重组草酸盐降解酶的纯化和分离以及含有草酸盐降解酶的喷雾干燥粒子的制作方法

专利名称：重组草酸盐降解酶的纯化和分离以及含有草酸盐降解酶的喷雾干燥粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含减少草酸盐的酶的喷雾干燥的粒子，所述粒子用于将活性形式的酶递送至胃，减少草酸盐的酶在那里发挥其作用。因而，本发明提供了用于减少胃中的草酸盐的手段。此外，本发明涉及分离重组蛋白的方法，所述重组蛋白在宿主细胞的细胞质中不溶，并且不作为被视为无活性、错误折叠的蛋白沉淀物的包含体存在，所述方法包含a)将不作为包含体存在的不溶性重组蛋白与可溶性宿主细胞蛋白分离开；以及b)溶解分离的重组蛋白。
背景技术：
肾/尿路结石疾病(尿石症)是世界范围内的主要健康问题。大多数与尿石症相关的结石由单独的草酸钙组成，或由草酸钙加磷酸钙组成。其他疾病状态也与过量草酸盐有关。他们包括外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、克罗恩病 (Crohn，s disease)以及其他肠道疾病状态。草酸和/或其盐、即草酸盐，发现于各种不同食物中，并因而是人类和动物膳食中许多组分的成分。在食用了含有增加量草酸的食物后可能会发生草酸盐吸收增加。众所周知，诸如菠菜和大黄的食物含有大量草酸盐，但是大量其他食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时也可口的食物难以配制出来。此外，依从低草酸盐的膳食常常也是成问题的。形成肾结石的风险围绕着大量尚未完全理解的因素。在西方国家中，在多达12% 的人群中发生肾或尿路结石疾病，并且这些结石中约70%由草酸钙或草酸钙加磷酸钙组成。一些个体(例如患有诸如克罗恩病、炎性肠病或脂肪痢的肠道疾病的患者，以及已经历空肠回肠绕道术的患者)在其膳食中吸收了比其他个体更多的草酸盐。对于这些个体来说，草酸盐尿石症的发病率显著增加。发病率的增加是由于肾脏和尿液中草酸盐水平的增加，并且这种在人类中最常见的高草酸盐尿综合征被称为肠原性高草酸盐尿。在患有终末期肾病的患者中草酸盐也是问题，并且近来有证据表明尿液草酸盐升高也涉及到外阴前庭炎(外阴痛)。已经建议将包含减少草酸盐的细菌的肠溶包衣的或其他组合物，用于在通过肠道期间在被系统吸收之前降低草酸盐浓度。肠溶包衣组合物以完整形式通过胃，即包衣是完整的，因此不在胃中降解草酸盐。更好的方法是在草酸盐在肠道中被吸收之前，在胃中减少草酸盐。因此，对于开发能够减少胃中的草酸盐以便减少例如膳食草酸盐的组合物，存在着需求。此外，这样的组合物适用于治疗肠原性和吸收性高草酸盐尿，例如引起复发性结石病的高草酸盐尿。这种治疗的目的是使患者具有正常或至少降低的尿液草酸盐水平。发明概述本发明涉及包含草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子。喷雾干燥的粒子适用于药物和 /或食品组合物，用于将活性形式的酶递送至胃并在胃中降解草酸盐。因此，本发明还提供了通过给药喷雾干燥的粒子或包含它们的组合物来治疗和预防草酸盐相关病症的方法。
本发明还提供了用于分离和纯化在宿主细胞的细胞质中不溶或仅仅微溶、并且不作为宿主细胞的包含体存在的重组蛋白的方法。重组蛋白尤其是重组的草酸盐降解酶。


