本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
：草酸(oxalicacid)，即乙二酸，分子式为h2c2o4，广泛存在于自然界中，常以草酸盐形式存在于植物如伏牛花、羊蹄草、酢浆草和酸模草的细胞膜，几乎所有的植物都含有草酸盐。在某些食物(如菠菜，绿茶，咖啡等)中含量很高。草酸在生物体内为最终产物，不能被进一步分解，主要排泄方式是随尿液一起排出。人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸，内源性草酸是指人体自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸含量基本相同。某些肾结石高发人群的外源性草酸远远大于内源性草酸。人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，而这些草酸钙晶体极易在膀胱、肾脏等器官内沉积形成结石。ii型高草酸尿症是指食源性草酸吸收异常，导致尿草酸比正常人偏高，是除原发性高草酸尿症外导致结石的重要因素，因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸含量，从而降低患结石的风险。低草酸饮食或降解食物中的草酸是防治草酸钙结石最重要策略，目前在医学界已达成共识。目前，已发现的能分解草酸的酶有草酸氧化酶、草酸脱羧酶和草酰辅酶a脱羧酶/甲酰辅酶a转移酶。草酸氧化酶(oxalateoxidase，以下简称oxox)能专一性地将草酸分解为co2和h2o2，因此在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面有着潜在的应用价值。草酸氧化酶虽然广泛存在于植物体内，但含量较低且提取纯化工艺复杂。草酸氧化酶在其他微生物(毕赤酵母、芽孢杆菌等)表达宿主中的表达水平也普遍不高，在原核表达系统e.coli中可以表达但不可溶，需要清洗包涵体，纯化，复性，程序繁琐。因此，开发产量高、安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。技术实现要素：本发明的目的是为了克服上述
背景技术：
的不足，提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明的基因工程菌能够高效表达具有天然活性的草酸氧化酶，适用于研发重组草酸氧化酶药物、生产低草酸食品及饮料。本发明提供一种草酸氧化酶的优化基因，其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。在上述技术方案的基础上，该草酸氧化酶的优化基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明提供一种重组表达载体，其包含有草酸氧化酶的优化基因。本发明提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，包括宿主细胞，所述宿主细胞中含有重组表达载体。在上述技术方案的基础上，所述宿主细胞为里氏木霉。本发明还提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：s1、将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；s2、构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株；s3、敲除所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株的mus53基因，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；s4、采用所述草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；s5、采用所述重组表达载体转化所述里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。在上述技术方案的基础上，步骤s2的具体过程如下：s201、提取里氏木霉基因组dna；s202、采用所述里氏木霉基因组dna，构建里氏木霉表达质粒载体pmdt05；s203、采用所述里氏木霉基因组dna构建里氏木霉pyr4基因敲除盒，将所述载体pmdt05与所述里氏木霉pyr4基因敲除盒进行连接，得到里氏木霉pyr4基因敲除载体pmdt05-pyr4ko；s204、将所述载体pmdt05-pyr4ko通过根癌农杆菌介导转化里氏木霉，得到里氏木霉pyr4基因缺失突变株；步骤s3的具体过程如下：s301、采用所述里氏木霉基因组dna构建里氏木霉mus53基因敲除载体pmdt05-mus53ko；s302、采用所述载体pmdt05-mus53ko通过根癌农杆菌介导法转化所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株。本发明还提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌在制备草酸氧化酶中的应用，采用所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌制备草酸氧化酶的过程包括以下步骤：将所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。本发明还提供一种草酸氧化酶，用于降解草酸或草酸盐，其氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明还提供一种药物组合物，用于预防或治疗草酸过多的疾病，其包含有上述的草酸氧化酶。