本发明涉及一种鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，具体涉及一种利用亚端粒序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，属植物检测鉴定技术领域。
背景技术：
甘蔗近缘属野生种具有丰富遗传多样性，蕴藏着大量可用于甘蔗遗传育种的优异性状。斑茅是甘蔗遗传改良育种中备受关注的近缘属野生种之一，甘蔗育种家希望通过远缘杂交的方法将斑茅等近缘属野生种导入到甘蔗背景中来拓宽甘蔗的遗传基础。经过甘蔗育种家不懈的努力，已经获得了一大批甘蔗与斑茅的杂交后代。目前，这些甘蔗与斑茅的杂交后代的真实性鉴定方法主要有基因组原位杂交(genomicinsituhybridization，gish)和分子标记技术。gish技术是一种能够直观而有效地检测和鉴定甘蔗背景中斑茅等甘蔗近缘属野生种的异源染色体或片段的技术手段，然而由于甘蔗与斑茅存在着部分保守的重复序列会造成gish技术在鉴定时产生一定的噪音，从而影响检测效果。因此，在实际应用中仅仅依靠gish技术无法达到高效的检测效率，并且也会存在着一定的假阳性。
植物基因组中含有大量的重复序列，并且有些重复序列分布于整个基因组中，基于基因组特异重复序列开发的特异基因组标记可以有效地检测甘蔗背景中的斑茅染色体或片段，提高甘蔗遗传改良育种中斑茅染色质的鉴定效率。庄南生和王英等通过回收aflp扩增产物分离出斑茅基因组特异序列，并将其转化为scar分子标记，可用于跟踪甘蔗与斑茅杂交后代中的斑茅染色体或片段。besse等分离得到了4个斑茅基因组特异重复序列，利用southern杂交可以将甘蔗与斑茅杂交后代中的斑茅染色体及染色体片段。alix等利用与相同的方法分离出了1个斑茅亚端粒特异卫星dna重复序列。然而，他们分离出的斑茅基因组特异序列并未覆盖所有斑茅染色体，这些分子标记只能用于鉴定甘蔗与斑茅的早代杂交后代的真实性，无法用于稳定鉴定甘蔗与斑茅的高世代杂交后代的真实性。因此，急需寻找一种分布于所有斑茅染色体的标记，将其应用于快速鉴定甘蔗与斑茅的杂交后代中斑茅染色体或片段，这对于提高斑茅在甘蔗远缘杂交中的选择具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用亚端粒序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，以克服现有技术特异性及稳定性的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种亚端粒序列，其特征在于所述亚端粒序列为序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列。
一种利用亚端粒序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，其特征在于鉴定步骤如下：
1.根尖细胞玻片的制备：28℃恒温的条件下培养蔗茎，取根尖用1,4-二氯苯-α-溴代萘饱和水溶液预处理后转入卡诺氏固定液固定；固定后的根尖于ddh2o中低渗并置于37℃条件下混合酶中酶解2-4h，酶解的根尖分生区细胞涂抹于干净的玻片上晾干，获得根尖玻片；所述混合酶为4％onozukar10cellulose、0.5％pectolyasey-23和0.5％pectinase，由4gonozukar10cellulose、0.5gpectolyasey-23和0.5gpectinase加入到95mlph4.5酶解缓冲液中配制而成，其中ph4.5酶解缓冲液由0.147g柠檬酸钠、0.105g柠檬酸、0.28g氯化钾加入50mlddh2o配制而成；所述诺氏固定液为无水乙醇和冰醋酸，体积比为3︰1；
2.标记探针的制备：配制50μl反应液，其中包含25μl0.4～1mmdntpmixwithdigoxigenin，5μl10×dnaseibuffer，1～3μl0.005u/μldnasei，2～4μl5u/μldnaploymeasei，5μg质粒，用ddh2o补足至50μl；反应液在15℃条件下反应1.5-2h，获得digoxigenin标记的亚端粒序列，即标记探针；所述质粒由亚端粒序列连接到pmd19-t载体中获得；其中亚端粒序列为序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列；