图I是通过分段梯度盐洗脱从苯基-琼脂糖凝胶柱洗脱的野生型OxDC的色谱图。 峰I和峰2都含有OxDC，但是峰I含有80-90 %的OxDC，具有较高比活性(50_60U/mg纯 OxDC)，而峰2含有30-70 %的OxDC,具有较低比活性(30_50U/mg纯OxDC)。峰2中的OxDC 据推理是受损或不正确折叠的。峰3是杂质(峰1-3在虚线曲线上标出)。不同曲线用点、 三角形、正方形、菱形和十字标出。图2是显示喂食Omg草酸盐(基线，无ox)、2. 3%草酸钾(HOD)和联合的本发明的草酸脱羧酶粒子(Oxazyme)与2. 3%草酸钾的大鼠的草酸盐平均尿液排泄的图。尿液草酸盐针对肌酸酐进行归一化，并且其是从第4至9日收集的累积尿液。Ox/Cr是草酸盐/肌酸酐。发明详述正如上面显示的，本发明提供了 i)用于分离和纯化重组蛋白、尤其是草酸盐降解酶的方法，ii)包含一种或多种草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子，以及iii)包含这样的粒子的组合物。因此，本发明是以前描述的用于治疗草酸盐相关疾病的组合物和方法的进一步发展，以前的组合物和方法参见例如WO 2007/075447(属于同一申请人)。此外，本发明人令人吃惊地发现，野生型草酸脱羧酶的特定突变、尤其是用丝氨酸、丙氨酸或精氨酸代替383 位中的半胱氨酸残基，使酶具有在酶的分离和纯化中特别有利的物理化学性质。因此，本发明的分离和纯化方法包含比正常情况下看到的更少的步骤，并利用了酶在细胞质和纯化介质中的溶解度差异。此外，本发明人发现了将活性草酸盐降解酶递送至胃的更简单的解决方案。在WO 2007/075447(属于同一申请人)中，描述了含有具有一定草酸盐降解酶含量的粒子的组合物。粒子含有各种聚合物的组合，并通过多层聚合物和/或通过将聚合物交联来加强对胃中的胃蛋白酶和PH的抗性，从而针对胃中的严苛环境进行保护。然而，已经开发了更简单的解决方案，其利用了非常特殊的聚合物组、尤其是聚(甲基)丙烯酸酯与一种或多种草酸盐降解酶组合。粒子使用温和方法即喷雾干燥来制备。即使通过将酶掺入到喷雾干燥的粒子中可能不能完全保护酶抵抗胃中的环境，但本文的实施例显示出在喷雾干燥方法后和暴露于模拟胃环境后的显著活性。定义当在本文中使用时，术语“减少草酸盐的酶”旨在表示能够减少草酸盐的任何酶。 它本身可以减少草酸盐，和/或它可以在减少草酸盐的途径中起作用。在本发明的文本中， 术语“草酸盐”涵盖草酸和/或其任何盐(草酸盐)。本发明考虑到了使用任何已知的草酸盐减少或降解酶。在本发明的粒子、组合物和方法中使用的酶包括但不限于草酸氧化酶、草酸脱羧酶(缩写为OxDc)、草酰辅酶A脱羧酶或甲酰辅酶A转移酶或其组合，无论是天然的还是突变的。此外，作为草酸盐降解途径的替代物或参与草酸盐代谢途径、特别是草酸盐减少的其他酶、辅因子和辅酶，也可以单独涉及或与一种或多种上面提到的酶组合使用。在本发明的情形中，本发明所考虑到的不仅是该定义所涵盖的酶，而且包括编码减少草酸盐的基因和蛋白质的多核苷酸序列。本发明还考虑到这些酶的任何结合配偶体，并包括与所述酶结合或相互作用的抗体和抗体片段。酶可以通过从生物体分离来产生，它们可以被纯化，它们可以通过合成、半合成或通过重组手段制造，或者它们可以作为细胞裂解物使用。通常情况下，酶将作为纯化的重组蛋白使用。当在医学应用(作为药物)或食品(作为食品增补剂、功能食品或作为预防措施)中使用时，优选情况下所使用的一种或多种酶在纯度和活性方面是明确确定的。一般使用来自三种主要草酸盐降解酶类型的突变或野生型的一种或多种酶。草酸氧化酶在高等植物中表达，催化草酸盐向CO2的氧依赖性氧化，并伴有H2O2形成。该反应形成了当前用于检测尿液草酸盐水平的测定法的基础。已经开发出一种rOxOx三步纯化方法，用于从大麦根获得草酸氧化酶。该酶也存在于甜菜的茎和根、苋属植物的叶、高粱和许多其他谷物中。草酸脱羧酶(EC 4. I. I. 2)是第二种类型的草酸盐代谢酶。主要存在于真菌中。它已在几种真菌中报道和表征，例如抚孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、黑曲霉 (Aspergillus niger)的某些株白腐真菌、杂色革盖菌(Coriolus versicolor)和金针燕 (Collybia velutipes)。