专利名称：腈水化酶基因表达的调节基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及得自红球菌属细菌并编码能激活腈水化酶基因启动子的多肽的调节基因，含所述DNA的重组DNA，以及用所述重组的DNA转化的转化体。
由于反应在常温和常压下进行，转化程度高等原因，用腈水化酶(即水化腈成为酰胺的酶)生产酰胺的方法作为有工业价值的方法而得到应用。尤其是，已知红球菌属的细菌在其细胞中积累了显著数量的该酶，从而表现出高催化活性(见日本专利公开No.4873/1992和日本特许公开的Nos 91189/1987，470/1990和84198/1990)。
与所述的传统方法相比，由于可加工细菌以使其含有多拷贝的相同基因，从而期望使用经基因重组克隆的腈水化酶的方法可以使细菌水化腈的催化能力有极大的改善。经基因重组技术如位点特异性诱变，随机诱变等还可使酶得到进一步的提高。已经从N-774(日本特许公开No.119778/1990)和J-1(日本特许公开No.211379/1992)得到了源于红球菌属的腈水化酶。可以将来自N-774的腈水化酶基因成功地插入红球菌属-E.coli杂交质粒载体(日本特许公开No.64589/1993)，而且当导入红球菌属的细菌中后，可得到高活性(日本特许公开No.68566/1993)。另一方面，还没有关于在红球菌属的细菌中，表达源于玫瑰色红球菌J-1的腈水化酶基因的报道，尽管其腈水化酶活性高于N-774。
本发明的发明人发现不能表达源于J-1的基因是由于缺少调节基因的DNA片段而造成的，所述的调节基因涉及腈水化酶基因启动子的功能。因此，他们在J-1的总DNA中找到了调节基因，并发现该基因位于腈水化酶结构基因的上游。成功地用该基因在红球菌属的转化体中高水平表达腈水化酶。
即，本发明涉及源于红球菌属细菌并编码能激活腈水化酶基因启动子之多肽的调节基因，含有所述DNA的重组DNA，以及用所述重组DNA转化的转化体。
图1表示重组质粒pHJK18的构建过程。
图2表示重组质粒pHJK19的构建过程。
下文将详细描述本发明。经下列步骤实施本发明。
(1)制备染色体DNA从玫瑰色红球菌J-1中分离总DNA。
(2)构建DNA文库从含J-1腈水化酶基因的质粒中切出靶腈水化酶基因片段，然后用放射性同位素标记。用该片段作为探针。
用限制酶裂解步骤(1)中得到的总DNA，然后用上述制备的探针进行Southern杂交(Southern E.M.，J.Mol.Biol.98，503(1975))，将含靶基因的检测过的DNA片段插入质粒载体puc19中以制备文库。
(3)制备转化体并筛选重组DNA用步骤(2)中构建的重组DNA文库从携带靶重组DNA的菌落制备转化体，所述菌落用步骤(2)中得到的探针经菌落杂交(R.BruceWallace et al.，Nuc.Acids Res.9，879(1981))进行筛选。使杂交的菌落经Southern杂交以证实靶重组DNA的存在。
(4)分离并纯化重组质粒，构建限制酶图谱从步骤(3)中得到的转化体中分离重组质粒。该质粒称为质粒pNHU10。用不同限制酶对其进行裂解，然后经电泳分析以得到限制酶图谱。
(5)通过将含有调节基因和腈水化酶基因的片段插入能在红球菌属中复制的质粒载体中而构建重组质粒通过将步骤(4)中得到的质粒和含有源于J-1之腈水化酶基因的质粒pNHJ10H插入杂交质粒载体pK4中而构建各携带一调节基因和含腈水化酶基因片段的重组质粒pHK18和pHK19。
(6)转化红球菌属的细菌并由转化体生产腈水化酶将步骤(5)中得到的质粒导入红球菌属的细菌中，然后证实转化体中腈水化酶的表达。
(7)缺失—质粒和腈水化酶活性缺失步骤(5)得到的质粒的不同区域，从而制备缺失—质粒。用所得的缺失—质粒鉴别对于腈水化酶表达所必需的区域。由此鉴定腈水化酶表达所必需的，而不是编码腈水化酶的区域。
(8)核苷酸测序确定步骤(7)中所鉴定的区域的核苷酸序列。
已将玫瑰色红球菌J-1以保藏号FERM BP-1478保藏于theNational Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Japan.已将含质粒pNHJ10H的转化体TG1/pNHJ10H(FERM.BP-2777)，含杂交质粒载体pK4的转化体玫瑰色红球菌ATCC 12674/pK4(FERM BP-3731)，和含质粒pNHU10的转化体JM109/pNHU10(FERM BP-5224)分别作为质粒pNHJ10H，杂交质粒载体pK4，和质粒pNHU10的替代物而保藏。
将本发明的调节基因与腈水化酶基因和其启动子区一起导入可以使红球菌属的细菌生产更高水平的腈水化酶。也可以将其它外源基因导入启动子的下游区域以便以高产率生产其它蛋白质。
下面参考下列实施例详细说明本发明，但所述实施例并不意味着限制本发明的范围。