3.根尖玻片的预处理：将根尖玻片置于37℃含100μg/mlrnasea的2×ssc溶液中消化1h；转入含500μg/ml胃蛋白酶的0.01mhcl溶液中处理30min，然后用ph7.4磷酸盐缓冲液冲洗1次；最后于室温下，0.1×ssc冲洗1次，晾干后置于含70％去离子甲酰胺的ssc溶液中80℃变性3min；变性后的根尖玻片，立即置于-20℃预冷的体积浓度70％、95％和100％的梯度乙醇中，各脱水5min，然后置于空气中干燥，获得预处理根尖玻片；所述500μg/ml胃蛋白酶由0.5mg胃蛋白酶加入1mlddh2o得到；0.01mhcl溶液由45μl浓hcl加入50mlddh2o得到；0.1×ssc由20×ssc稀释200倍得到，2×ssc由20×ssc稀释10倍得到；20×ssc由175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠定容至1l并调节ph至7.0配制而成；70％去离子甲酰胺的ssc溶液由去离子甲酰胺和2×ssc按体积比7:3配制而成；ph7.4磷酸盐缓冲液由8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾定容至1l，调ph至7.4而获得；
4.配制变性杂交混合液：配制50μl杂交混合液，杂交混合液包含25μl去离子甲酰胺，10μl500mg/ml硫酸葡聚糖，5μl20×ssc，1.5μl200mg/ml十二烷基硫酸钠和1～5μl标记探针；将50μl杂交混合液放入98℃中变性10min，然后立即置于冰水中10min，保存在-20℃，获得变性杂交混合液，备用；所述500mg/ml硫酸葡聚糖由0.5g硫酸葡聚糖定容至1ml配制而成；200mg/ml十二烷基硫酸钠由0.2g十二烷基硫酸钠定容至1ml配制而成；
5.变性杂交混合液与预处理根尖玻片的杂交：将50μl变性杂交混合液加到预处理根尖玻片上，盖上塑料盖膜，于37℃杂交过夜，获得杂交玻片；将杂交玻片转入42℃的2×ssc中漂洗5min后，置于42℃的4×ssc/tween中漂洗5min；然后加入50μl含49μl抗体稀释液和1μl200μg/ml抗digoxigenin荧光素抗体，置于37℃温育1h；然后，置于37℃的4×ssc/tween中洗脱3次，每次10min；再加入50μl含49.5μl抗体稀释液和0.5μl400μg/ml荧光标记的兔抗绵羊igg抗体，置于37℃温育1h；然后，置于37℃的4×ssc/tween中洗脱3次，每次10min；获得洗脱的杂交玻片；最后在洗脱的杂交玻片上加入100μl3μg/mldapi复染后，加入抗褪色剂封片并镜检；如果待测样品中含有结合靶序列的标记探针，就会产生绿色荧光信号，则判定该待测样品包含斑茅血缘，为甘蔗与斑茅真实杂交后代；所述4×ssc/tween由200ml20×ssc定容至1l并加入3mltween-20得到；3μg/mldapi由5mg的dapi溶解到16.7mlddh2o中配制而成；400μg/ml荧光标记的兔抗绵羊igg抗体由0.4mg荧光标记的兔抗绵羊igg抗体加入到1mlddh2o中配制而成；抗体稀释液由50mlph7.4磷酸盐缓冲液、0.25g牛血清蛋白、1ml胎牛血清配制而成；200μg/ml抗digoxigenin荧光素抗体由200μg抗digoxigenin荧光素抗体加ddh2o定容至1ml获得；所述产生绿色荧光信号的标记探针，其核苷酸序列为序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列。
本发明结合荧光原位杂交技术，利用斑茅相对甘蔗特异的亚端粒序列探针来鉴定甘蔗与斑茅的真实杂交后代，能够避免其它方法带来的假阳性高的缺点。该方法具有效率高，灵敏性好，可靠性高的特点。在实际应用过程中，无需考虑生长周期的长短，只需要获得蔗苗的根尖就能进行真假杂交后代的检测。此外，该方法稳定性较好，能够检测较高杂交世代的真实性，为在甘蔗遗传育种改良过程中斑茅的杂交利用提供高效稳定的鉴别方法。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1、一种利用亚端粒序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，其特征在于鉴定步骤如下：
1.根尖细胞玻片的制备：选择健壮的蔗茎，在28℃恒温保湿的条件下培养。切下2cm的根尖，并用1,4-二氯苯预处理2h。再转入卡诺氏固定液中4℃固定24h。将固定后的根尖ddh2o中低渗0.5h，37℃条件下，将固定好的根尖置于混合酶(4％onozukar10cellulose、0.5％pectolyasey-23和0.5％pectinase)中酶解3h。再将根尖放入卡诺氏固定液中固定0.5h，并涂抹于干净的玻片上晾干，获得根尖玻片。
2.标记探针的制备：digoxigenin标记亚端粒序列的反应体系如表1所示：
表1标记探针的反应体系
反应液在15℃条件下反应1.5-2h，获得digoxigenin标记的亚端粒序列；
3.根尖玻片的预处理：先将根尖玻片放入100μg/ml的rnasea-2×ssc，于37℃水浴1h。然后室温条件下0.01mhcl中处理2min和磷酸盐缓冲液(ph7.4)漂洗2min。最后置于0.1×ssc中处理3min，并在超净工作台中干燥。然后置于70％去离子甲酰胺，在80℃条件下变性3min。再放入-20℃预冷的体积浓度70％、95％、100％的梯度乙醇中，每个梯度中脱水5min，然后在灭菌的超净工作台中完全晾干，获得预处理根尖玻片。