与现有技术相比，本发明的优点如下：(1)本发明将经密码子优化、人工合成的草酸氧化酶基因转化入里氏木霉(trichodermareesei)中，构建能高效表达草酸氧化酶的里氏木霉基因工程菌。本发明的里氏木霉基因工程菌摇瓶发酵168h，发酵液上清草酸氧化酶活力可达到6000u/l。该菌株能够分泌表达具有天然活性的草酸氧化酶，为研发一种适用于预防或治疗草酸过多疾病的重组草酸氧化酶药物提供了可能性。(2)里氏木霉是美国食品药品监督管理局(fda)认证的安全的微生物(gras微生物)，适合应用于食品和医疗领域中，是理想的宿主细胞。采用本发明的里氏木霉基因工程菌制备的草酸氧化酶能够广泛用于研发生产降草酸药物、加工低草酸食品及饮料。附图说明图1为本发明实施例2中的载体pmdt05的构建图谱；图2为本发明实施例2中的里氏木霉rut-c30菌株pyr4基因敲除载体pmdt05-pyr4ko的构建图谱；图3为本发明实施例3中的里氏木霉mus53基因敲除载体pmdt05-mus53ko的构建图谱；图4为本发明实施例4中的中间表达载体pmdt05-26-8-2-01的构建图谱；图5为本发明实施例4中的重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo的构建图谱；图6为本发明实施例5中的显色法检测草酸氧化酶活性的实验结果。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是为了更好地说明阐述本
发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料、试剂如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。本发明实施例中用到的里氏木霉rut-c30(货号atcc56765)购买自广东微生物菌种保藏中心。实施例1：人工设计并合成草酸氧化酶的优化基因本实施例提供一种草酸氧化酶的优化基因，该基因用于编码一种草酸氧化酶，该草酸氧化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。其中，该草酸氧化酶的信号肽序列为seqidno.1所示的1～17位氨基酸序列，来源于里氏木霉rut-c30菌株；该草酸氧化酶的成熟肽序列为seqidno.1所示的18～458位氨基酸序列，来源于虫拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)。进一步的，本实施例提供的草酸氧化酶的优化基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。人工设计并合成该草酸氧化酶的优化基因的过程如下：将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性(参见codonusagedatabase：hypocreajecorina)进行优化，人工设计并合成草酸氧化酶的优化基因，将其命名为troxo，其核苷酸序列如seqidno.2所示，用于编码草酸氧化酶的成熟肽。troxo与优化前的草酸氧化酶基因相比，cai(codonadaptationindex，密码子偏好性参数)由原来的0.53变为0.83。实施例2：构建里氏木霉rut-c30的pyr4基因缺失突变株rut-c30(pyr4-)201、提取里氏木霉rut-c30基因组dna接种里氏木霉rut-c30的新鲜孢子至液体培养基过夜培养，过滤收集菌丝体，无菌水清洗两次，液氮研磨菌丝体，取适量的菌体粉末至1.5ml离心管，使用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒(购于上海生工)分离基因组dna，方法如下：加入200ul的bufferdigestion(消化缓冲液)和2ul的β-巯基乙醇，再加入20ul的proteinasek(蛋白酶k)溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴结束后加入20ul浓度为10mg/ml的rnasea(核糖核酸酶a)，室温放置2～5min。加入100ul的bufferpf(缓冲液pf)，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。室温10000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5ml离心管中。加入200ul的bufferbd(缓冲液bd)，充分颠倒混匀。加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500ulpwsolution，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500ul的washsolution(洗脱液)，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的washsolution。取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50ultebuffer(缓冲液te)静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna溶液，置于-20℃保存。