本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及人工融合蛋白及其用途，更具体地，本发明涉及提高亲水性物质半衰期的方法、人工融合蛋白、人工核酸、构建体、重组细胞、获得人工融合蛋白的方法、纳米颗粒以及药物组合物。
背景技术：
：干扰素-α2(ifn-α2)具有抗病毒复制、抗肿瘤增殖和免疫调节作用，已被成功用于治疗病毒性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、尖锐湿疣等)和相关癌症(如白血病、肾癌、恶性黑色素瘤、多发性硬化症等)。但是，ifn经系统注射给药后容易被体内蛋白酶降解和肾排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，从而导致严重毒副作用，同时给患者带来沉重的经济负担。用聚乙二醇(peg)修饰ifn，能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。然而，目前的peg化干扰素存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制、生物活性严重降低等弊端。通过融合人血清白蛋白能够有效提高干扰素循环半衰期并有效控制修饰位点，但活性保持仅有1％，且临床试验效果并不明显。因此，如何有效解决如干扰素-α2给药难、治疗效果不理想的问题，是科研工作者拭待解决的关键问题。技术实现要素：本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：发明人发现，如果将具有自组装性能的多肽(自组装多肽)连接在药物蛋白等亲水蛋白多肽的活性位点非干扰区，所形成的融合蛋白可以在自组装多肽的自组装介导下形成纳米颗粒。更为重要的是，所形成的纳米颗粒相较于现有技术的药物蛋白，在机体内的稳定性、药物代谢动力学和生物分布得到了极大改善。为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种提高亲水性物质半衰期的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将所述亲水性物质与自组装多肽相连，连接位点位于所述亲水物质的活性位点非干扰区。发明人发现，将自组装多肽与亲水性物质的活性位点的非干扰区相连，所形成的人工融合蛋白能够在自组装多肽的自组装介导下形成纳米颗粒，并且，该纳米颗粒在机体内的半衰期相较于亲水物质本身，其在机体内的稳定性、药物代谢动力学和生物分布得到了极大改善，半衰期得到显著提高。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述亲水性物质为亲水性药物蛋白。进而利用根据本发明实施例的方法，亲水性药物蛋白的半衰期得到显著提高，克服了现有技术中，亲水性药物蛋白在体内循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，从而导致严重毒副作用的缺陷。根据本发明的实施例，所述自组装多肽为弹性蛋白样多肽。弹性蛋白样多肽的自组装性能更强，进而进一步有利于人工融合蛋白纳米颗粒的形成。根据本发明的实施例，所述弹性蛋白样多肽为淀粉样蛋白多肽。根据本发明的实施例，所述淀粉样蛋白多肽具有seqidno:1所示的氨基酸序列。发明人通过对比实验发现，具有seqidno:1所示的氨基酸序列的淀粉样蛋白多肽在促进人工融合蛋白纳米颗粒的形成方面效果更优。在本发明的第二方面，本发明提出了一种人工融合蛋白。根据本发明的实施例，所述人工融合蛋白包括：亲水区，所述亲水区包含亲水物质；以及疏水区，所述疏水区包含自组装多肽，所述自组装多肽与所述亲水物质的活性位点非干扰区相连。根据本发明实施例的人工融合蛋白可在自组装多肽的自组装介导下形成纳米颗粒，所形成的纳米颗粒不仅较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了人工融合蛋白中亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。根据本发明的实施例，上述人工融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述自组装多肽为弹性蛋白样多肽。弹性蛋白样多肽的自组装性能更强，进而进一步有利于人工融合多肽纳米颗粒的形成。根据本发明的实施例，所述弹性蛋白样多肽为淀粉样蛋白多肽。自组装多肽可以为淀粉样蛋白多肽全部氨基酸或任何区域，只要所选区域具有自组装功能即可。根据本发明的具体实施例，所述淀粉样蛋白多肽具有seqidno:1所示的氨基酸序列，其来自于酵母样淀粉蛋白多肽的n端区域。sdsnqgnnqqnyqqysqngnqqqgnnryqgyqaynaqaqsfvpqggyqqfqqfqpqqqqqq(seqidno:1)。本申请所述的亲水物质包括但不限于亲水蛋白、多核苷酸以及核酸适配体。其中，亲水蛋白包括医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体，特别包括治疗性蛋白如干扰素(干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ)、胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子(tnf)和酶等。