一种紫貂裘皮制品真伪鉴别的MGB探针检测方法与流程

本发明属于分子物种鉴定技术领域，具体涉及一种基于mgb探针的实时荧光定量pcr法对紫貂裘皮制品的真伪进行鉴定的方法。本发明检测方法快速、准确。

背景技术：

紫貂(marteszibellina)，属食肉目、鼬科、貂属。主要分布于北亚大陆及临近岛屿，俄罗斯、中国、蒙古及朝鲜等国。在中国，主要分布在东北地区和新疆地区，北纬41°以北的针叶林以及温带针阔混交林。紫貂是珍贵毛皮兽类，是“东北三宝”之一，素有“裘中之王”之称，具有“见风愈暖、落雪则融、遇水不濡”的美誉。在皮毛市场巨大的经济利益驱动下，许多不法分子大肆偷猎紫貂，导致紫貂野生种群数量不断减少，目前中国已将其列为国家一级重点保护动物。同时，裘皮市场上，以其他毛皮冒充紫貂皮的情况屡禁不止。

深加工过的裘皮制品在形态特征和理化特性等方面都发生很大改变，因此原有的直观观察法、扫描电镜法、dna测序法等已经不能满足毛皮的精准鉴定。实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)是在常规pcr基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个pcr过程。相比于常规taqman探针法，mgb探针法的优势有两点：一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，取代常规可发光的tamra分子，使荧光本底降低，荧光光谱分辨率提高；二是探针3’端另结合了mgb——dna小沟结合物，使得较短的探针可以获得较高tm值，增加了探针的杂交稳定性，结果更精确，分辨率更高。

本发明建立了一种用于紫貂裘皮制品真伪识别的mgb探针的实时荧光定量pcr检测方法，利用mgb探针，能够高效、准确的检测毛皮制品是否为紫貂，避免其他毛皮假冒紫貂毛皮制品的现象，同时能为偷盗偷猎紫貂的案件提供关键证据。线粒体的coi基因是目前国内外公认的dna条码，本发明针对coi基因设计引物和mgb探针。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是设计针对紫貂的物种特异性引物和探针。

本发明的第二个目的是建立快速、准确区分紫貂裘皮制品真伪的分子检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

1、dna的提取体系

取紫貂针毛至少10根(平均3～4cm)或绒毛5mg放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μltne、30μlsds、20μldtt、20μl蛋白酶k，加入150μlbufferc-l(axygen动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照axygen动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的eluent洗脱液80μl洗脱dna，-20℃冷冻备用。

2、引物和探针的设计

选取genbank上已发表的紫貂的线粒体coi序列(kj202644、kj202643、kj202642和fj429093)，以及相关物种的同源序列，利用megalign进行比对后，选择紫貂物种特异的碱基序列，利用abiprimerexpress3.0设计引物与mgb探针，primer6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。

引物和探针设计结果：

3、本发明中qpcr检测方法的建立

在faststartuniversaprobemaster(rox)的基础上，建立20μl反应体系，其中上、下游引物和mgb探针的量从0.3μl到1.5μl，以0.1μl为梯度递加。反应体系中加入模板7μl。根据荧光定量pcr的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。

最优反应体系为：faststartuniversaprobemaster(rox)10μl，上游引物mzf0.5μl，下游引物mzr0.5μl，mgb探针0.5μl，dna模板7μl，ddh2o1.5μl。pcr反应程序如下：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。

pcr反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s40个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。

判图原则：ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于等于40判为阴性；ct值介于35～40之间判为可疑，dna模板加倍重复实验，如果ct值比原来减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。

4、本发明中qpcr特异性实验

利用紫貂引物和探针，分别加入紫貂皮、鞣质紫貂针毛、水貂、石貂、松貂、黄喉貂、白鼬、麝鼠、貉、浣熊、北极狐、赤狐、藏狐、沙狐、狼、狗、家猫、豹、雪豹、东北虎、孟加拉虎、豹猫、漠猫、猞猁、双峰驼、羊、水牛、羊驼、黑熊、棕熊、马来熊、小灵猫的dna模板进行荧光特异性的实验，反应体系按照qpcr检测方法所确定的最佳反应体系建立。

5、本发明中qpcr的灵敏度实验

将紫貂皮的dna提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍的dna溶液。依次用紫貂引物和探针进行检测。

6、重复性实验

取紫貂皮、紫貂鞣质针毛样品各10份，分别用紫貂的引物和探针进行检测，检测结果进行回判率分析。

7、盲测实验

随机准备10份样品，其中1份为紫貂样品，另外9份为其他物种样品。对此10份样品进行盲测实验，通过该盲测实验对本方法的有效性进行检验。

附图说明

图1紫貂引物探针特异性实验结果

图2紫貂梯度灵敏度实验

图3重复性实验结果

图4盲测实验结果

具体实施方式

实施例1

疑似紫貂裘皮制品的检测

1、dna的提取体系

取紫貂针毛10根(平均3～4cm)放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μltne、30μlsds、20μldtt、20μl蛋白酶k，加入150μlbufferc-l(axygen动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照axygen动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的eluent洗脱液80μl洗脱dna，-20℃冷冻备用。

2、体系和程序

对于待测样品，用20μl含有紫貂探针引物的反应体系进行检测分析。

20μl反应体系包括：faststartuniversaprobemaster(rox)10μl，上游引物mzf0.5μl，下游引物mzr0.5μl，mgb探针0.5μl，dna模板7μl，ddh2o1.5μl。

pcr反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。

判图原则：ct值小于35并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于35判为阴性；ct值介于35～40之间判为可疑，dna模板加倍重复实验，如果ct值比原来减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。

结果表明，疑似紫貂裘皮制品的dna提取液，经过qpcr扩增，出现明显的紫貂扩增曲线且ct值小于35，说明为紫貂裘皮制品。检测结果显示，本方法对于紫貂裘皮制品真伪识别的检测结果是准确、可靠、有效的。

序列表

<110>东北林业大学

<120>一种紫貂裘皮制品真伪鉴别的mgb探针检测方法

<160>0

<170>siposequencelisting1.0