202、构建里氏木霉rut-c30的表达质粒载体pmdt05以pcambia1300质粒为模板，使用下表1中的引物pmdt05-f1和pmdt05-r1进行pcr扩增，得到的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，将约6.8kb的片段从凝胶中切出，按照omega公司凝胶提取试剂盒方法进行回收，回收纯化的片段用限制性内切酶xhoi和xbai消化1h，消化完成后按照omega公司pcr产物回收试剂盒方法进行纯化回收。以上述步骤201中提取的里氏木霉rut-c30基因组dna为模板，使用表1中的引物hyg-pgpd-f和pmdt05-r2扩增启动子pgpd，得到约1.4kb的启动子pgpd片段。以pcambia1300质粒为模板，使用表1中的引物pmdt05-f2和pgpd-hyg-r扩增hygromycin(潮霉素)基因，得到约1kb的hygromycin基因片段。将上述扩增的启动子pgpd片段和hygromycin基因片段按摩尔比1:1混合作为模板，使用引物pmdt05-f2和pmdt05-r2为上下游引物进行soe-pcr扩增(扩增条件为94℃，10min；98℃，10s，60℃，30s，68℃，1min20s，30cycles；68℃，10min)，得到约2.4kb的融合片段，融合片段经过1％琼脂糖凝胶电泳分离，将约2.4kb的片段从凝胶中切出，按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收纯化的片段用限制性内切酶xhoi和xbai消化1h，消化完成后按照omega公司pcr产物回收试剂盒方法进行纯化回收。将上述消化后的6.8kb片段和2.4kb片段按照摩尔比1:3混合，加入t4dna连接酶和连接缓冲液，在22℃下连接3h，将连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，涂布在50μg/ml卡那霉素抗性平板上筛选克隆子，用引物pmdt05-f2和pmdt05-r2进行pcr验证和测序验证，将测序验证正确的质粒载体命名为里氏木霉表达质粒载体pmdt05，载体pmdt05的构建图谱参见图1所示。图1中的英文标记解释如下：pvs1：农杆菌复制起始区；pbr322origin：pbr322复制起始区；kanamycinresistance：卡那霉素抗性基因；camvpoly(a)signal：来源于camv的多聚a尾；lb：左边界序列；rb：右边界序列；hygromycinresistance：潮霉素抗性基因；pgpd：gpd基因启动子。本实施例的步骤202中，制备载体pmdt05所用引物的序列参见表1所示。表1.制备载体pmdt05所用引物的序列203、构建里氏木霉rut-c30菌株pyr4基因敲除载体pmdt05-pyr4ko里氏木霉pyr4基因用于编码乳清酸-5′-单磷酸脱羧酶。参照公开文献(jeffreyl.smith，currgenet,1991,19:27-33)中提供的里氏木霉pyr4基因信息，使用blastn程序检索里氏木霉基因组数据库中pyr4基因所在位置的基因座序列信息(参考http://genome.jgi-psf.org/trire2/trire2.home.html)。以里氏木霉rut-c30基因组dna为模板，利用表2中的引物pyr4-3f/pyr4-3r和pyr4-5f/pyr4-5r分别扩增得到约1.3kb的pyr4基因上游同源臂片段和约1.3kb的pyr4基因下游同源臂片段。将pyr4基因上游同源臂片段和pyr4基因下游同源臂片段按摩尔比1:1的比例混合作为模板，以pyr4-3f和pyr4-5r为上下游引物，soe-pcr扩增得到约2.6kb的pyr4基因敲除盒。将载体pmdt05和上述2.6kb的pyr4基因敲除盒用限制性内切酶xbai和bglii消化1h，将消化后的片段分别用omega公司凝胶提取试剂盒回收，将凝胶纯化的经过xbai/bglii消化的pmdt05载体与消化的2.6kb片段按摩尔比1:3混合，加入t4dna连接酶和连接缓冲液，22℃连接3h，转化大肠杆菌top10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为里氏木霉rut-c30菌株pyr4基因敲除载体pmdt05-pyr4ko，载体pmdt05-pyr4ko的构建图谱参见图2所示，图2中，pyr4表示乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因。204、根癌农杆菌介导法构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株将上述的敲除载体pmdt05-pyr4ko通过冻融法(具体参见文献an,g.et.albinaryvectors,inplantmolecularbiologymanual,1988)转入根癌农杆菌agl-1感受态细胞中，在28℃活化3～4h后取适量的菌液涂布在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的lb平板培养基中，于28℃倒置培养48～72h之后，挑取单克隆接种于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的lb液体培养基中，于28℃摇床220rpm培养24h，取少量菌液作菌落pcr验证筛选阳性转化体。用于转化的根癌农杆菌制备：将上述验证的阳性转化体接种到含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的lb液体培养基中，于28℃摇床220rpm培养20～24h，收集菌体，用im培养基洗涤2次，并用im培养基稀释至od600＝0.15～0.20，添加乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，于28℃下220rpm培养约6～10h至od600＝0.6～0.8。