本发明涉及本发明涉及物种鉴定领域，特别涉及北京库蠓的特异基因及其分子鉴定方法。
背景技术：
：吸血库蠓是一类微小型昆虫，可传播和携带蓝舌病、丝虫病、奥罗普切病毒、西尼罗河病病原体，是重要的医学昆虫之一。近年来，随着全球气候变暖，在一定程度上使库蠓传播虫媒病病毒的能力提高，也使媒介库蠓的分布范围向地球两极和高海拔地区扩大，库蠓种群传播虫媒病毒给动物群的能力增加，一些传统的“非媒介”库蠓种类具有了传播疫病的能力。由库蠓传播的虫媒病如蓝舌病、鹿流行性出血病、水泡性口炎、施马伦贝格病等，在全球一些国家或地区的传播和流行，造成了巨大的经济损失，对畜牧业发展构成了严重威胁。同时据相关文献记载，全世界已知蠓科有125属5360种。蠓科中的吸血蠓类是蠓科昆虫中能叮刺人和畜等动物种类的总称，是医学昆虫的重要类群之一，其种类在全世界已知有4属1503种，4个属包括库蠓属(culicoides)、蠛蠓属(lasiohlea)、细蠓属(leptoconops)和澳蠓属(austroconops)。其中库蠓属是蠓科中最大的一个属，也是四大吸血蠓属中分布最广、蠓种最多、与人畜关系最密切的一个属，兼吸人和动物血液，传播疾病，危害人体健康，对畜牧业发展影响极大。现知库蠓有1247种，占世界已知蠓科的23.3％，占已知4个吸血蠓属的83％。据群落多样性分析结果表明，我国库蠓优势种由南向北渐趋突出，而多样性指数则南方高于北方。在华南热带雨林地区发现的库蠓种类有133种。可见对吸血库蠓的准确鉴定是控制蠓传疾病的重要基础，也是疾病预防控制的核心前提。但是由于吸血蠓体型微小，形态学鉴定比较复杂，同时多种种间存在许多具有相似特征的隐种(crypticspecies)组成的复合体(complex)或种团(group)，仅有少部分经验丰富的分类学专家才能有效的鉴定其种类。而且形态学鉴定的成败还需通过制作完整的玻片标本来完成，标本制作过程步骤繁琐，周期长，难度大。因此对于吸血库蠓迫切需要一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷，提高分类的效率和准确度。其中，北京库蠓(culicoidesmorisitai)，国内分布在河北，山西，台湾，广东，湖北等地。因此，建立一种针对北京库蠓的新鉴别方法，快速准确鉴定和区分出北京库蠓，将有助于潜在媒介的调查研究，以便弄清媒介库蠓的分布数量动态、生活习性，并掌握其各期在各种条件下的活动规律，进行有效防制，为我国媒介传播性疾病的控制提供理论依据。分子分类技术是以遗传物质dna序列分析为依据来阐明物种间的差别从分子水平上快速而准确地鉴别物种，它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷。其中，dna条形码技术(dnabarcoding)是通过对一个标准目的基因的dna序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，dna条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。作为dna条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进行大范围的扩增；另一方面，要有足够的变异来区分不同的物种。因此，鉴定不同的物种类群需要选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖体12s和16s基因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用作条形码基因。线粒体基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基i(cytochromeoxidasesubuniti，coi)、线粒体细胞色素b(cytb)、nd4、nd5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900bp左右这两个条件，但nd4、nd5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作为全面dna鉴定系统的目标基因。因此，人们最终选定coi基因中的一个片段作为dna条形码基因。目前，该方法在库蠓分子鉴定中的应用仅局限在少数库蠓，例如专利cn105483261a涉及蓝腹库蠓的特异基因及其分子鉴定方法，cn105543249a涉及一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法，cn105543364a一种泰国库蠓的特异基因及其分子鉴定方法。目前现有技术中还未建立对北京库蠓的相关方法，本申请创新之处在于采用基于coi基因的dna条形码技术对吸血库蠓，尤其是北京库蠓进行分子鉴定。该方法可以与传统的形态学鉴定方法同时使用，相互佐证，不仅可解决形态学鉴定中存在的标本制作难，标本残缺不全无法鉴定，存在隐种鉴定错误的问题，而且有利于实现北京库蠓的快速鉴定。genbank中也仅有少数库蠓的coi基因序列，但至今尚无北京库蠓的相关基因序列。本发明另一个创新之处在于通过该方法已获得北京库蠓的coi基因序列。本发明提供的北京库蠓特异基因序列有利于实现北京库蠓的快速鉴定，提高鉴定准确度和效率。技术实现要素：在阅读了优选实施方案和所附权利要求的详细描述后，本发明的这些和其他目的、优点和用途将对本领域技术人员显示出来。本发明的目的在于提供一种北京库蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学方法获取北京库蠓(culicoidesmorisitai)特异基因-coi基因序列，通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地鉴定北京库蠓。