在实施例中使用下列缩写。TE10mM Tris-HCl(pH7.8)-1mMEDTA(pH8.0)TNE50mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA(pH8.0)-50mM NaClSTE50mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA(pH8.0)-35mM蔗糖。2XYT培养基1.6％胰胨，1％酵母提取物，0.5％NaClMY培养基1％聚胨，0.3％酵母提取物，0.3％麦芽提取物，1％葡萄糖(1)制备总DNA将玫瑰色红球菌J-1(FERMBP-1478)在100ml培养基(葡萄糖，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，酵母提取物，胨，CoCl2，脲，1升水，pH7.2)中于28℃培养2天。离心收集细菌细胞，然后用TNE洗涤颗粒，并悬浮于10ml TE中。将4ml 0.25M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg无色蛋白酶(achromoprotease)和10ml 10％SDS加到悬浮液中。将悬浮液在37℃保持3小时，然后离心。将0.7ml 2.5M醋酸钠和二乙醚加到20ml悬浮液中。除去上层，将2体积乙醇加至下层。用玻璃棒回收DNA沉淀。用TE∶乙醇2∶1，1∶9和0∶10(V/V)将DNA各漂洗5分钟，然后溶于2-4ml TE中。将10μl RNase A和T1混合物加到溶液中，然后将混合物在37℃温育。将1等分量的TE饱和的酚加到混合物中，然后离心。将多于等量的醚加到上层，保留下层。将下层对2L含少量氯仿的TE透析过夜，然后对新鲜TE缓冲液再透析3-4小时。得到4ml粗总DNA。
(2)构建DNA文库用各2μl的限制酶SacI和EcoRI，3μl反应缓冲液(10X)和13μl无菌水的混合物将10μl质粒pNHJ10H在37℃裂解2小时，在所述质粒中，已将含有J-1H-型腈水化酶基因的6.0kb DNA片段插入载体pUC19(日本特许公开No.211379/1992；Biochem.Biophys.Acta1129，23-33(1991)，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳消化产物。从凝胶上切下0.37kb长的SacI-EcoRI片段，用放射性同位素32P标记。
用EcoRI和EcoRV消化步骤(1)中得到的J-1的总DNA，在琼脂糖凝胶上电泳，然后进行Southern杂交，其中用上述制备的0.37kb的SacI-EcoRI片段作探针。一个含腈水化酶基因上游区的约4.3kbDNA片段与探针杂交。从琼脂糖凝胶上洗脱含4.3kb DNA片段的部分。
另外，用各2μl的限制酶SmaI和EcoRI，3μl反应缓冲液(10x)，和13μl无菌水混合物，在30℃将10μl质粒载体pUC19消化2小时。按如下步骤纯化SmaI-和EcoRI裂解的pUC19将等量的TE饱和的酚加到反应溶液中后，将溶液搅拌并经离心分成上(含水的)和下层。以相同方法用TE饱和的酚再提取上层，再用相同方法以等量氯仿提取2次。将3μl 3M醋酸钠和90μl乙醇加到上层，使样品在-80℃保持30分钟，离心、干燥并溶于TE。
用TAKARA连接盒于40℃作用过夜，将3μl上述含总DAN之4.3kb片段的部分插入上述SmaI-和EcoRI裂解的pUC19中而制备DNA文库。
(3)制备转化体并筛选重组DNA将E.coli JM109(可得自TaKara Shuzo Co.，Ltd)接种到10ml2×YT培养基中，然后于37℃培养12小时。培养后，将所得的培养物接种到新鲜的2×YT培养基中达到1％的浓度，然后将混合物培养2小时。将培养物离心，将颗粒悬于5ml冷50mM CaCl2中。将悬浮液在冰上放40分钟，然后再离心，将颗粒悬浮于0.25ml的冷50mM CaCl2中。将60μl步骤(2)中制备的重组质粒(DNA文库)加到悬浮液中。使混合物在0℃保持40分钟，于42℃热震荡2分钟，接着加入1ml 2×YT培养基。将混合物于37℃边振荡边温育60分钟。将培养物以100μl/板，铺于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂上。将平板在37℃温育。用下列方法经菌落杂交筛选在平板上生长的菌落以筛选携带腈水化酶基因上游DNA片段的菌落。将平板上生长的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上，然后溶解细菌。将DNA固定在滤膜上，与步骤(2)中得到的探针(0.37kb片段)杂交。使滤膜放射自显影，并筛选含靶重组DNA的菌落。另外，从菌落中提取重组质粒，重组质粒与上述探针的Southern杂交说明所筛选的菌落是携带靶基因的转化体。
