专利名称：用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基，特别是一种用于发酵法生产富含γ-亚麻酸的菌丝体的培养基。
现有技术中各种用于发酵的培养基配方很多，所采用的原料也是大同小异，但在某些特定的场合，采用一种具有独特配方的培养基，专门用于一种特定的工艺，将会起到使工艺发挥最大效果，并使工艺所得产物的成分含量稳定，有效成分显著增加，而本发明所述的培养基正是一种适合发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基，特别是本发明所述的菌丝体中富含γ-亚麻酸。
上述的γ-亚麻酸是一种高级多不饱合脂肪酸，是人体必需脂肪酸，是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成人体一系列前列腺素的前体，具有降血脂，抑制血小板聚集，血拴素A2合成抗脂质氧化，抑制溃疡及胃出血，增强胰岛素及减肥作用。
利用微生物发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体，尤其是富含r-亚麻酸的菌丝体是近几年国内外研究的和开辟的新途径。
γ-亚麻酸存在于某些细菌、真菌及微藻类的细胞中，其含量占总脂肪的6％-24％。
本发明的目的在于利用中国上海工业微生物研究所通过毛霉目下有关菌种筛选诱变获得的菌种，经发酵制备富含脂肪酸的菌丝体，在这种菌丝体中富含r-亚麻酸。此菌种是接合菌纲(Zygomycetes)毛霉目(Mucorales)被孢霉科(Mortierellaceae)被孢霉属(MortierillaCoemans)的一种，分离自吉林安国，基物是革菌。该菌株具有以下优良的生产性能1、具有较高的菌株系数和脂质系数。例如大罐生产时菌体系数和脂质系数分别为30和15，均得到很高的值。
2、适于高密度培养，菌体分离容易。
3、γ-亚麻酸含量高，通过合适的培养条件和本发明所述的培养基，能使所得到的菌丝体的脂肪含量大于30％，而r-亚麻酸在脂质中含量超过4-21％；本发明所述的专用于发酵法生产富含γ-亚麻酸的脂肪酸组合物的菌丝体的培养基配方如下1、土豆培养基(做斜面)土豆20-30％
琼脂 1.5-2％葡萄糖2-3％2、种子培养基葡萄糖6-8％尿素 0.5-1％(NH4)2SO4 0.5-1％麦芽汁0.1％酵母膏0.05-0.1％KH2PO40.1-0.2％MgSO4 0.04-0.08mg/L柠檬酸三钠0.4-0.6％3、发酵培养基葡萄糖8-10％KH2PO40.2-0.3％NH4NO30.2-0.3％MgSO4 0.03-0.05％酵母粉0.03-0.05％Fe2+(FeSO4) 10-30mg/LCa(CaCL2) 10-30mg/LCu(CuSO4) 0.4-0.8％Zn(ZnSO4) 1-3mg/LMn(MnCL2) 1-3mg/L柠檬酸三钠1.0-1.2％柠檬酸0.3-0.6％下面简述采用本发明所述的培养基制备菌丝体的工艺，其流程图见图5，将在土豆培养基中经斜面培养的菌种AS.3410，从斜面转到种子瓶(内含种子培养基)，上摇床，28-30℃，24hr，摇床频率为45-50HZ；待种子瓶中生长旺盛时，以10％接种量接到50L一级种子罐(内装种子培养基)，28-30℃，搅拌通风，培养24hr，后转500L二级种子罐(内装种子培养基)，搅拌通风，培养24hr，温度为28-30℃；然后转到5吨发酵罐(内含发酵培养基)，28-30℃通风搅拌，培养72-96hr。上种子罐、发酵罐期间，每隔4hr取样检验，测定糖度、PH值、菌丝体湿重，并显微镜观察菌体生长情况，培养液保持PH3.7-4.1之间，待发酵液糖度降到1％左右，菌丝体湿重30％以上时，放罐，再进行离心分离，即得到r-亚麻酸菌丝体，再用蒸馏水清洗菌丝体，然后用切片机切碎菌丝体，用真空低湿干燥器烘干，真空度0.1大气压左右，温度45-50℃，烘干时间4hr，得到含水量在5％以下的富含脂肪酸的菌丝体。
下面是
，通过附图及其后面的详细叙述，可以更好的理解本发明，具体如下附图1为亚麻酸甲脂标准红外光谱图；附图2为r-亚麻酸菌丝体分离、甲酯化产物的红外光谱图；附图3为r-亚麻酸菌丝体分离、甲酯化产物的气相色谱图；附图4为r-亚麻酸菌丝体分离、甲酯化产物的液相色谱附图5为培养基制备菌丝体的工艺流程所制得的菌丝体以其甲脂形式分离，甲酯化后收集单Rf值部分可得供鉴定用的样品。