里氏木霉转化受体的制备：用4-5ml无菌水从培养6～7d的pda平板上洗下里氏木霉的孢子，棉花过滤得到孢子悬液，离心收集孢子，用im培养基洗涤2次，并用im培养基重悬并调整至孢子浓度为107个/ml，于28℃萌发培养3～4h。根癌农杆菌和里氏木霉共培养：取制备好的根癌农杆菌菌液100μl与100μl萌发处理的孢子悬液混合，涂布在im固体培养基平板的玻璃纸上，24℃暗培养36h。将玻璃纸揭下，反铺到含有5mg/ml5-foa、300μg/ml头孢霉素和10mm尿苷的固体mm初筛培养基平板上，28℃培养4～6d至转化体长出。转化体复筛：将转化体分别点在含有100μg/ml潮霉素的pda固体平板和含有5mg/ml5-foa和10mm尿苷的固体mm培养基平板上，于28℃培养2～3d，挑取在含有100μg/ml潮霉素的pda固体平板不能生长而在含有5mg/ml5-foa和10mm尿苷的固体mm培养基平板上能正常生长的转化体，提取复筛的转化体基因组dna，用上游同源臂和下游同源臂两端外侧基因组的引物pyr4-cx-f和pyr4-cx-r(序列如表2中所示)进行pcr验证，如果pyr4基因被敲除，扩增出的片段应为约2.8kb，如果没有被敲除扩增出的片段应该为约4.2kb。本实施例一共筛选了23个转化体，经pcr验证所有复筛的转化体都只能扩增出约2.8kb的片段，其中包含既能在含有100μg/ml潮霉素的pda固体平板正常生长也能在含有5mg/ml5-氟乳清酸(5-foa)和10mm尿苷的固体mm培养基平板上正常生长的转化体1个，说明该转化体在发生同源重组的同时也发生了随机整合插入，剔除该转化体，因此pyr4基因有效敲除率达到95.6％。单孢子分离纯化：挑取上述转化体其中一个能扩增到2.8kb的转化体的菌丝体接种到含有10mm尿苷的pda培养基平板中，28℃培养7d至孢子成熟。将成熟的孢子用4～5ml无菌水洗下来，并用无菌水梯度稀释，涂布在含有10mm尿苷和0.1％triton-100的pda培养基平板中，于28℃培养3d，挑取分离的单孢子菌落，重新接种到含有10mm尿苷的pda培养基平板中，于28℃进行生孢子培养。将上述分离的单孢子菌落和pcr检测后仍为阳性的菌株命名为里氏木霉pyr4基因缺失突变株rut-c30(pyr4-)。本实施例的步骤204中，构建载体pmdt05-pyr4ko所用引物的序列参见表2所示。表2.构建载体pmdt05-pyr4ko所用引物的序列本实施例采用的im培养基配方为：10mmol/l的k2hpo4，10mmol/l的kh2po4,，2.5mmol/l的nacl，2mmol/l的mgso4·7h2o，0.7mmol/l的cacl2，4mmol/l的(nh4)2so4，10mmol/l的glucose(葡萄糖)，0.5％的clycerol(丙三醇)，200μmol/l的as(乙酰丁香酮)，1ml/l的mandels微量元素溶液(1000x)，ph5.3。本实施例采用的mm培养基配方为：20g/l的葡萄糖，2g/l的蛋白胨，5g/l的(nh4)2so4，0.6g/l的mgso4·7h2o，0.6g/l的cacl2，15g/l的kh2po4，1ml/l的mandels微量元素溶液(1000x)，ph4.5-5.5。本实施例采用的mandels微量元素溶液(1000x)配方为：5g/l的feso4·7h2o，1.6g/l的mnso4，1.7g/l的znso4·7h2o，3.7g/l的cocl·6h2o。实施例3：敲除里氏木霉rut-c30(pyr4-)菌株中的mus53基因根据公开文献报道(matthiasg.steiger,appliedandenvironmentalmicrobiology,jan.2011,p.114–121)mus53基因(与人类lig4基因同源)为非同源性末端结合(nhej)功能所必需的，其功能的破坏，能够带来将近100％的同源重组效率。在本实施例中，将里氏木霉rut-c30(pyr4-)菌株中的mus53基因进行敲除，为后续定点整合敲入实施例的进行奠定基础。301、构建里氏木霉mus53基因敲除载体pmdt05-mus53ko参照公开文献中提供的里氏木霉mus53基因(proteinid:58509)信息(matthiasg.steiger，appliedandenvironmentalmicrobiology,jan.2011,p.114–121)，检索里氏木霉基因组数据库中mus53基因所在位置的基因座序列信息(http://genome.jgi-psf.org/trire2/trire2.home.html)。以里氏木霉基因组dna为模板，利用表3中的引物mus53-3f/mus53-3r和mus53-5f/mus53-5r分别扩增得到约1.4kb的mus53基因上游同源臂up片段和约1.3kb的mus53基因下游同源臂down片段，用引物mus53-mid-f/mus53-mid-r扩增mus53基因座约1.3kb的middle片段。以里氏木霉基因组dna为模板，用引物pyr4-tprc-f/pyr4-r扩增约1.5kb的pyr4基因编码区和其终止子，以质粒pbargpe1为模板，用引物pyr4-f/pyr4-trpc-r扩增386bp的ptrpc启动子。将上述5段pcr扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后按照等摩尔比混合作为pcr扩增模板，用引物mus53-3r/mus53-mid-f为上下游引物soe-pcr扩增约6.1kb的融合片段，并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收目的片段。