(4)分离并转化重组质粒，构建限制酶图谱在100ml 2×YT培养基中，将步骤(3)中所选的转化体于37℃温育过夜，然后收集并于TNE洗涤。将8ml STE和10mg溶菌酶加到细胞中。使混合物在0℃保持5分钟。将4ml 0.25M EDTA，2ml 10％ SDS(在室温)和5ml 5M NaCl加到混合物中。使混合物在0-4℃保持3小时，然后超离心。将1/2体积的30％PEG 6000加到上清液中。使混合物于0-4℃保持过夜，再离心。将TNE加到颗粒中以使体积增加到7.5ml。CsCl加到悬浮液中，然后离心除去蛋白质。然后，将300-500mg/ml溴化乙锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中。将离心管热密封并超离心。回收cccDNA。将多于等量的水饱和的异丙醇加到cccDNA中以除去溴化乙锭。DNA样品对TE透析，得到约3ml纯化的重组质粒。由此得到的重组质粒称为pNHU10。由几种限制酶消化该重组质粒，由此得到的限制酶图谱列于图1。
(5)通过将含调节基因和腈水化酶基因的片段插入能在红球菌属中复制的质粒载体中而构建重组质粒。
步骤(4)中得到的质粒pNHU10与0.37kb核苷酸重叠，而且还含有来自pNHJ10H之腈水化酶基因上游的3.9kb核苷酸。在pNHU10上切下1.4kb FspI-EcoRI片段和0.9kbScaI-EcoRI片段，然后分别插入E.coli-红球菌细菌的杂种质粒载体pK4中以得到质粒pHJK16和pHJK17。通过将来自pNHJ10H的5.9kbEcoRI片段分别插入质粒pHJK16和pHJK17而构建质粒pHJK18和pHJK19。在图1和2中分别说明了这些步骤。在图1的pHJK18中，粗箭头说明本发明中发现的调节基因的位置和方向，细箭头表示编码2个腈水化酶亚单位之基因的位置和方向。在图2的pHJK19中，粗箭头表示本发明发现的调节基因的位置和方向，细箭头表示编码2个腈水化酶亚单位之基因的位置和方向。
(6)转化红球菌属的细菌并由转化体生产腈水化酶离心收集对数生长期的玫瑰色红球菌ATCC12674，用冰冷无菌水洗涤3次，然后悬浮在15％PEG 6000(聚乙二醇6000)中达到至少109个细胞/ml的终浓度。将1μg质粒pHJK18或pHJK19 DNA与100μl的细菌悬浮液混合，然后混合液在冰上冷却。将该DNA和细菌混合物导入基因脉冲室，在冰上冷却，用25μF的静电容量，400Ω的电阻和20KV/cm的电压脉冲。
将由此处理的细菌悬浮液在冰上放10分钟，然后在37℃加热5分钟。将1ml MY培养基加到悬浮液中，然后后者于28℃振荡3小时。将细菌悬浮液铺在含50μg/ml卡那霉素的MY琼脂板上，于25℃培养2天。将在平板上生长的菌落划在另一含卡那霉素的MY琼脂板上，根据它们在平板上的生长确定其卡那霉抗性。
将所得的玫瑰色红球菌转化体(玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK18和玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK19)在培养基(10g甘油，5g胨、3g酵母提取物，3g麦芽提取物，1g KH2PO4，1g K2HPO4，0.01gCoCl2·6H2O，0.75g或3.75脲(pH7.0)/1L培养基)中于28℃培养2天。经离心收集细菌细胞，用150mM NaCl洗涤颗粒，并悬于0.1M含0.35％正丁酸的HEPES-KOH缓冲液(pH7.2)中。由声处理破碎细胞，离心除去细胞膜。检测由此得到的细胞提取物的腈水化酶活性。在反应混合物中完成酶检测，所述的反应混合物含0.5ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1ml 200mM丙烯腈和0.5ml用适量水稀释的细胞提取物。该反应在20℃进行10分钟，加入0.2ml 1N HCl使其停止。用HPLC确定在反应混合物中形成的丙烯酰胺的量。
表1表示玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK18和玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK19无细胞提取物的腈水化酶活性。在表中，脲是腈化化酶的诱导剂。
表1转化体腈水化酶活性脲(g/L)00.75 3.75玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK18 171 279115玫瑰色红球菌ATCC12674/pHJK19 180 242104(单位/mg蛋白质)(7)缺失质粒和腈水化酶活性根据估计，与腈水化酶表达无关的区域还保留在pHJK18和pHJK19中，因此从中制备缺失质粒并检测腈水化酶活性。结果表明与活性表达有关的调节基因位于ScaI和AccIII位点间的1.9kb区域内。