附图1为亚麻酸甲脂标准红外光谱图，附图2为富含脂肪酸的菌丝体的红外光谱图。
下面是本发明所述的培养基的具体例子，通过这些例子并结合本发明其它段落的内容和参数，可以进一步地确认正是本发明所述的培养基才使得所得到的富含脂肪酸的菌丝体中各种成分的含量稳定，有效成分的含量高，并且在工业化生产中也同样有效。
实施例土豆培养基(做斜面) 1 2 3 4土豆％20 25 30 24琼脂％ 1.6 1.5 1.8 2葡萄糖％ 2.5 2 3 2.7种子培养基 1 2 3 4葡萄糖％ 8 6 7 5尿素％ 0.5 0.60.55 0.7(NH4)2SO4％1 0.8 0.9 0.5麦芽汁％ 0.1 0.1 0.1 0.1酵母膏％0.050.060.08 0.1KH2PO4％ 0.20.170.14 0.1MgSO4mg/L 0.040.060.070.08柠檬酸三钠％ 0.60.55 0.5 0.4发酵培养基 1 2 3 4葡萄糖％ 8 9 8 10KH2PO4％0.20.30.20.3NH4NO3％0.20.20.30.3MgSO4％ 0.05 0.04 0.03 0.05酵母粉％ 0.03 0.05 0.05 0.03Fe2+(FeSO4)mg/L 10 18 30 25Ca(CaCl2)mg/L 30 17 10 24Cu(CuSO4)％ 0.40.50.60.8Zn(ZnSO4)mg/L 3 2 1 3Mn(MnCl2)mg/L 1 1 2 3柠檬酸三钠％ 1.01.21.11.0柠檬酸％ 0.60.50.40.3采用本发明所述的用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基生产的脂肪酸组合物中脂肪酸的测定(按GB9695.2-88)仪器气相色谱仪，积分仪试验方法将脂肪酸组合物用索氏抽提法提取出油脂，在三氯化硼存在下进行甘油脂的皂化和游离脂肪酸的甲酯化，然后进气相色谱仪(如附图3为样品2的图谱)，用面积归一化法测其组成；下面是4个样品的总油脂中各种脂肪酸的检测结果(％)名称 样品1(％) 样品2样品3 样品414∶0(肉豆蔻酸)1.7 1.8 1.9 1.816∶0(棕榈酸) 26.9 26.1 2619.916∶1(棕榈烯酸)3.4 3.1 3.0 2.118∶0(硬脂酸) 1.9 2.0 2.1 118∶1(油酸) 49 49.449.343.518∶2(亚油酸) 12.4 12.112.312.118∶3(γ-亚麻酸) 4.2 4.9 519.0采用本发明所述的用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基生产的脂肪酸组合物中维生素E的测定(按GB12388-90)仪器高压液相色谱仪带紫外分光检测器试验方法样品中的VE经皂化提取处理后，将其不可皂化部分提取至有机溶剂中，用高效液相色谱法C18反相柱将VE分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。附图4为分离产物的样品2的液相色谱图，下面分别是4个样品的检测结果。检测结果样品5样品6样品7样品8(mg/100g)维生素E含量69.23 68.02 68.067.78采用本发明所述的用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基生产的脂肪酸组合物中氨基酸的测定仪器Beckman 6300氨基酸分析仪试验方法按照我国国家标准GB/T14965-94关于氨基酸的测定方法。
检测结果(mg/100g)名称 样品9样品10样品11 样品12天门冬氨酸1350 1320 1330 1300苏氨酸 500 520 510 550丝氨酸 400 500 440 430谷氨酸2300 2100 2200 2300脯氨酸2450 2450 2500 2550甘氨酸4100 4200 4000 4300丙氨酸1800 1900 1800 1900缬氨酸 850 830 820 800蛋氨酸 310 300 280 340异亮氨酸 770 760 710 750亮氨酸1300 1200 1100 1000酪氨酸 370 350 310 380苯丙氨酸 700 650 660 700组氨酸 220 250 270 300赖氨酸1000 1000 950 1050精氨酸1750 1700 1600 1600