具体的例子包括，但不不限于：天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生的生长因子(pdgf)，骨形态发生蛋白(bmp)，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(csf)、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽(vip)、肠促胰酶肽(cck)，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素(trh)、促甲状腺激素、；促黄体生成激素、促黄体激素释放激素(lhrh)、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂(il-1ra)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素-2(il-2)、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶；巨噬细胞活化；绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽；环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体等。所述核苷酸包括天然或人工合成的、单链或双链的多核苷酸或寡聚核苷酸，具体例子包括但不局限于：反义寡核苷酸，sirna，anti-mir(该核苷酸的靶基因如bcl-2，v2r，epha2的，小窝蛋白1，tnf-α，mif，gfpraf-1，c-raf，荧光素酶，血管内皮生长因子，scv，fas，ins2，caspase-8和hbsag等)。所述的核酸适配体包括但不局限于：血管内皮细胞生长因子(vegf)适配体，蓖麻毒素适配体、西葫芦毒蛋白适配体、凝血酶适配体、活化血浆蛋白c适配体、hiv-1逆转录酶适配体、hiv-1整合酶适配体、蛋白激酶c适配体、人嗜中性弹性蛋白酶适配体、l-选择素适配体、p-选择素适配体、耶尔森氏菌蛋白酪氨酸磷酸酶适配体、磷脂酶a2体血管生成素适配体、鼻病毒衣壳蛋白适配体等。其中，所述自组装多肽与所述亲水物质的连接位点可以是任何远离亲水物质活性位点的区域或任何对亲水物质活性位点不产生干扰的区域。根据本发明的实施例，所述亲水物质为亲水蛋白，所述自组装多肽可以与所述亲水物质的n-或c-端相连。在本发明的第三方面，本发明提出了一种人工融合蛋白。根据本发明的实施例，所述人工融合蛋白具有seqidno:2所示的氨基酸序列。cdlpqthslgsrrtlmllaqmrrislfsclkdrhdfgfpqeefgnqfqkaetipvlhemiqqifnlfstkdssaawdetlldkfytelyqqlndleacviqgvgvtetplmkedsilavrkyfqritlylkekkyspcawevvraeimrsfslstnlqeslrskegsggggslpetgg(seqidno:2)。根据本发明实施例的上述人工融合蛋白是在ifn-α2与自组装多肽sup35的融合蛋白。该融合蛋白可自组装成蛋白纳米颗粒，不仅很好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了干扰素在体内的半衰期、生物分布和抗肿瘤效果，从而为长效干扰素向临床转化打下坚实技术基础。在本发明的第四方面，本年发明提出了一种人工核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述人工融合蛋白。根据本发明实施例的人工核酸导入受体细胞，在适合蛋白表达的条件下，所获得的人工融合蛋白可自组装成纳米颗粒，该纳米颗粒不仅较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。根据本发明的实施例，上述人工核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述核酸具有seqidno:3所示的核苷酸序列。tgtgatctgcctcagactcattctctgggtagtcgtcgtacgctgatgctgctggctcaaatgcgccgtattagcctgttttcttgcctgaaagatcgccacgattttgggtttccacaggaagaatttggcaaccagttccagaaagccgaaacaattccggtactgcacgagatgattcaacaaatctttaacctgttcagcaccaaagactcttcagctgcctgggatgaaacactgctggacaaattctataccgagctgtatcagcaactgaacgatctggaggcatgtgttattcagggtgttggtgtgactgaaactcctctgatgaaagaggatagcattctggcagtccgtaaatattttcagcgtatcacactgtatctgaaagagaaaaaatatagcccgtgtgcctgggaagttgttcgtgccgaaatcatgcgcagctttagtctgtctaccaacctgcaagagagcctgcgttctaaagaaggatccggctcttcggattcaaaccaaggcaacaatcagcaaaactaccagcaatacagccagaacggtaaccaacaacaaggtaacaacagataccaaggttatcaagcttacaatgctcaagctcaatcttttgttccacaaggtggctaccaacagttccaacagttccagcctcaacagcagcaacagcaaggatccggtggcggtggctctctgccggaaaccggtggccaccatcatcatcatcat(seqidno:3)。