本发明属于细胞生物学领域，涉及一种共培养体系，具体为原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。
背景技术：
脊髓损伤是严重影响身心健康的高致残性疾病，其治疗和康复的费用高、难度极大，给个人、家庭及社会均带来了沉重的负担，故一直为医学界研究的难点与热点。小胶质细胞是中枢神经系统(cns)中巨噬细胞源性免疫调节细胞，脊髓损伤等神经病理性改变发生后，小胶质细胞迅速激活，调控免疫应答，清理细胞碎片，对损伤后cns的微环境的调节具有重要意义。如何研究小胶质细胞在cns微环境中的作用是进一步研究药物综合调控的关键。
由于小胶质细胞占cns细胞总量较少，故对于提取、纯化原代小胶质细胞存在一定难度。随着技术的发展及改革，提纯小胶质细胞的方法已经从传统的振荡、温和酶消化法等转向流式、磁珠分选等，只要条件许可，便能较为容易的分离到纯度较高的小胶质细胞。然而即使提纯到纯度较高的原代小胶质细胞，实验中亦常常面临着另一个重大问题，即该细胞纯化后增殖能力显著减弱，培养时细胞不断老化，数量不断减少，最终导致体外培养的失败。故而如何提纯、成功培养原代小胶质细胞，利于原代细胞进行实验，以获得更可靠的实验结果，依旧是科研中存在的难点之一。
目前研究cns中小胶质细胞的吞噬作用的方法国内外文献报道主要为体内研究，或单一小胶质细胞或细胞系对墨水或荧光微球等吞噬的体外研究，而未见体外原代小胶质细胞对损伤神经元的吞噬作用。这不仅不利于模拟脊髓损伤后的微环境，而且常导致提取的原代小胶质细胞不能很好地发挥吞噬作用，促进神经再生效果较差。
因此，构建一种小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，高效地激活小胶质细胞的吞噬作用，为进一步探索药物促进小胶质细胞吞噬作用及多靶点改善微环境显得尤为重要。
技术实现要素：
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够高效激活小胶质细胞的吞噬作用，保证分离获得的细胞具有良好的细胞活性和分化能力，本发明提供了原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。
技术方案：原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。
所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，包括以下步骤：
第1步、小胶质细胞分离
a、无菌条件下分离新生一周内的sd大鼠脑皮质剪碎，胰酶消化15min；
b、终止消化，加入完全培养基缓慢吹打，静置后吸取上清；2000r/min×2min离心1次，弃上清，完全培养基重悬接种；4h及24h后更换培养基，之后每2-3天更换一次培养基；
c、取步骤b培养15d后的细胞，吸取原培养基并保留，润洗后加入dmem/f12稀释的胰酶孵育25-40分钟，终止消化，胰酶浓度为0.05％～0.0625％；
d、小心吸去未贴壁细胞或细胞碎片，加入混合培养基继续培养；
第2步、原代神经元分离、培养、构建神经元损伤模型
e、无菌条件下分离18d胎鼠海马体剪碎，培养箱中胰酶消化15min，血清终止消化；
f、加入完全培养基均匀吹打、移取上清，离心后接种于含2％b27的完全培养基；
g、4h后更换培养基，加入阿糖胞苷培养，阿糖胞苷的干预浓度为8～12μm，24h后更换培养基；
h、取步骤g培养7-12d的神经元，润洗后加入含谷氨酸的dmem/f12干预30min，谷氨酸的干预浓度为100μm，换新鲜含b27的完全培养基继续培养24h；
i、取步骤h的细胞经annexinv-fitc/pi双染流式检测鉴定神经元凋亡；
第3步、小胶质细胞/损伤神经元共培养体系
j、取步骤d培养1-2d后的小胶质细胞鉴定，取步骤g培养7-12d神经元鉴定，按步骤h制备神经元损伤模型
k、取步骤d中培养1-2d后的小胶质细胞，取步骤j的损伤神经元，接种于含小胶质细胞的培养板混合培养，形成原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系。