通过上述方法的试验研究，证实采用本发明所述的用于发酵法生产富含脂肪酸的菌丝体的培养基生产的脂肪酸组合物中含有γ-亚麻酸、亚油酸等脂肪酸，维生素E、A，十六种氨基酸，微量元素，蛋白质等多种对人体有益的成份，以上结果由北京医科大学和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试认可。
由上可知，本发明提供的发酵法生产的脂肪酸组合物通过皂化、甲醇化预处理，经紫外、红外、核磁共振及质谱分析鉴定，证明油中含有γ-亚麻酸，其结构为顺-6，9，12-十八碳三烯酸，分子式为C18H30O2，油中γ-亚麻酸含量约为14.5％。依照我国国家标准关于蛋白质、脂肪酸、氨基酸、维生素及微量元素的测定方法，测得菌丝体中除含有γ-亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸和十六种氨基酸外，还含有以下微量组分，所述的微量组分包括维生素E、A、铁、锌、钙、镁、硒等微量元素。
本发明中所述的脂肪酸组合物真空干燥后为褐色的固体颗粒，其中，脂肪酸组合物中其它成分的分布如下其中，所述的干体脂肪酸组合物中含有的蛋白质约14.0g/100g。
在所述的干体脂肪酸组合物中含有的VA约0.079mg/100g.
在所述的干体脂肪酸组合物中含有的微量元素包括铁约55.5mg/100g；锌约0.14；铜约0.28；钙约375.4；镁约87.6；钾约55.6；钠约244；锰约3.04；磷约2125.8；硒约1.65。
所述的干体脂肪酸组合物中其它成分的分布如下标准 样品13 样品14 样品15 样品16总脂肪％＞30 44.446.1 47.948.3亚麻酸％＞64.2 9.7 1913.7酸值＜41.61.50 1.4 --本发明涉及的专用于发酵法制备脂肪酸组合物的培养基结合本发明所述的工艺，可以稳定地得到富含脂肪酸，尤其是富含r-亚麻酸的脂肪酸；所述的培养基用于被孢霉菌菌种培养、发酵和生产；所生产出的脂肪酸组合物或富含r-亚麻酸脂肪酸组合物成分基本稳定、有效成分的含量高，并且没有毒副作用。
权利要求
1.一种专用于发酵法生产富含r-亚麻酸脂肪酸组合物的培养基，其特征在于所述的培养基包括土豆培养基、种子培养基和发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述的土豆培养基(做斜面)包括土豆 20-30％琼脂 1.5-2％葡萄糖2-3％
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述的种子培养基包括葡萄糖6-8％尿素 0.5-1％(NH4)2 SO40.5-1％麦芽汁0.1％酵母膏0.05-0.1％KH2 PO4 0.1-0.2％MgSO4 0.04-0.08mg/L柠檬酸三钠0.4-0.6％
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述的发酵培养基包括葡萄糖8-10％KH2 PO4 0.2-0.3％NH4 NO3 0.2-0.3％MgSO4 0.03-0.05％酵母粉0.03-0.05％Fe2+(FeSO4) 10-30mg/LCa(CaCL2) 10-30mg/LCu(CuSO4) 0.4-0.8％Zn(ZnSO4) 1-3mg/LMn(MnCL2) 1-3mg/L柠檬酸三钠1.0-1.2％柠檬酸0.3-0.6％
全文摘要
本发明涉及的是专用于发酵法制备脂肪酸组合物的培养基，本发明所述的培养基包括土豆培养基，种子培养基和发酵培养基；采用本发明所述的培养基并结合本发明所述的工艺，可以稳定地得到富含脂肪酸，尤其是富含γ-亚麻酸的脂肪酸；所述的培养基用于被孢霉菌菌种培养、发酵和生产；采用本发明所述的培养基，所生产出的脂肪酸组合物或富含γ-亚麻酸脂肪酸组合物，可直接用于或作为添加成分用于饮料，食品，药物以及保健品，并且没有副作用。
文档编号C12P7/64GK1157850SQ9511930
公开日1997年8月27日 申请日期1995年11月30日 优先权日1995年11月30日
发明者余善铭 申请人:北京三鸣生物工程有限公司