻酸甲脂前述的菌丝体分离、甲酯化产物的紫外吸收谱(UV)仪器型号Varion EMS-200型紫外分光光度计测试条件Ord Max/Min 1.000 0.000WL Max/Min nm 300.0 200.0Speed(nm/min)200 溶剂乙醇紫外光谱图如附图3附图3为本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体经上述方法分离、甲酯化后的的产物紫外光谱图。
测试结果λmax＝203.4nm是-C-OCH3的特征吸收峰解析γ-亚麻酸甲脂因无共轭体系，因此没有标准的UV图谱，本鉴定测定了其酯基吸收峰。
前述的富含脂肪酸的菌丝体分离、甲酯化产物的1H核磁共振谱(1HNMR)仪器型号Varion VXR-300MHz核磁共振仪测定条件TMS 内标 溶剂CDCl31H核磁共振图谱如附图4、5；附图4为亚麻酸甲脂标准1H核磁共振图；附图5为脂肪酸的菌丝体分离、甲酯化产物的1H核磁共振图。
测定数据序号化学位移ppm质子数 多重性相应质子a 0.894 3 三-CH3b 0.904-1.612 10多 C3、4、15、16、17-CH2-c 1.637-2.342 6 多 C2、5、140-CH2-C-，＝CH-CH2-d 2.805-2.820 4 多 C8、11＝CH-CH2-CH＝e 3.679 3 单 -OCH3f 5.337-5.373 6 多 -CH＝解析——本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体经过上述方法的分离、甲酯化后所得的产物内含有CH3-，-CH2-，CH＝CH，-CH＝CH-CH2-CH＝，C-OCH3；结论本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体经上述方法分离、甲酯化后的的产物与γ-亚麻酸甲酯文献报道数据(中草药.13(9)385(1982))相同(14)，与亚麻酸甲脂标准图谱相近。
前述的菌丝体分离、甲酯化产物的质谱(MS)仪器型号KyKy-ZHP-5质谱议测试条件分辨率7000加速电压6KV AEI MS 50质谱图如附图6、7、8；附图6为γ-亚麻酸甲脂标准质谱图；附图7为被测品质谱图；附图8为高分辩质谱图。
测定数据质荷比(m/e) 相对丰度 质荷比(m/e) 相对丰度292(M) 2.8579 2.64194 2.1167 61.1115 0 5.5855 67.66121 7.0641 61.76107 8.5528(基峰) 100.0093 14.45---------------------91 9.8081 46.82解析292 M.
41CH3-C＝CH229(基峰) CH3-CH2194 41+(CH2)n-1n＝118141+-CH2-CH＝CH-6741+-CH＝CH-5541+-CH2-结论本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体经上述方法分离、甲酯化后的的产物本化合物具有和γ-亚麻酸甲脂标准图谱相同的峰，经高分辨MS鉴定，其中有292.2400的峰值，与C19 H32 O2的计算值292.2402相同。
经上述解析可以确证本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体分离、甲酯化后的产物具有γ-亚麻酸甲脂结构，所测分离、甲酯化后的的产物内含有γ-亚麻酸。
分离、甲酯化后的的产物中除含有γ-亚麻酸外，还有亚油酸等不饱和脂肪酸、氨基酸、维生素等。
为了进一步确定本发明所述的菌丝体成分，下面通过一系例的手段来获得其他成分的名称和含量。
本发明所述的菌丝体中脂肪酸的测定(按GB9695.2-88)仪器气相色谱仪，积分仪试验方法将脂肪酸组合物用索氏抽提法提取出油脂，在三氯化硼存在下进行甘油脂的皂化和游离脂肪酸的甲酯化，然后进气相色谱仪(如附图9为样品2的图谱)，用面积归一化法测其组成；下面是4个样品的总油脂中各种脂肪酸的检测结果(％)名称 样品1(％) 样品2 样品3 样品414∶0(肉豆蔻酸) 1.7 1.8 1.9 1.816∶0(棕榈酸)26.9 26.1 2619.916∶1(棕榈烯酸) 3.4 3.1 3.0 2.118∶0(硬脂酸) 1.9 2.0 2.1 118∶1(油酸) 49 49.4 49.3 43.518∶2(亚油酸)12.4 12.1 12.3 12.118∶3(γ-亚麻酸) 4.2 4.9 519.0本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体中维生素E的测定(按GB12388-90)仪器高压液相色谱仪带紫外分光检测器试验方法样品中的VE经皂化提取处理后，将其不可皂化部分提取至有机溶剂中，用高效液相色谱法C18反相柱将VE分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。
附图10为分离产物的样品2的液相色谱图，下面分别是4个样品的检测结果。检测结果 样品5样品6样品7 样品8(mg/100g)维生素E含量69.2368.02 68.0 67.78本发明所述的脂肪酸组合物中氨基酸的测定仪器Beckman 6300氨基酸分析仪试验方法按照我国国家标准GB/T14965-94关于氨基酸的测定方法。