将质粒pmdt05用限制性内切酶ecori和xbai消化3h，凝胶回收载体骨架片段，并与回收的6.1kb片段按照ii一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌top10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pmdt05-mus53ko，载体pmdt05-mus53ko的构建图谱参见图3所示。图3中的英文标记解释如下：m13fwd：m13测序序列；up：上游同源臂片段；down：下游同源臂片段；middle：中间同源臂片段。302、敲除里氏木霉pyr4基因缺失突变株rut-c30(pyr4-)中的mus53基因根据实施例2中的方法和步骤，将mus53基因敲除载体pmdt05-mus53ko通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉rut-c30(pyr4-)株，得到294个转化体，将各个转化体分别点板到固体mm培养基(300μg/ml头孢霉素和200μg/ml潮霉素)平板和固体mm培养基(300μg/ml头孢霉素)平板上复筛，28℃培养3d，得到44个没有潮霉素抗性的转化体，挑选其中的31个转化体转接到pda平板，于28℃下培养7d。通过引物mus-f/trpc-cx-f和pyr4-lb-r/mus-r做pcr筛选所有31个转化体，以确定是否在mus53基因座位点通过up与middle区域发生同源重组。通过引物rb-yz-f和引物rb-yz-r做pcr扩增筛选转化体，以确定是否在mus53基因座位点外发生随机整合。本实施例中，对于各个转化体，通过从培养到第3天的pda平板上提取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清作为模板，用引物mus-f/trpc-cx-f和pyr4-lb-r/mus-r能分别扩增到约3.1kb和1.6kb片段的说明在相应区域发生了预期形式的同源重组，同时用引物rb-yz-f和引物rb-yz-r不能扩增到425bp的片段，说明没有发生随机整合，本实施例中筛选到同时满足这些条件的阳性转化子15株。将其中一个阳性转化子接种到含有10mm尿苷的pda培养基上，于28℃下培养7d至孢子成熟，用4-5ml无菌水洗下孢子制成孢子悬液，取适量孢子悬液涂布在含有5mg/ml5-foa，0.1％trinton-100和10mm尿苷的pda培养基上，28℃培养4-5d至长出单菌落，选择其中3个菌落转接到含有10mm尿苷的pda培养基上，于28℃培养7d至孢子成熟。用引物mus-f/mus-r做pcr鉴定发生同源重组切除pyr4表达框的菌落，发生同源重组切除pyr4表达框的能扩增到约2.9kb的片段，结果表明3个菌落均已切除pyr4表达框。将验证的阳性菌株命名为里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株rut-c30(pyr4-，mus53-)。本实施例中构建mus53基因敲除载体所采用的引物序列见表3。表3.构建mus53基因敲除载体所用引物的序列实施例4：采用草酸氧化酶的优化基因troxo构建重组表达载体本实施例提供一种包含有草酸氧化酶的优化基因troxo的重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo，该重组表达载体的构建过程如下：401、构建中间表达载体pmdt05-26-8-2-01以里氏木霉rut-c30基因组为模板，pcr扩增上下游同源臂，使用引物26-up-f和26-up-r扩增上游同源臂，使用引物26-down-f和26-down-r扩增下游同源臂，得到上下游同源臂的扩增产物，使用引物pyr4-f2和26-pyr4-r扩增里氏木霉cbh1基因启动子pcbh1的500bp序列作为重复序列(dr)。以载体pmdt05-mus53ko为模板，使用引物26-pyr4-f和pyr4-r2扩增pyr4基因表达框，得到pyr4基因表达框的扩增产物。所有pcr扩增产物包括上下游同源臂的扩增产物、重复序列、pyr4基因表达框的扩增产物，将所有pcr扩增产物按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为pcr扩增模板，用引物26-up-f和26-down-r为上下游引物soe-pcr扩增约4.4kb的融合片段。使用引物pmdt-spei-r和pmdt-xbai-f扩增载体pmdt05进行线性化，扩增产物用dpni消化3h。将上述约4.4kb的融合片段和载体pmdt05的扩增产物一并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照ii一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌top10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为中间表达载体pmdt05-26-8-2-01，载体pmdt05-26-8-2-01的构建图谱参见图4所示。图4中的英文标记解释如下：dr：重复序列；tpyr4：pyr4基因终止子。402、构建重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo以里氏木霉rut-c30基因组dna为模板，pcr扩增pcbh1启动子和tcbh1终止子，采用引物oxo-pcbh-f和pep-troxo-r2扩增pcbh1，采用引物26-troxo-f和oxo-tcbh-r扩增tcbh1。以实施例1中人工合成的草酸氧化酶的优化基因troxo为模板，以oxo-tcbh-f和oxo-pcbh-r为引物，pcr扩增基因troxo。