在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带前面所述的人工核酸。根据本发明实施例的构建体导入受体细胞，在适合蛋白表达的条件下，所获得的人工融合蛋白可自组装成纳米颗粒，该纳米颗粒不仅较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述构建体的载体为pet-25b(+)。在本发明的第六方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的人工核酸或前面所述的构建体。在适合蛋白表达的条件下，根据本发明实施例的重组细胞可表达前面所述的人工融合蛋白，该融合蛋白可自组装成纳米颗粒，该纳米颗粒不仅较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。在本发明的第七方面，本发明提出了一种获得前面所述人工融合蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括在适于所述人工融合蛋白表达的条件下，培养前面所述的重组细胞，以便获得所述人工融合蛋白。根据本发明实施例的方法步骤简单，研发反应条件温和、生物活性留存高，所获得的人工融合蛋白自组装成纳米颗粒，该纳米颗粒不仅较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了融合蛋白中亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。在本发明的第八方面，本发明提出了一种纳米颗粒。根据本发明的实施例，所述纳米颗粒由数个前面所述的人工融合蛋白自组装形成，包括：疏水核心，所述疏水核心由所述人工融合蛋白的疏水区构成；以及亲水外壳，所述亲水外壳设置所述疏水核心的外表面，由所述人工融合蛋白的亲水区构成。根据本发明实施例的纳米颗粒较好地保留了体外生物活性，而且极大地改善了融合蛋白中亲水物质在体内的半衰期、生物分布和活性，从而为长效亲水物质向临床转化打下坚实的技术基础。根据本发明的实施例，上述纳米颗粒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述人工融合蛋白具有seqidno:2所示的氨基酸序列。由有seqidno:2所示的氨基酸序列介导的自组装蛋白纳米颗粒的结构和尺寸不受特别限制，如可以为球形，棒状，纤维状等形貌。根据本发明的具体实施例，所述纳米颗粒呈球形，所述纳米颗粒的直径为48nm～55nm，所述疏水核心的直径为20nm，所述亲水外壳的厚度为14～17.5nm。根据本发明实施例的上述纳米颗粒是ifn-α2蛋白纳米颗粒，具有很好的体外生物活性，干扰素在体内的半衰期、生物分布和抗肿瘤效果得到了极大改善和提高。在本发明的第九方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含前面所述人工融合蛋白、前面所述的核酸、前面所述的构建体、前面重组细胞或前面所述纳米颗粒。根据本发明实施例的药物组合物生物活性高、靶性强、机体内半衰期长、药代动力学具有显著优势。附图说明图1是根据本发明实施例的干扰素-自组装多肽sup35融合蛋白纳米颗粒示意图；图2是根据本发明实施例的通过镍柱亲和层析纯化获得ifnα和ifnα-sup35的结果图；图3是根据本发明实施例的q-tof分析ifnα-sup35和ifnα的分子量的结果图；图4是根据本发明实施例的dls分析ifnα-sup3np和ifnα的水合半径的结果图；图5是根据本发明实施例的dls分析ifnα-sup35融合蛋白纳米颗粒在不同溶液中表现的结果图；图6是根据本发明实施例的ifnα-sup35np和ifnα的二级结构的结果图；图7是根据本发明实施例的ifnα-sup35np最大临界胶束浓度的结果图；图8是根据本发明实施例的tem观测ifnα-sup35np形貌特征的结果图；图9是根据本发明实施例的mtt法测定ifnα-sup35np和ifnα的体外生物活性的结果图；图10是根据本发明实施例的mtt法测定ifnα-sup35np和ifnα的体外生物安全性的结果图；图11是根据本发明实施例的ifnα-sup35np和ifnα在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化的结果图；图12是根据本发明实施例的ifnα-sup35np和ifnα在肿瘤及其他组织中的分布情况的结果图；图13是根据本发明实施例的ifnα-sup35np和ifnα抑制肿瘤生长情况的结果图；图14是根据本发明实施例的小鼠治疗过程中的生存曲线的结果图；图15是根据本发明实施例的小鼠之后过程中肿瘤生长实物图；图16是根据本发明实施例的治疗后肿瘤部位病理组织切片；图17是根据本发明实施例的治疗后心、肝、和肾的病理组织切片；图18是根据本发明实施例的注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况的结果图；图19是根据本发明实施例的小鼠注射药物后心脏、肝、肾功能生理指标变化情况的结果图；图20是根据本发明实施例的小鼠注射药物后血液指标变化情况的结果图；图21是根据本发明实施例的携带ifn基因的质粒结构图；以及图22是根据本发明实施例的携带ifn基因和sup35基因的质粒结构图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。