检测结果(mg/100g)名称 样品9 样品10样品11 样品12天门冬氨酸1350 1320 1330 1300苏氨酸500520 510550丝氨酸400500 440430谷氨酸2300 2100 2200 2300脯氨酸2450 2450 2500 2550甘氨酸4100 4200 4000 4300丙氨酸1800 1900 1800 1900缬氨酸850830 820800蛋氨酸310300 280340异亮氨酸 770760 710750亮氨酸1300 1200 1100 1000酪氨酸370350 310380苯丙氨酸 700650 660700组氨酸220250 270300赖氨酸1000 1000 9501050精氨酸1750 1700 1600 1600通过上述方法的试验研究，证实本发明所述的菌丝体中含有γ-亚麻酸、亚油酸等脂肪酸，维生素E、A，十六种氨基酸，微量元素，蛋白质等多种对人体有益的成份，以上结果由北京医科大学和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试认可。
由上可知，本发明提供的发酵法生产的富含脂肪酸的菌丝体通过皂化、甲醇化预处理，经紫外、红外、核磁共振及质谱分析鉴定，证明油中含有γ-亚麻酸，其结构为顺-6，9，12-十八碳三烯酸，分子式为C18H30O2，油中γ-亚麻酸含量约为14.5％。依照我国国家标准关于蛋白质、脂肪酸、氨基酸、维生素及微量元素的测定方法，测得菌丝体中除含有γ-亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸和十六种氨基酸外，还含有以下微量组分，所述的微量组分包括维生素E、A、铁、锌、钙、镁、硒等微量元素。
所述的干体脂肪酸组合物中其它成分的分布如下标准样品13 样品14样品15样品16总脂肪％ ＞3044.4 46.1 47.9 48.3亚麻酸％ ＞6 4.2 9.7 1913.7酸值 ＜4 1.6 1.50 1.4 --通过上述方法的试验研究，证实菌丝体中含有γ-亚麻酸、亚油酸，维生素E、A，十六种氨基酸，微量元素，蛋白质等多种对人体有益的成份，以上结果由北京医科大学和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试认可。
由上可知，本发明提供的发酵法生产的菌丝体通过皂化、甲醇化预处理，经紫外、红外、核磁共振及质谱分析鉴定，证明油中含有γ-亚麻酸，其结构为顺-6，9，12-十八碳三烯酸，分子式为C18H30O2，油中γ-亚麻酸含量为14.5％。依照我国国家标准关于蛋白质、脂肪酸、氨基酸、维生素及微量元素的测定方法，测得菌丝体中除含有γ-亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸外，还含有以下组分维生素E、A、铁、锌、钙、镁、硒等微量元素和十六种氨基酸。
上述方法制备的菌丝体有着广泛的用途，也可以用来作为进一部提纯单一脂肪酸的原料，本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体的一个成功的例子就是在配合了其它添加剂具有良好效果的保健品——三鸣养生王，该保健品与本案同时提出了专利申请。
权利要求
1.一种富含脂肪酸的菌丝体，其特征在于所述的菌丝体中含有大于等于约30-50％的脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的富含脂肪酸的菌丝体，其特征在于所述的脂肪酸包括约有1.7～1.9％的肉豆蔻酸；19.9～26.9％的棕榈酸；2.1～3.4％的棕榈烯酸；1～2.1％的硬脂酸；43.5～49.4的油酸；12.1～12.4的亚油酸；4.2～19的γ-亚麻酸。
3.根据权利要求1或2所述的富含脂肪酸的菌丝体，其特征在于所述的脂肪酸包括约有1.7～1.9％的肉豆蔻酸；19.9～26.9％的棕榈酸；2.1～3.4％的棕榈烯酸；1～2.1％的硬脂酸；43.5～49.4的油酸；12.1～12.4的亚油酸；6～19的γ-亚麻酸。
4.根据权利要求1所述的富含脂肪酸的菌丝体，其特征在于所述的脂肪酸的酸值小于等于4。
5.一种发酵法生产权利要求1所述的富含脂肪酸的菌丝体的方法，其特征在于通过毛霉目下有关菌种筛选诱变获得的产γ-亚麻酸的菌种，经土豆培养基(做斜面)培养，将在土豆培养基中经斜面培养的菌种从斜面转到种子瓶(内装种子培养基)，上摇床，25-35℃，24hr，摇床频率为45-50HZ；待种子瓶中生长旺盛时，以10％的接种量接到50L一级种子罐(内装种子培养基)，25-35℃，搅拌通风，培养24-48hr，后转到500L二级种子罐(内装种子培养液)，搅拌通风，培养24-48hr；然后转到5吨发酵罐(内装发酵培养基)，25-35℃，通风搅拌，培养72-96hr，上种子罐、发酵罐期间培养液保持PH值3.7-5.1之间，待发酵液糖度降到1％左右，菌丝体湿重30％以上时，放罐，并进行离心分离，即制得本发明所述的富含脂肪酸的菌丝体。
6.按权利要求5所述的发酵法生产组合物的方法，其特征在于制得的菌丝体用蒸馏水清洗，切碎，采用真空低温干燥器烘干，真空度0.1大气压，温度45℃-65℃，烘4hr，得到含水量在5％以下的本发明所述的菌丝体。
全文摘要
本发明涉及的是一种发酵法生产的富含脂肪酸的菌丝体及其生产方法，本发明所述的发酵法制备富含脂肪酸的菌丝体，其特征是采用被孢霉菌菌种进行培养发酵和生产，所述的菌丝体包括肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸；通过本发明所述的方法所得到的菌丝体，可以提取各种的脂肪酸，也可以将本发明所述的菌丝体直接用于保健品、饮料、或药物等中作为主成分或添加剂。
文档编号C12P7/64GK1157851SQ9511931
公开日1997年8月27日 申请日期1995年11月30日 优先权日1995年11月30日
发明者余善铭 申请人:北京三鸣生物工程有限公司