(8)核苷酸测序经使用DNA聚合酶的链终止法(Sanger F.Science，214，1205-1210(1980))确定步骤(7)中所鉴定区域的核苷酸序列。序列分析表明存在编码序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列的长开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列列于序列表SEQ ID NO2中。
序列表SEQ ID NO1长度361类型氨基酸拓扑结构线性分子类型蛋白质来源生物体玫瑰色红球菌菌株J-1序列Met Pro Leu Arg Arg Leu Asn Leu Gly Leu Val Leu Pro Gln Ser Gly5 10 15Pro Ser Gly Ile Phe Gly Pro Ser Cys Gln Ala Ser Ala Glu Tyr Ala20 25 30Ile Asp Glu Leu Asn Ala Gly Gly Gly Ile Leu Gly Arg Glu Val Thr35 40 45Ala Val Phe Val Asp Gly Gly Ala Asp Pro Ser Ala Val Ala Ala Cys50 55 60Ile Ala Asp Gln Thr Lys Arg Arg Glu Leu Asp Ala Val Val Gly Trp65 70 75 80His Thr Ser Ala Val Arg Arg Arg Ile Val Ser Ala Ile Gly Gly Arg85 90 95Ile Pro Tyr Val Tyr Thr Ala Val Tyr Glu Gly Gly Glu Asn Ser Asp100 105 110Gly Val Phe Met Thr Gly Glu Val Pro Thr Asn Gln Ile Leu Pro Ala115 120 125Leu Glu Trp Met Thr Glu Ile Gly Val Arg Lys Trp Tyr Val Ile Gly130 135 140Ser Asp Tyr Val Trp Pro Arg Lys Thr Val Ser Val Ile Arg Glu Phe145 150 155 160Leu Ala Ser Asn Gln Leu Pro Ser Arg Gly Arg Ser Asp Val Arg Leu165 170 175Ala Ser Cys Glu Phe Leu Ser Leu Gly Thr Ser Asp Phe Thr Ser Thr180 185 190Leu Glu Ala Ile Glu Met Ser Gly Ala Asp Gly Val Leu Val Leu Leu195 200 205Leu Gly Gln Asp Ala Val Gln Phe Asn Arg Ser Phe Ser Arg Lys Gly210 215 220Leu His Arg Asp Ile Val Arg Leu Ser Pro Leu Met Asp Glu Asn Met225 230 235 240Leu Leu Ala Ser Gly Ala His Ala Ala His Gly Leu Tyr Ser Val Ser245 250 255Gly Phe Phe Glu Cys Leu Val Thr Gly His Ser Met Asp Phe Glu Ser260 265 270Arg Tyr Ile Lys His Phe Gly Pro Thr Ala Pro Pro Ile Thr Ser Pro275 280 285Gly Glu Ser Cys Tyr Glu Gly Ile Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ala Asp290 295 300Arg Ala Gly Asp Leu Asp Pro Met Ser Leu Ser Tyr His Ala Asp Arg305 310 315 320Thr Leu Asp Tyr Asp Ser Pro Arg Gly His Val Arg Phe Asp Gly Arg325 330 335His Leu Ala Gln Asp Met Tyr Ile Ala Arg Ala Asp Gly Val Glu Phe340 345 350Asp Val Leu Ala Gln Val Ser His