根据本发明的实施例，本发明提供了一种制备蛋白质-弹性蛋白样多肽融合蛋白的方法，其中，所述弹性蛋白样多肽通过连接到所述蛋白质上，所述蛋白质可为干扰素，所述干扰素可选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ。所述蛋白质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体，例如粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物或水蛭素。在实施例中，通过镍(ni)亲和层析提纯获得纯化的目标融合蛋白ifnα-sup35。利用四级杆/电离飞行时间质谱(q-tof)、酶标仪动态光散射(dls)、圆二色谱(cd)、透射电镜(tem)等分析手段表征ifnα-sup35np和ifnα的分子量、相变温度、水合半径和二级结构等物理化学性能。选用合理的细胞系，测试了ifnα-sup35np和ifnα的体外生物活性，即其体外抗肿瘤细胞增殖的能力，同时测试了其体外生物安全性；使用裸鼠模型，测试ifnα-sup35np和ifnα在体内的药物代谢动力学；并建立裸鼠肿瘤模型，测试ifnα-sup35np和ifnα的抗肿瘤效果和药物分布。根据本发明的实施例，本发明所涉及的检测手段如下：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)对样品进行初步分析。使用动态光散射(dls)测定样品粒径。dls测试使用的是malvernzetasizernano-zs90。数据处理使用软件zetasizersoftware6.32。选用q-tof测定分子量。采用圆二色谱仪分析二级结构。采用透射电镜观察样品形貌。采用mtt方法测定抗细胞增殖活性和体外生物安全性。采用雌性无胸腺裸鼠测试药物代谢动力学，利用das3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数。建立裸鼠模型测试干扰素-高分子结合体体内抗肿瘤活性和生物分布。采用病理组织切片方法分析样品导致肿瘤部位坏死程度和主要组织器官安全性。采用生化分析和血液分析方法来验证样品生物安全性。其中，ifnα基因序列(ncbigi386795)由生工生物技术(上海，中国)合成并插入-t载体中。利用pcr技术，从-t载体中扩增ifnα编码序列，通过ecori/bamhi酶切位点插入到pet-25b(+)载体中。ifn基因序列如seqidno:4所示。atgtgtgatctgcctcagactcattctctgggtagtcgtcgtacgctgatgctgctggctcaaatgcgccgtattagcctgttttcttgcctgaaagatcgccacgattttgggtttccacaggaagaatttggcaaccagttccagaaagccgaaacaattccggtactgcacgagatgattcaacaaatctttaacctgttcagcaccaaagactcttcagctgcctgggatgaaacactgctggacaaattctataccgagctgtatcagcaactgaacgatctggaggcatgtgttattcagggtgttggtgtgactgaaactcctctgatgaaagaggatagcattctggcagtccgtaaatattttcagcgtatcacactgtatctgaaagagaaaaaatatagcccgtgtgcctgggaagttgttcgtgccgaaatcatgcgcagctttagtctgtctaccaacctgcaagagagcctgcgttctaaagaa(seqidno:4)。引物如下：上游引物：5’cggaattcatgtgtgatctgcctcagac3’(seqidno:5)。下游引物：5’cgggatccttctttagaacgcaggctct3’(seqidno:6)。质粒结构如图21。sup35基因序列由生工生物技术(上海，中国)合成并插入-t载体中。利用pcr技术，从-t载体中扩增sup35序列，通过bamhi酶切位点插入到pet-25b(+)载体中(上述构建含ifnα有基因)。sup35基因序列如seqidno:7所示。tcggattcaaaccaaggcaacaatcagcaaaactaccagcaatacagccagaacggtaaccaacaacaaggtaacaacagataccaaggttatcaagcttacaatgctcaagctcaatcttttgttccacaaggtggctaccaacagttccaacagttccagcctcaacagcagcaacagcaa(seqidno:7)。引物如下：上游引物：5’cgcggatcctcggattcaaaccaaggca3’(seqidno:8)。