所有pcr扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为pcr扩增模板，用引物26-troxo-f和pep-troxo-r2为上下游引物soe-pcr扩增约4.7kb的融合片段。使用限制性内切酶bamhi酶切中间表达载体pmdt05-26-8-2-01。将上述soe-pcr扩增的4.7kp片段和酶切载体按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照ii一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌top10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo，载体pmdt05-26-8-2-troxo的构建图谱参见图5所示。图5中的英文标记解释如下：trpcpromoter：trpc启动子；pcbh1：cbh1基因启动子；tcbh1：cbh1终止子；troxo：草酸氧化酶的优化基因。本实施例中构建中间表达载体所采用的引物序列参见表4所示。表4.构建中间表达载体所用引物的序列实施例5：构建重组表达草酸氧化酶的里氏木霉基因工程菌本实施例提供一种重组表达草酸氧化酶的里氏木霉基因工程菌，该基因工程菌的宿主细胞为里氏木霉rut-c30，其中含有重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo。该基因工程菌的构建过程如下：根据实施例2中的方法和步骤，将实施例4中构建的重组表达载体pmdt05-26-8-2-troxo通过农杆菌介导转化的方法转化实施例3中构建的里氏木霉菌株rut-c30(pyr4-，mus53-)，挑取28个转化体点板到含有300μg/ml头孢霉素的固体mm培养基平板上复筛，28℃培养3d，挑取其中15个生长良好的转化体菌丝点板至pda平板，28℃生孢培养7d。通过引物26-8-2-f/hc2-jd-f和pyr4-lb-r/26-8-2-r做pcr筛选这15个转化体，以确定是否在特异位点通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组。通过引物rb-yz-f和引物rb-yz-r做pcr扩增筛选转化体，以确定是否发生随机整合。本实施例中，对于各个转化体，通过从培养到第3天的pda平板上提取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清作为模板，用引物26-8-2-f/hc2-jd-f和pyr4-lb-r/26-8-2-r能分别扩增到约1.2kb和1.6kb片段的说明在相应区域发生了预期形式的同源重组，同时用引物rb-yz-f和引物rb-yz-r不能扩增到425bp的片段，说明没有发生随机整合，本实施例中筛选到同时满足这些条件的阳性转化子即为重组表达草酸氧化酶的里氏木霉基因工程菌。本实施例所采用的引物序列参见表5所示。表5.构建里氏木霉基因工程菌所用鉴定引物的序列26-8-2-fgcttcttctgtgctttgaccgg(seqidno.47)hc2-jd-f2gaatgtgctgcctccaaaatcctgcg(seqidno.48)pyr4-lb-rgcatttgcttttgcgcgtggag(seqidno.27)26-8-2-rcacagagcgagtgctgtttcgc(seqidno.49)rb-yz-fgtggattcggccaaaggactccg(seqidno.29)rb-yz-rgtttaaactgaaggcgggaaacgac(seqidno.30)实施例6：发酵和酶活力检测601、里氏木霉工程菌摇瓶发酵从-80℃取出冻存的重组菌株孢子悬液和里氏木霉野生菌rut-c30孢子悬液于室温下解冻，用移液器分别吸取10ul点至新鲜的pda平板正中央，在28℃培养7天至孢子成熟，然后用5ml无菌水洗下孢子。接种孢子悬液于20ml种子培养基，28℃，170rpm震荡培养24h，然后转接至m13发酵培养基，在28℃、170rpm震荡条件下培养168h，离心收集发酵液上清，进行酶活力检测。本实施例采用的m13发酵培养基配方为：5g/l的葡萄糖、23g/l的微晶纤维素、5g/l的玉米浆粉、1g/l的硫酸铵、1g/l的尿素、2g/l的麸皮、6g/l的kh2po4、1.56g/l的mgso4·7h2o、0.5g/l的cacl2、0.1％的mandels微量元素溶液、1mm的mncl2。602、酶活检测本实施例参考的酶活检测方法为：利用trinder反应可以检测草酸氧化酶的活力，又称“偶联终点比色法”，其原理为草酸通过草酸氧化酶作用产生的过氧化氢(h2o2)在4-aap(4-氨基替比林)、pod(过氧化物酶)/hrp(辣根过氧化物酶)的存在下，可生成红色醌亚胺化合物。可直观的通过有无红色反应从而判断活力有无。将40mg/ml的ph5.0的hrp，48mm的ph5.9的dhbs(3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)，800mg/ml的ph6.0的4-aap，50mm的ph5.0的柠檬酸钠，5mm的ph5.0的草酸钠这5种成分1:1:1:1:1混合，调节ph至4.0，现配现用，即为草酸氧化酶显色液。将发酵液上清与草酸氧化酶显色液按1：9混合，置于37℃反应，观察是否变为红色。hplc法测定草酸氧化酶活力：取40μl样品与360μl的12mm的草酸溶液(用naoh调节至ph4.0)混匀后，37℃反应48小时，反应液加终止液(100μl1.5m硫酸溶液)终止反应。