优选的，完全培养基的组分为dmem/f1275～90％，胎牛血清10～25％；混合培养基为新鲜完全培养基和原培养基按1:1混合。
优选的，步骤i中神经元凋亡率为(23.9±2.5)％。
优选的，步骤j中小胶质细胞和神经元细胞的纯度均≥95％。
优选的，步骤k中接种体系小胶质细胞密度与损伤神经元密度为10:1。
以上所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系在促进神经再生中的应用。
优选的，原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系中加入促进神经再生的药物含药血清培养后，小胶质细胞吞噬率增高50％～400％，吞噬率增高50％～400％，神经元一级突起数量增加50％～160％，神经元一级突起平均长度增加100％～200％。
本发明所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的工作原理在于：在该共培养体系下，以损伤的神经元激活原代小胶质细胞的吞噬功能，基于该共培养体系，可以通过观察小胶质细胞的吞噬指数以及损伤神经元再生突触的数量和长度等指标，来评价促进神经再生药物的体外干预效果。
有益效果：(1)本发明所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系较传统方法培养的静息小胶质细胞的不足，模拟神经损伤的微环境以激活小胶质细胞，保留了小胶质细胞的吞噬功能；(2)本发明所述体系中的小胶质细胞能够被损伤神经元激活为巨噬细胞，增强其吞噬神经元碎片的能力；(3)本发明所述方法构建的体系中原代细胞数量可观、性状稳定、活性较高，能够为后续的神经损伤或退变性疾病的基础研究提供可靠的共培养体系。
附图说明
图1是分离培养的静息状态的小胶质细胞显微图，
其中a是分离24h的小胶质细胞；b是分离15d纯化后的小胶质细胞；
图2是分离培养的神经元显微图，
其中a是分离24h后的神经元，b是分离48h后的神经元，c是分离96h后的神经元，d是分离10d后的神经元；
图3是神经元和小胶质细胞免疫荧光染色鉴定图，
其中a是神经元的βiiitubμlin骨架蛋白染色，b是小胶质细胞的cd11b蛋白染色，c是神经元的dapi核染色，d是小胶质细胞的dapi核染色，e是神经元的merge图片，f是小胶质细胞的merge图片；
图4是神经元annexinv-fitc/pi双染流式检测结果图，
其中，a为对照组，b为加入谷氨酸损伤模型组；
图5是“脊髓康”对共培养体系中小胶质细胞吞噬神经元碎片功能的影响图，
其中a是阴性对照组，b是“脊髓康”低剂量组，c是“脊髓康”中剂量组，d是“脊髓康”高剂量组，e是阳性对照组，f是吞噬百分率，g是吞噬指数；
图6“脊髓康”干预共培养体系中存活神经元的生长情况图，
其中a是阴性对照组，b是“脊髓康”低剂量组，c是“脊髓康”中剂量组，d是“脊髓康”高剂量组，e是阳性对照组，f是以及突起数量，g是一级突起平均长度。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。
所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，包括以下步骤：
第1步、原代小胶质细胞分离、培养
取新生sd大鼠，逐一经75％酒精消毒30s，断头完整取出大脑及脑干；体视显微镜下，剥离血管膜，去除脑干及海马，剪碎脑皮质，暂存于0℃预冷的dmem高糖+10％fbs培养基中；取剪碎脑皮质，离心去上清，加入0.125％胰酶5ml重悬，移入10cm培养皿，于37℃，5％co2培养箱中消化15min；加入1ml血清终止消化，加入2ml全培缓慢吹打，静置后吸取上清；2000r/min×2min离心1次，弃上清，以dmem/f12+10％fbs培养基重悬；细胞计数后，以2.5×10^5个细胞/ml密度接种于包被赖氨酸的6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中孵育；4h及24h后各更换1次培养基，之后每2-3天更换液1次。细胞培养15d后，吸取原培养基并保留，以dmem/f12润洗1min后吸除，每孔加入dmem/f12稀释的0.0625％胰酶2ml，于37℃，5％co2培养箱中孵育25-40分钟，每孔加入dmem/f12+10％fbs2ml终止消化；小心吸去未贴壁细胞或细胞碎片，以dmem/f12+10％fbs新鲜培养基与上述保留的原细胞培养基1:1混合，每孔加入2ml继续培养，培养1-2d后鉴定其纯度。