Val355 360SEQ ID NO2长度1086类型核酸链型双链拓扑结构线性来源生物体玫瑰色红球菌菌株J-1序列GTG CCC CTC CGC CGA CTG AAC CTG GGC TTG GTG CTA CCT CAG AGT 45GGA CCG TCC GGC ATT TTC GGT CCG TCA TGC CAG GCG AGC GCC GAG 90TAC GCC ATC GAT GAG CTC AAC GCG GGC GGC GGA ATC CTG GGC CGA 135GAG GTT ACG GCG GTC TTC GTT GAC GGG GGC GCG GAC CCG TCC GCC 180GTA GCA GCA TGC ATC GCC GAC CAG ACG AAA CGT CGG GAA TTG GAC 225GCC GTA GTC GGG TGG CAC ACG TCT GCT GTT CGT CGA CGC ATC GTG 270AGC GCC ATC GGC GGA CGT ATT CCG TAT GTC TAC ACC GCA GTC TAC 315GAG GGC GGC GAG AAC TCC GAC GGC GTG TTC ATG ACG GGA GAG GTA 360CCG ACG AAT CAG ATT CTT CCT GCC CTG GAA TGG ATG ACT GAG ATC 405GGC GTG CGT AAG TGG TAT GTC ATT GGC AGT GAC TAC GTT TGG CCT 450CGA AAG ACT GTC TCG GTC ATT CGC GAA TTC CTG GCG TCG AAC CAG 495CTA CCG AGT CGA GGC CGC AGC GAC GTT CGA CTG GCG TCG TGC GAG 540TTC TTG TCA CTA GGC ACA TCC GAC TTC ACT TCA ACG CTC GAA GCA 585ATT GAG ATG TCG GGG GCC GAT GGC GTT CTC GTC CTC CTC CTC GGC 630CAG GAC GCA GTA CAG TTC AAC CGG TCT TTT TCA CGG AAA GGG CTG 675CAC CGC GAC ATC GTC AGA CTC AGT CCG CTG ATG GAC GAG AAC ATG 720CTG TTG GCA AGC GGC GCA CAC GCC GCG CAC GGA CTC TAC TCG GTG 765TCG GGG TTC TTC GAG TGC CTG GTC ACC GGG CAC AGC ATG GAT TTC 810GAA TCC AGG TAC ATC AAG CAC TTC GGT CCG ACC GCC CCG CCG ATC 855ACT TCG CCT GGA GAG TCG TGC TAC GAG GGC ATT CGG CTG TTG GCC 900ACT CTT GCA GAC CGG GCC GGC GAT CTC GAC CCG ATG TCT CTG AGC 945TAT CAC GCA GAC CGT ACC CTC GAC TAC GAC AGC CCT CGA GGC CAT 990GTC CGC TTC GAT GGT CGC CAT CTC GCT CAG GAC ATG TAC ATC GCG 1035CGG GCT GAC GGA GTA GAG TTC GAC GTC TTA GCG CAG GTT TCC CAT 1080GTG TGA 108权利要求
1.一种分离的编码多肽的调节基因，所述多肽有能力激活腈水化酶基因的启动子而且具有序列表SEQ ID NO1所定义的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的基因，其中编码能激活腈水化酶基因启动子之多肽的调节基因具有序列表SEQ ID NO2所定义的核苷酸序列。
3.一种重组DNA，其中已将权利要求1或2的调节基因及含启动子区的腈水化酶基因插入载体中。
4.用权利要求3的重组DNA转化而制备的转化体。
全文摘要
本发明涉及编码能激活腈水化酶基因启动子之多肽的调节基因，含所述调节基因的重组DNA，以及用所述重组DNA转化的转化体。本发明的调节基因与腈水化酶基因和其启动子区一起导入使得红球菌属的细菌可生产高水平的腈水化酶。也可将其外源基因导入启动子的下游区域以便以高产率生产其它蛋白质。
文档编号C12N15/09GK1133887SQ95119128
公开日1996年10月23日 申请日期1995年10月3日 优先权日1994年10月3日
发明者清水昌, 小林达彦 申请人:清水昌, 日东化学工业株式会社