反应液经高速离心去除沉淀，上清液过0.4μm膜后用hplc测定草酸含量。一个酶活单位(u)定义为在上述体系中每分钟降低1微摩尔草酸所需要的酶量。本实施例的酶活检测过程如下：按照上述检测方法，取90ul显色液于1.5ml离心管中，加入10ul发酵液上清，充分混匀后，置于37℃恒温金属浴上反应。采用的实验样本1～4为4瓶工程菌发酵液上清，采用的阳性对照样本为草酸氧化酶溶液，采用的阴性对照样本为里氏木霉野生菌rut-c30相同培养条件下的发酵液上清。本实施例的检测结果为：参见图6所示，实验样本1～4和阳性对照样本在2min内就出现紫红色，而阴性对照样本没有颜色变化，说明troxo在本发明实施例5构建的基因工程菌中得到高效表达，产生了草酸氧化酶。通过hplc法检测摇瓶发酵168h发酵液上清，测得草酸氧化酶活力可达到6000u/l。实施例7：本实施例提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌在制备草酸氧化酶中的应用。采用所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌制备草酸氧化酶的过程为：采用实施例5中的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，按照实施例6的步骤601进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。实施例8：本实施例提供一种草酸氧化酶，该草酸氧化酶用于降解草酸或草酸盐。该草酸氧化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，编码该草酸氧化酶成熟肽的核苷酸序列如seqidno.2所示。该草酸氧化酶的制备过程为：采用实施例5中的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，按照实施例6的步骤601进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。实施例9：本实施例提供一种药物组合物，用于预防或治疗草酸过多的疾病。该药物组合物包含有一种草酸氧化酶，该草酸氧化酶用于降解草酸或草酸盐，其氨基酸序列如seqidno.1所示，编码该草酸氧化酶成熟肽的核苷酸序列如seqidno.2所示。该草酸氧化酶的制备过程为：采用实施例5中的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，按照实施例6的步骤601进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种修改和变型，倘若这些修改和变型在本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则这些修改和变型也在本发明的保护范围之内。说明书中未详细描述的内容为本领域技术人员公知的现有技术。序列表<110>武汉康复得生物科技股份有限公司<120>重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用<160>49<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>458<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1mettyrarglysleualavalileseralapheleualathralaarg151015alaargprothrglyasnaspvalphetyrleuproargalavalala202530valserseralaglyalaserserproalaserleuserserglythr354045gluserserseralaalagluprothrgluthrvalprophealaser505560aspaspproasnproargleutrpasnileaspthrglnaspleuser65707580valvalalaprogluargglyproleuglyalalysileileglypro859095aspasnleuproleuaspileglnasnalaaspthrleualapropro100105110thrthraspserglyserileproasnalalystrpprophealaleu115120125serhisasnthrleutyrthrglyglytrpvalargileglnasnasn130135140gluvalleuproilealalysalametalaglyvalasnmetargleu145150155160glualaglythrilearggluleuhistrphisasnthrproglutrp165170175alatyrileleulysglythrthrglnilethralavalaspgluasn180185190glylysasntyrleualaasnvalglyproglyaspleutrptyrphe195200205progluglymetprohisserleuglnglythrasnalaseraspglu210215220glyserglupheleuleuilepheproaspglythrpheaspalaser225230235240asnglnphemetilethrasptrpleualahisthrprolysaspval245250255ilealalysasnpheglyvalaspileserglupheaspargleupro260265270serhisaspleutyrilepheproglyvalalaproproleuaspala275280285thralaprogluaspproglnglythrileproleuprotyrserphe290295300glupheserlysvalvalprothrglntyralaglyglythrvallys305310315320ilealaaspthrargthrpheproileserlysthrileservalala325330335gluilethrvalgluproglyalametarggluleuhistrphispro340345350thrgluaspglutrpthrphepheilegluglyglnalaargvalthr355360365leuphealaglygluserasnalaglnthrtyrasptyrglnglygly370375380aspilealatyrileprothralatyrglyhistyrvalgluasnser385390395400glyasnthrthrleuargpheleugluilepheasnserproleuphe405410415glnaspvalserleuthrglntrpleualaasnthrproargalaile420425430vallysalathrleuglnleuseraspasnvalileaspserleuasn435440445lysserlysalaphevalvalalaserasp450455<210>2<211>1377<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgtaccgcaagctcgccgtgatcagcgccttcctcgctactgctcgcgctcgacctacc60ggcaacgatgtcttctacctcccccgcgctgtcgctgtctcttctgctggcgcttcctcc120cctgcttccctctcttctggcaccgagtcctcctccgctgctgagcctactgagaccgtc180cctttcgcctccgacgaccctaaccctcgactctggaacatcgatactcaggacctctcc240gtcgtcgcccctgagcgaggccctctcggcgctaagattattggccccgacaacctcccc300ctcgatatccagaacgccgacaccctcgcccctcctactactgattccggctccatcccc360aacgccaagtggcctttcgccctctctcacaacaccctctacaccggcggctgggtccga420attcagaacaacgaggtcctccccatcgccaaggccatggctggcgtcaacatgcgactc480gaggccggcactatccgcgagctccactggcacaacacccctgagtgggcttacatcctc540aagggcaccacccagatcaccgccgtcgatgagaacggcaagaactacctcgccaacgtc600ggccctggcgatctctggtacttccctgagggcatgccccactccctccagggcactaac660gcttctgacgagggcagcgagttcctcctgatctttcccgacggcacctttgacgcctcc720aaccagtttatgattaccgactggctcgctcacacccccaaggatgtcatcgccaagaac780ttcggcgtcgacatcagcgagttcgaccgcctccctagccacgatctctacattttcccc840ggcgtcgccccccctctcgatgctactgctcctgaggacccccagggcactatccctctc900ccttactccttcgagttctccaaggtcgtccccacccagtacgccggcggcactgtcaag960attgccgacactcgcaccttccccatctccaagaccatctccgtcgccgagatcaccgtc1020gagcctggcgctatgcgagagctccactggcaccctaccgaggatgagtggaccttcttc1080attgagggccaggcccgcgtcaccctctttgctggcgagtctaacgcccagacctacgat1140taccagggcggcgatattgcctacatccccaccgcttacggccactacgtcgagaacagc1200ggcaacaccaccctccgattcctcgagatctttaacagccccctcttccaggacgtctct1260ctcacgcagtggctcgctaacaccccccgagctatcgtcaaggccaccctccagctcagc1320gacaacgtcatcgacagcctcaacaagagcaaggccttcgtcgtcgccagcgattaa1377<210>3<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gctctagatctagaaagcttactagtggcactggccgtcgttttacaacg50<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaccggatctgtcgatcgacaagc24<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列(artificia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