上游引物：5’ccagaaccggatccttgctgttgctgct3’(seqidno:9)。质粒结构如图22所示。质粒构建成功后，转入大肠杆菌rosetta-gami(de3)plyss表达菌株中，进行表达检测并挑取包含pet-ifnα-sup35质粒的单克隆菌株。之后将该菌株接种在含有氨苄青霉素的20mllb培养基中，37℃、250rpm过夜培养。之后扩大培养到1l含有氨苄青霉素的tb(terrificbroth)培养基中，37℃、250rpm培养至od590＝0.5后，加入终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,iptg)，25℃、250rpm培养过夜。3000×g离心15min收集过夜培养的大肠杆菌培养液，然后重悬到缓冲液a(10mmpbs,5mm咪唑,ph7.4)。在低温下用超声破碎的方法来破坏细菌细胞壁，之后在4℃下以14000×g离心20min将破碎后产物与上清分离。然后收集上清，加入2ml聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,pei)(1％w/v)来沉淀核酸等物质，之后14000×g离心15min来去除核酸沉淀，收集上清。用ni亲和层析的方法来纯化带有his标签的ifnα-sup35重组蛋白，具体步骤是：将上清用0.22μm滤膜过滤后，上样到镍亲和柱中，然后用aktapurifier10系统进行纯化，之后用0～100％缓冲液b(10mmpbs,500mm咪唑,ph7.4)进行梯度冲洗，收集各个洗脱峰，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行分析。得到目标蛋白后，用hiprep26/10脱盐柱去除咪唑，并置将缓冲液置换成10mmpbs，ph7.4，溶液中，保存在-80℃。sds-page分析样品由含有5％β-巯基乙醇的laemmli样品缓冲液配制，浓度为1mg/ml，95℃下加热5min后，10μl样品装载到预制的10％sds-page凝胶中，垂直电泳80～100v电压下运行90min(电泳液为：25mmtris、250mmglycine、0.1％sds)。凝胶用考马斯蓝g-250染色处理后观察条带位置。图2显示了纯化后的ifnα-sup35与ifnα的sds-page检测。实施例1ifnα-sup35的物理化学表征用四级杆/电离飞行时间质谱(q-tof)测定ifnα与ifnα-sup35分子量，先将样品用nanoacquity高效液相色谱系统分离，然后再用synapt-g2-si质谱仪分离样品，其中流动相a由0.1％甲酸水组成，流动相b由100％乙腈和0.1％甲酸组成。之后将样品放入自动进样器进行电喷雾电离，在q-tof(synaptg2-si,waterscompany)质谱分析仪中进行分析。图3显示了q-tof分析结果。在malvernzetasizernano-zs90上用动态光散射(dls)方法测定ifnα和ifnα-sup35的水合半径。样品稀释在pbs缓冲液中，测试前经0.22μm孔径滤膜过滤处理。经dls测试，ifnα的水合直径为7nm，而合成的ifnα-sup35的水合直径为55nm。将样品在10％tween和10％sds中稀释，来研究蛋白自组装的驱动力。结果显示，10％tween和10％sds能将纳米颗粒解组装，粒径大小由55nm降低为5.6和4.8nm，与ifnα大小一致。证明纳米颗粒主要靠亲疏水作用维持其形貌。图4显示了dls分析ifnα和ifnα-sup35np的水合直径。图5显示了dls分析ifnα-sup35融合蛋白纳米颗粒在不同溶液中表现。ifnα-sup35np的二级结构用圆二色性谱分析测得。样品用水溶液稀释至0.2mg/ml，用pistarπ-180(appliedphotophysics有限公司)在200-250nm波长范围内进行紫外扫描分析。图6显示了圆二色性色谱分析ifnα和ifnα-sup35的二级结构，均在200-260nm波长范围内的圆二色谱都呈现出同样的208/222nm双峰曲线，为典型的α螺旋结构，且与ifn曲线重叠良好，表明sup35与ifnα融合表达后的二级结构没有明显影响。用尼罗红染色方法测定ifnα-sup35np最大胶束临界浓度。将尼罗红染料溶于pbs中，使其终浓度为1.25μm，然后将样品与尼罗红从8.3μm到0.03μm1:1倍比稀释。之后用激发光550nm，发射光630nm在spectramaxm3microplatereader(moleculardevices)酶标仪上测定荧光强度。图7显示了ifnα-sup35np最大胶束临界浓度。用透射电子显微镜(tem)来观察蛋白纳米颗粒形貌。将蛋白稀释到0.5mg/ml，滴到碳元素覆盖的铜网上，静置5min，之后吸取溶液，用2％(w/v)磷钨酸溶液进行染色，室温晾干，之后用hitachih-7650b透射电子显微镜来观测样品。tem显示ifnα-sup35纳米颗粒直径为48nm，其中亲水外壳约12nm，疏水内核为20nm。图8显示了tem分析结果。实施例2ifnα-sup35的体外生物活性测和生物安全性本发明中ifnα-sup35的抗细胞增殖活性和生物安全性采用mtt方法测定。我们选用了人burkitt’sb淋巴瘤细胞(daudib)来测试ifnα-sup35np抗细胞增殖活性，因为该细胞对ifn-α2具有较高的敏感。