如图1所示，而未经一定时间培养的小胶质细胞，胞体圆形，该视野下未见多个细胞融合的巨细胞，多处于静息态，折光度较高，少量细胞无光泽，为损伤或死亡细胞。如图3所示，小胶质细胞内的cd11b被绿色荧光标记，阳性率为96.7％。
第2步、原代神经元分离、培养
以浓度为100μg/ml多聚赖氨酸包被液预处理6孔板，每孔1ml；取孕期18天sd母鼠，戊巴比妥钠麻醉，剖腹后取出胎鼠，将其至于冰上；75％乙醇浸泡消毒胎鼠后，将其断头，迅速取出所有胎鼠大脑及脑干，暂存于0°dmem高糖+10％fbs中；体视显微镜下，于大脑顶部中线处挑开大脑半球，直接暴露海马体，仔细剥离血管膜，分离并剪碎海马体，暂存于0°预冷的dmem高糖+10％fbs中；以0.125％胰酶混悬接种于10cm培养皿放入37℃，5％co2培养箱中消化15-20min，每过5min摇晃1次培养皿；加入1ml血清终止消化，加入2ml全培缓慢吹打10次，静置后吸取上清，加入全培、吹打、取上清反复3次；2000r/min×2min离心1次，弃上清，以dmem/f12+10％fbs+b27培养基重悬，调整细胞密度为2×10^5个细胞/ml，接种于包被多聚赖氨酸的6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中孵育；4h后更换新鲜培养基，加入10μm阿糖胞苷干预24h，更换培养基继续孵育，后2天每日换液1次。8-10天后鉴定其纯度。
如图2所示，接种24h后，大多数神经元贴壁生长，胞体饱满透亮，极少量突起可见，少量死亡细胞成碎片(图2-a)。培养48h后，细胞形态逐渐呈圆形、多角形或不规则形(图2-b)，胞体饱满，界限清晰，突起明显增多，但仍较短，培养96h后神经元间呈网络状分布，突触增长、分叉，仅可见少量杂细胞(图2-c)。培养10d后，神经元明显交织成网状(图2-d)。如图3所示，神经元骨架中的βiiitubμlin被红色荧光标记，阳性率为95.3％。
第3步、神经元损伤模型的建立及鉴定
取培养神经元，随机分为对照组及模型组。吸去原培养基，以pbs润洗3次，对照组加入dmem/f12继续培养，模型组加入含100μm谷氨酸的dmem/f12干预30min，30min后两组吸去培养基，以pbs润洗3次，换dmem/f12+10％fbs+b27培养基继续培养24h，胰酶消化以ep管回收神经元，细胞计数使每管细胞量在0.5-5×10^5个；3000r/min×5min离心2次；每1ml结合缓冲液加入20μlannexinv-fitc及20μlpi染色试剂，轻轻混匀；吸去上清，每ep管加入100μlannexinv-fitc/pi染色混合液，避光孵育10-15分钟，设置不加annexinv-fitc及pi的样本为阴性对照，单加annexinv-fitc及pi的样本做调节补偿。每样本加入800μlpbs上机检测凋亡率。
如图4所示，annexinv-fitc/pi双染经流式检测显示：正常组神经元凋亡率为(2.5±2.9)％，模型组神经元凋亡率为(23.9±2.5)％，模型组神经元凋亡率明显高于正常组(p＜0.05)，提示谷氨酸诱导神经元损伤模型的成功建立。
第4步、小胶质细胞/损伤神经元共培养体系
回收原代培养小胶质细胞，以dmem/f12+b27调整细胞密度为2×10^5个细胞/ml，每孔500μl接种于多聚赖氨酸预包被的24孔板内过夜(12-18h)。次日，回收谷氨酸诱导损伤后培养24h的神经元，以dmem/f12+10％fbs+b27调整细胞密度为2×10^4个细胞/ml；吸除接种小胶质细胞24孔板内培养基，pbs润洗3次，每孔500μl接种神经元细胞混悬液与小胶质细胞混合培养(以未损伤的神经元作对照)，设3个平行孔。