为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：采用小型昆虫微量dna模板植被方法，通过改进的pcr反应条件，合成引物扩增北京库蠓的coi基因，扩增后的pcr产物送专业生物公司测定并进行序列的拼接。测序结果通过手工校对，并在ncbi中blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的北京库蠓特异基因为coi基因，所述库蠓的coi基因序列如seqidno.1所示。gatattggaactctatactttatttttggggcatgggccg40gaatagtaggaacgtccctgagaattttaattcgagcaga80attagggcacccgggggctctaattggaaacgatcaaatt120tataatgtgattgtaaccgcccatgcttttgtaataattt160tttttatagttataccaattataattggaggatttggaaa200ttgacttgttcctttaatgctaggggcccctgatatagct240ttcccccggataaacaatataagtttttgaatactccccc280cttctttatccttattattaattagaagtctagtagaaaa320tggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctttatcc360gccaatgtttctcatgcaggagcttctgttgacttagcta400tcttttctcttcatttggcaggaatttcatctattttagg440ggcagttaattttatcacaacaattattaatatacgatct480aatgggattacttttgatcgaatacctctttttgtttgat520cagttcttattacagctattttattattattatctttacc560agttttagcaggagctatcactatattattaacagatcgt600aatattaatacttctttctttgaccctgcaggaggaggag640acccaattttataccaacatttattttgattttttggccc680gga683所述的北京库蠓coi基因的pcr引物，其特征在于pcr引物序列为：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’反向引物5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’。本发明所述的北京库蠓的分子鉴定方法，包括：1)从待测的库蠓组织中分离提取dna；2)以该dna为模板，对coi基因采用的引物为：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’反向引物5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’通过聚合酶链式反应(pcr)扩增出北京库蠓coi基因；3)取适量步骤2)扩增后的coi基因产物用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭(eb)染色后在凝胶成像系统下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出大小约为683bp的条带，送生物公司进行测序；4)根据测序结果，如果相应coi基因序列与seqidno.1的相似性在98％以上，即可判断所述的待测昆虫组织为北京库蠓。北京库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，保证了鉴定结果的准确和可靠性。本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测pcr扩增结果。本发明的优点为：1)本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类鉴定相结合的方法，对所述吸血库蠓进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。2)与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的北京库蠓的分子鉴定方法可有效提高北京库蠓的鉴定时间和准确性。附图说明图1为北京库蠓coi基因pcr扩增结果电泳鉴定图，编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2为北京库蠓雌虫的coi基因，检出大小约为683bp的条带，m为dm2000的dnamarker；图2为未知库蠓coi基因pcr扩增结果电泳鉴定图，编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2为未知库蠓雌虫的coi基因，检出大小约为683bp的条带，m为dm2000的dnamarker。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。实施例1北京库蠓(culicoidesmorisitai)coi基因序列的获取1.北京库蠓标本的获取北京库蠓为野外诱蚊灯采集获得的标本，标本经冷冻处死后直接保存于95％的酒精中。标本经制成玻片标本后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取北京库蠓的胸部和足用于dna的提取。2.