选用人乳腺上皮细胞(l929)和小鼠成纤维细胞(mcf-10)daudib细胞在测试ifnα-sup35np生物安全性。将细胞在含有10％fbs、50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的rmpi-1640中培养一段时间后(l929和mcs-10在dmem培养基中培养)，在96孔板中接种一定浓度的细胞悬浮液(50μl/孔，104个细胞)，将ifnα和ifnα-sup35np样品系列稀释，各50μl加入96孔培养板中，设阴性对照(不含ifn-α2)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％co2培养72～96h，加mtt溶解液(promega)20μl/孔，3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，比较不同样品处理后细胞增值的程度。图9和表1显示了mtt测定ifnα-sup35np的体外生物活性，ifnα-sup35np和ifnα的ic50分别为289.1pg/ml和49.28pg/ml，活性保持了17％，远远高于人白蛋白修饰的ifn的活性保持率(<1％)。图10显示了mtt测定ifnα-sup35np体外生物安全性结果，与对照组相比，ifnα-sup35np组细胞生长并未受到影响。该结果表明ifnα-sup35自组装成为蛋白纳米颗粒后并没有严重降低ifnα的活性，并具有良好的生物安全性，为体内抗肿瘤活性测试提供了依据。表1：样品ic50(pg/ml)相对活性(％)ifnα49.28100ifn-sup35np289.117实施例3ifnα-sup35np的药物代谢动力学测试以下所有动物实验均在清华大学关于动物实验的各项规定指导下完成。本发明中利用babl/c无胸腺雌性裸鼠模型经尾静脉注射ifnα或ifnα-sup35np后，测定了血液中干扰素浓度随时间变化的情况，并利用das软件进行数据分析。在药物处理前，6只8周龄体重为20g左右的雄性babl/c观察一段时间后，随机分成2组。以50μg/20g剂量尾静脉注射ifnα和ifnα-sup35np，然后在设定的时间点用断尾取血的方式采集10μl血液，室温静置30min，在4℃、3000×g下离心收集上层血清，保存于﹣80℃低温冰箱。用人ifn-α2elisa试剂盒(pblinterferonsource)根据说明书测定血清中的ifn-α2含量。利用das3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数。利用das软件中房室消除模型分析ifn-sup35np和ifnα的药物代谢动力学参数，ifnα仅为0.8h，在给药几分钟后，血液中干扰素的浓度即迅速下降到初始剂量的50％以下，24h后残留浓度不足初始浓度的0.1％。而ifn-sup35np在体内的浓度是逐渐减少的，其半衰期为17.9h，是ifn的21.5倍。到给药48h后，仍有20％以上的残留。ifnα-sup35np的体内药时曲线下面积(auc0-∞)是ifnα的51.2倍。以上结果表明，与未修饰的ifnα相比，ifnα-sup35np的半衰期和体内平均存留时间明显延长，药时曲线面积显著增加，清除率显著降低。图11显示了ifnα-sup35np在babl/c裸鼠体内的药物代谢动力学。表2显示了ifnα-sup35np的药物代谢动力学数据分析。表2：参数ifnαifn-sup35npt1/2(h)0.83±0.2517.90±1.87auc(106pg/ml·h)0.32±0.0516.57±1.34实施例4ifn-sup35np在组织中的分布情况本发明中利用移植了卵巢癌细胞的裸鼠测定了给药5h后各组织中残留的干扰素的浓度。将6只babl/c雌性无胸腺裸鼠分成2组，ifnα组和ifnα-sup35np组，人卵巢癌细胞(ovcar-3)在含有10％fbs，50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的rmpi-1640培养基中培养一段时间后，用胰蛋白酶消化剥离，经pbs洗涤，重悬于不含上述添加物的rmpi-1640培养基并与bdmatrigelmatrix等体积混合物中，0.2ml单细胞悬液(5×106个细胞)接种于裸鼠左后肢股骨处背部皮下，培养30天后形成200mm3大小的实体瘤肿块。ifnα-sup35和ifnα以尾静脉注射打入裸鼠体内，给药剂量为50μg/20g体重。给药5h后处死裸鼠，收集主要器官如心、肾、肝脏、脾脏、肺、胰腺、肌肉及肿瘤。组织用提取缓冲液(pbs含1mmedta，0.5％tritonx-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mmpmsf，按1:100比例稀释的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(sigma-aldrich))破碎后，离心取上清提取液。组织中的ifnα的浓度用elisa方法定量测定。图12显示了ifnα-sup35在各组织中累积情况。在注射样品5h后，ifnα-sup35np在各组织中能够有效累积。尤其是在肿瘤中，样品注射5h后ifnα-sup35np组中干扰素的浓度是ifnα组肿瘤中分布浓度11.3倍，这一结果充分证明了ifnα-sup35np蛋白纳米颗粒能够有效利用增强通透和滞留(epr)效应，使蛋白在血液中循环半衰期延长的同时能够更多的在肿瘤中得到聚集，从而提高干扰素在体内的生物利用度和抗肿瘤功效。