小胶质细胞/损伤神经元共培养24h后，吸去培养基，pbs润洗3次；4％多聚甲醛固定10min，pbs润洗3次，震摇，每次5min；0.2％triton-100通透10min,pbs润洗，震摇，每次5min；1.5％山羊血清的pbs室温封闭60分钟，pbs润洗，震摇，每次5min；含1.5％山羊血清及0.2％triton-100的pbs稀释一抗(1:200)；分别加入一抗：兔抗β3-tubμlin结合神经元骨架及碎片、小鼠抗cd11b结合小胶质细胞相关膜蛋白，每孔各抗体稀释液125μl，4°过夜，震摇；pbs润涤细胞3次，震摇，每次5min；含1.5％山羊血清及0.2％triton-100的pbs稀释二抗(1:100)；分别加入alexa594羊抗兔、alexa488羊抗小鼠，每孔各抗体稀释液125μl，室温避光孵育2h，震摇；pbs润洗细胞3次，震摇，每次5min；于倒置荧光显微镜下观察。200倍镜下每组随机选取6个视野摄片，摄取图像时以pbs洗涤或晃动培养板观察神经元碎片是否移动，确保碎片在小胶质细胞胞内。如图5所示，红色荧光标记的神经元碎片在绿色荧光标记的小胶质细胞内，pbs洗涤或晃动培养板无移位。
实施例2
将实施例1所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系应用于促进神经再生的药物疗效评价，包括以下步骤：
第1步、实验分组干预
促进神经再生的中药复方“脊髓康”(生药量20g/kg)给健康sd雄性大鼠灌胃，制备含药血清，另设等量生理盐水灌胃的大鼠制备空白血清作对照。
原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系分为2.5％(低)、5％(中)、10％(高)三个含药血清组，同时设置10％空白血清组(阴性对照组)、2ug/mllps+10％空白血清组(阳性对照组)，回收原代培养小胶质细胞，按分组条件加含药血清或空白血清配制dmem/f12+b27条件培养基，混悬小胶质细胞，调整密度为2×10^5个/ml，5％、2.5％含药血清组用空白血清稀释，临用前将各组血清加入dmem/f12培养液中，500μl每孔接种于24孔板内过夜。次日，回收谷氨酸诱导的损伤神经元，以dmem/f12+10％fbs+b27调整细胞密度为2×10^4个细胞/ml；吸除接种小胶质细胞24孔板内培养基，pbs润洗3次，每孔500μl接种神经元细胞混悬液与小胶质细胞混合培养，每组6个平行孔。
第2步、小胶质细胞对神经元碎片的吞噬实验
小胶质细胞/损伤神经元共培养24h后，每组取3个平行孔，4％多聚甲醛固定后免疫荧光染色，具体步骤同实施例1，β3-tubμlin结合神经元骨架及碎片、小鼠抗cd11b结合小胶质细胞相关膜蛋白；于倒置荧光显微镜下观察。200倍镜下每组随机选取6个视野，计数视野下小胶质细胞数(n)，吞噬碎片小胶质细胞数(n)，被吞噬碎片数(m)，计算吞噬百分率(n/n)、吞噬指数(m/n)。
结果如图5所示，“脊髓康”含药血清中、高剂量组干预的小胶质细胞/损伤神经元共培养体系中，吞噬指数及吞噬百分率方面均高于空白组(p＜0.05)，中剂量组低于lps组(p＜0.05)，高剂量组则与lps组无显著差异(p＞0.05)
第3步、脊髓康干预共培养体系促进神经再生实验
小胶质细胞/损伤神经元混合培养96小时后，每组取3个平行孔，按上述方法孵育一抗β3-tubμlin、二抗alexa594，dapi复染。每组随机选取15个神经元，记录每个神经元一级突起(从胞体直接发出的突起的)数量，运用image-proplus6.0曲线测量功能，测量并计算每个神经元一级突起平均长度。
结果如图6所示，“脊髓康”含药血清中、高剂量组干预的小胶质细胞/损伤神经元共培养体系中，一级突起数量优于空白组，与lps组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。“脊髓康”提高了神经元一级突起平均长度，与lps对比，“脊髓康”中剂量组平均突起较短，而高剂量组则平均突起较长。