玻片标本的制作参照蠓科昆虫标本制作方法(虞以新主编，《中国蠓科昆虫》，北京，军事医学科学出版社，2006，pp1682-1683)3.dna模板的制备采用小型昆虫微量dna模板制备方法提取北京库蠓dna(文礼章主编，《昆虫学研究方法与技术导论》，北京：科学出版社，2010.pp：278-286)，提取的dna样品保存于-20℃备用。4.引物合成本实施所用引物如下：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’，反向引物5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’5.pcr扩增本实施例的pcr反应体系如表1所示。表1.北京库蠓coi基因pcr反应体系(50μl体系)成分体积(μl)模板5混合引物(引物1和引物2)2.52×pcrmastermix25ddh2o17.5反应程序如表2所示，pcr产物存于4℃保存备用。表2北京库蠓coi基因pcr反应程序步骤反应温度(℃)时间循环数预变性943min-变性9445s35退火5045s35延伸7260s35延伸7210min-6.pcr产物扩增检测取5μlpcr扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳(150v电压，75ma电流，30min)。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图1。7.基因序列测定选取5-10个电泳检测效果较好的pcr扩增产物送由专业测序生物公司纯化后双向测序(测序所用引物与pcr引物相同)，所得拼接基因序列经校正后即为北京库蠓的coi基因序列-seqidno.1。实施例2未知库蠓的鉴定1.标本的采集与保存现场采用灯诱法，晚挂晨收进行诱集，采获得标本经冷冻处死后直接保存于95％酒精中。2.dna模板的制备采用小型昆虫微量dna模板制备方法提取北京库蠓dna，具体方法同实施例1，提取的dna样品保存于-20℃备用。3.目的基因序列的获取3.1引物合成以获得的未知库蠓dna为模板，合成引物，所用引物序列如下：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’反向引物5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’3.2.pcr扩增本实施例的pcr反应体系如表3所示。表3.未知北京库蠓coi基因pcr反应体系(50μl体系)本实施例的反应程序如表4所示，pcr产物保存于4℃备用。表4北京库蠓coi基因pcr反应程序步骤反应温度(℃)时间循环数预变性943min-变性9445s35退火5045s35延伸7260s35延伸7210min-3.3pcr扩增产物检测与基因序列测定取5μlpcr扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳(150v电压，75ma电流，30min)。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知库蠓也能特异性扩增出大小约为683bp的产物，将此产物送专业生物测序公司测序，结果显示与基因序列seqidno.1的相似性为99.9％，因而可判定该未知库蠓为北京库蠓。虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。序列表<110>南昌市疾病预防控制中心<120>一种北京库蠓的特异基因及其分子鉴定方法<130>2018<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>683<212>dna<213>库蠓（culicoidesmorisitai）<400>1gatattggaactctatactttatttttggggcatgggccggaatagtaggaacgtccctg60agaattttaattcgagcagaattagggcacccgggggctctaattggaaacgatcaaatt120tataatgtgattgtaaccgcccatgcttttgtaataattttttttatagttataccaatt180ataattggaggatttggaaattgacttgttcctttaatgctaggggcccctgatatagct240ttcccccggataaacaatataagtttttgaatactccccccttctttatccttattatta300attagaagtctagtagaaaatggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctttatcc360gccaatgtttctcatgcaggagcttctgttgacttagctatcttttctcttcatttggca420ggaatttcatctattttaggggcagttaattttatcacaacaattattaatatacgatct480aatgggattacttttgatcgaatacctctttttgtttgatcagttcttattacagctatt540ttattattattatctttaccagttttagcaggagctatcactatattattaacagatcgt600aatattaatacttctttctttgaccctgcaggaggaggagacccaattttataccaacat660ttattttgattttttggcccgga683<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggtcaacaaatcataaagatattgg25<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taaacttcagggtgaccaaaaaatca26当前第1页12