实施例5裸鼠模型测试ifnα-sup35np体内抗肿瘤活性本发明中用卵巢癌细胞在裸鼠皮下肿瘤模型来评价ifnα-sup35np的体内生物活性。按上述方法，ovcar-3细胞接种于裸鼠左后肢股骨处背部皮下，培养～30天后形成实体瘤肿块(～30mm3)，从而建立裸鼠肿瘤模型。将30只裸鼠分成3组，ifnα-sup35np组、ifnα组和pbs组。以尾静脉注射打入裸鼠体内，给药剂量为50μg/20g体重，每四天一次，直至对照组小鼠全部死亡。每次给药时观察裸鼠生存状态以及肿瘤生长情况，动态测量裸鼠体重和肿瘤体积随时间的变化。当小鼠肿瘤生长超过500mm3或体重下降超过15％，小鼠即安乐处死。治疗结束后收集肿瘤、心脏、肝脏和肾脏，固定，包埋后，根据标准方法进行h&e染色，nikoneclipse90成像。同时通过眼球取血，获得血液和血清送至清华大学校医院检验科测定乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标。开始给药后，pbs组裸鼠的肿瘤迅速增大，至24天时，所有小鼠肿瘤体积均超过500mm3以上，生存中值仅为20天。ifnα组小鼠肿瘤逐渐增大，至28天所有小鼠均被处死，生存中值为26天，没有展现明显的抗肿瘤活性。相反，ifnα-sup35np组裸鼠的肿瘤没有明显长大，至结束给药后小鼠肿瘤没有明显变化，生存中值延长至62天。这说明，持续注射修饰的干扰素，并不能有效抑制肿瘤生长。相反，通过基因工程融合表达的ifnα-sup35融合蛋白能够有效地抑制了肿瘤的生长，具有非常好的体内抗肿瘤活性。图13显示了ifnα-sup35抑制肿瘤生长情况，图14显示了注射药物后小鼠的生存曲线，图15为小鼠肿瘤生长实物图。图16显示了治疗后肿瘤部位病理切片。裸鼠在试验周期内体重略有降低，但与对照组相比无明显差异，表明ifnα-sup35没有明显的副作用。第28天给药结束后监测小鼠的生理指标，与未注射药物相比无明显区别，心、肝、肾等主要组织器官切片显示无明显变化。表明ifnα-sup35np不会对体内器官造成明显毒性，为未来用于临床使用提供了基础。图17显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。图18显示了治疗后主要组织器官病理切片图。图19显示了小鼠注射药物后心脏(乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶)、肝(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)、肾(肌酐、尿素氮)功能生理指标变化情况。图20显示了小鼠注射药物后血液指标(红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白)变化情况。根据本发明实施例的方法制备的干扰素-sup35蛋白纳米颗粒具有较高的生物活性保存率，显著延长的半衰期和有效的肿瘤抑制作用，与文献报道中白蛋白融合的干扰素的体内外活性相比表现出更加优异的功效。因此，sup35介导的融合蛋白自组装技术可望取代白蛋白融合技术成为提高药物稳定性、改善药物代谢动力学和增强治疗功效的新方法。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>清华大学<120>人工融合蛋白及其用途<130>pidc3180317<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>61<212>prt<213>artificial<220><223>淀粉样蛋白多肽的氨基酸序列<400>1seraspserasnglnglyasnasnglnglnasntyrglnglntyrser151015glnasnglyasnglnglnglnglyasnasnargtyrglnglytyrgln202530alatyrasnalaglnalaglnserphevalproglnglyglytyrgln354045glnpheglnglnpheglnproglnglnglnglnglngln505560<210>2<211>178<212>prt<213>artificial<220><223>人工融合蛋白的氨基酸序列<400>2cysaspleuproglnthrhisserleuglyserargargthrleumet151015leuleualaglnmetargargileserleuphesercysleulysasp202530arghisasppheglypheproglngluglupheglyasnglnphegln354045lysalagluthrileprovalleuhisglumetileglnglnilephe505560asnleupheserthrlysaspserseralaalatrpaspgluthrleu65707580leuasplysphetyrthrgluleutyrglnglnleuasnaspleuglu859095alacysvalileglnglyvalglyvalthrgluthrproleumetlys100105110gluaspserileleualavalarglystyrpheglnargilethrleu115120125tyrleulysglulyslystyrserprocysalatrpgluvalvalarg130135140alagluilemetargserpheserleuserthrasnleuglngluser145150155160leuargserlysgluglyserglyglyglyglyserleuprogluthr165170175glygly<210>3<211>747<212>dna<213>artificial<220><223>编码人工融合蛋白的核酸的核苷酸序列<400>3tgtgatctgcctcagactcattctctgggtagtcgtcgtacgctgatgctgctggctcaa60atgcgccgtattagcctgttttcttgcctgaaagatcgccacgattttgggtttccacag120gaagaatttggcaaccagttccagaaagccgaaacaattccggtactgcacgagatgatt180caacaaatctttaacctgttcagcaccaaagactcttcagctgcctgggatgaaacactg240ctggacaaattctataccgagctgtatcagcaactgaacgatctggaggcatgtgttatt300cagggtgttggtgtgactgaaactcctctgatgaaagaggatagcattctggcagtccgt360aaatattttcagcgtatcacactgtatctgaaagagaaaaaatatagcccgtgtgcctgg420gaagttgttcgtgccgaaatcatgcgcagctttagtctgtctaccaacctgcaagagagc480ctgcgttctaaagaaggatccggctcttcggattcaaaccaaggcaacaatcagcaaaac540taccagcaatacagccagaacggtaaccaacaacaaggtaacaacagataccaaggttat600caagcttacaatgctcaagctcaatcttttgttccacaaggtggctaccaacagttccaa660cagttccagcctcaacagcagcaacagcaaggatccggtggcggtggctctctgccggaa720accggtggccaccatcatcatcatcat747<210>4<211>498<212>dna<213>artificial<220><223>ifn基因序列<400>4atgtgtgatctgcctcagactcattctctgggtagtcgtcgtacgctgatgctgctggct60caaatgcgccgtattagcctgttttcttgcctgaaagatcgccacgattttgggtttcca120caggaagaatttggcaaccagttccagaaagccgaaacaattccggtactgcacgagatg180attcaacaaatctttaacctgttcagcaccaaagactcttcagctgcctgggatgaaaca240ctgctggacaaattctataccgagctgtatcagcaactgaacgatctggaggcatgtgtt300attcagggtgttggtgtgactgaaactcctctgatgaaagaggatagcattctggcagtc360cgtaaatattttcagcgtatcacactgtatctgaaagagaaaaaatatagcccgtgtgcc420tgggaagttgttcgtgccgaaatcatgcgcagctttagtctgtctaccaacctgcaagag480agcctgcgttctaaagaa498<210>5<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>用于扩增ifn的上游引物序列<400>5cggaattcatgtgtgatctgcctcagac28<210>6<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>用于扩增ifn的下游引物序列<400>6cgggatccttctttagaacgcaggctct28<210>7<211>183<212>dna<213>artificial<220><223>sup35基因序列<400>7tcggattcaaaccaaggcaacaatcagcaaaactaccagcaatacagccagaacggtaac60caacaacaaggtaacaacagataccaaggttatcaagcttacaatgctcaagctcaatct120tttgttccacaaggtggctaccaacagttccaacagttccagcctcaacagcagcaacag180caa183<210>8<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>用于扩增sup35的上游引物序列<400>8cgcggatcctcggattcaaaccaaggca28<210>9<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>用于扩增sup35的下游引物序列<400>9ccagaaccggatccttgctgttgctgct28当前第1页12