4.配制变性杂交混合液：制备50μl杂交混合液体系如表2所示；制备好的混合液涡漩混匀后，放入98℃中变性10min，然后立即置于冰水中10min，保存在-20℃备用，获得变性杂交混合液。
表2杂交混合液体系
5.变性杂交混合液与预处理根尖玻片的杂交：在预处理根尖玻片上加入50μl的变性杂交混合液，并置于37℃杂交过夜，获得杂交玻片。除去杂交玻片的盖片，并把杂交玻片放入42℃预热的2×ssc中洗脱2次，每次5min；然后转入20％fd-0.1×ssc中洗脱2次，每次5min；再放入42℃预热的2×ssc中洗脱2次，每次5min；接着在室温条件下，放入的4×ssc/tween中洗5min；再加200μl5％bsa-4×ssc/tween20，盖上盖片并于37℃封闭30min。甩干封闭液，然后加入50μl含49μl抗体稀释液和1μl200μg/ml抗digoxigenin荧光素抗体，置于37℃温育1h；并置于37℃的4×ssc/tween中洗脱3次，每次10min；再加入50μl含49.5μl抗体稀释液和0.5μl400μg/ml荧光标记的兔抗绵羊igg抗体，置于37℃温育1h；并置于37℃的4×ssc/tween中洗脱3次，每次10min；获得洗脱的杂交玻片。在洗脱的杂交玻片上加入一滴含3μg/mldapi的抗褪色剂溶液压片，然后置于4℃冰箱中避光放置3h后，镜检并用axiovison4.7捕捉收集和处理图像。由于标记探针如果未能与靶序列结合就会被洗脱掉，因此只有结合靶序列的标记探针才能产生绿色荧光信号。产生绿色荧光信号的标记探针，其核苷酸序列为序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列。35份甘蔗与斑茅杂交材料的原位杂交结果表明，利用亚端粒序列检测甘蔗与斑茅杂交后代的准确率为100％。
实施例2、利用pcr方法相互印证亚端粒序列检测斑茅血缘
为了进一步简便检测流程,我们利用亚端粒序列设计了1对扩增斑茅特异引物257f和257r，其核苷酸序列如序列表中seqidno：2和seqidno：3所示的核苷酸序列；用ctab法提取70份植物材料基因组dna，其中斑茅原种、甘蔗属热带种、大茎野生种、细茎野生种、中国种、印度种以及甘蔗栽培品种各5份材料(如表3所示)，斑茅与甘蔗杂交后代f1、bc1、bc2、bc3共35份材料(如表4所示)，od260/od280比值在1.6～1.8之间的dna质量满足实验要求，测定浓度并稀释为50ng/ul分装，作为模板dna。
特异引物257f/r的特异性和稳定性。引物257f/r特异性检测：对35份斑茅、甘蔗原种材料进行pcr扩增的结果，在斑茅原种和含斑茅血缘的甘蔗中均扩增出特异片段，而在不含斑茅血缘的甘蔗属材料中没有扩增出该片段，说明斑茅特异引物257f/r的特异性好，可以用于甘蔗与斑茅的杂交后代的真实性鉴定；引物257f/r稳定性检测：利用经fish证实含有斑茅血缘的甘蔗与斑茅的f1、bc1、bc2和bc3无性系材料进行pcr检测，结果表明，在所有的无性系材料中均能够扩增出亚端粒序列的目的条带，说明引物257f/r具有良好的稳定性，可用于检测未知高世代的甘蔗与斑茅杂交后代。
表3斑茅及甘蔗无性系
表4甘蔗与斑茅的f1、bc1、bc2和bc3无性系
序列表
<110>福建农林大学
<120>一种利用亚端粒序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法
<130>2018
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>299
<212>dna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>1
tcgagcggccgcccgggcagaggaattgggaatagcgggactatggacatttttctaaaa60
atcacttaccataagccacaaatcggcatttgtttcagtgaaatctcgcaattccgccga120
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<210>2
<211>20
<212>dna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>2
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<210>3
<211>19
<212>dna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>3
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