这些酶在氧依赖性反应中将草酸盐转变成甲酸盐和二氧化碳。草酸脱羧酶也已经用于血液和尿液中草酸盐的临床测定，并可用于降低食品和环境中的草酸盐水平。已将YvrK蛋白(枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的草酸脱羧酶)在大肠杆菌(E. coli) 表达为有功能的重组蛋白，纯化至均质并充分表征。草酰辅酶A脱羧酶作用于辅酶A-活化底物，并将其转变成甲酰辅酶A。甲酰辅酶A转移酶随后作用以交换辅酶A上的甲酸盐和草酸盐。已经在减少草酸盐的细菌、 即通常存在于土壤中的草酸假单胞菌(Pseudomonas oxalaticus)和驻留于脊椎动物和人类GI胃肠道中的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)中对这些酶进行了研究。这些酶已经在“草酸盐代谢酶类出人意料的结构和代谢”(The enzymes of oxalate metabolism !Unexpected structures and metabolism, Svedruzic D.等，Arch Biochem Biophys. 2005Jan I ；433(1) :176-92)中进行了充分综述，该文献在此以其全文引为参考。 不论是天然酶、分离的蛋白质还是通过重组技术制造的酶，都可以通过重组或化学手段修饰，并可以包含侧基或其他悬垂的分子。例如，可以将酶修饰成具有用于附着到其他分子或化学化合物上的连接分子。正如在本文实施例中所显示的，产生383位半胱氨酸的替代氨基酸的草酸脱羧酶的特定突变是有利的(例如C383S、C383A、C383R)。因此，这样的重组酶在本发明的各个方面中是特别重要的。当在本文中使用时，术语“酶”的单数形式是指酶的多个拷贝，正如在蛋白质分子的指称中所通常理解的。当在本文中使用时，酶包括重组酶蛋白。当在本文中使用时，术语“一种或多种酶”是指可以存在一种类型的酶，例如甲酰辅酶A转移酶是所需的，或者在组合物中存在一种以上类型的酶，例如组合物包含例如草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶、草酸脱羧酶和草酸氧化酶、或野生型酶与突变酶的组
6合 O术语“包含体”(其也可以被称为“蛋白质包含体”或“细胞质包含体”)是指由存在于细胞的细胞质中的不溶性多肽链的聚集所形成的物体。这样的包含体可以在作为宿主用于重组生产外来蛋白的原核细胞中看见。目前相信，包含体中的大部分重组蛋白是错误折叠或无生物活性的，尽管在重组生产的荧光蛋白中已观察到一些活性。从上可以明显看出，本发明不涉及当在宿主例如大肠杆菌中表达时以无活性包含体存在的重组蛋白，因此本发明涉及以能够形成酶活性形式的折叠状态表达和产生的重组酶。术语“粒子”在本发明中用于描述含有与聚合物组合的一种或多种类型的减少草酸盐的酶的组合物。一般来说，术语“粒子”作为最广泛的术语使用，即没有任何特定尺寸或形状归属。术语“喷雾干燥的粒子”是指通过喷雾干燥方法获得的粒子。必须指出，当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，不带任何具体数量的指称包括其复数形式，除非上下文明确指出不是如此。分离和纯化重组蛋白、尤其是草酸盐降解酶的方法本发明提供了用于从宿主细胞分离和纯化重组蛋白的方法。方法包含使用有效并且简化的步骤来纯化减少草酸盐的酶，所述步骤导致蛋白收率提高。重组蛋白可以包括突变的减少草酸盐的酶。本发明的方法针对作为活性酶蛋白存在于宿主细胞的细胞质中的重组蛋白，其不溶于细胞质中并表现为沉淀，但是不形成为包含体。这样的蛋白被认为在宿主细胞的细胞质中是不溶或仅仅微溶的。本发明的一个方面包含宿主细胞的裂解和重组蛋白与可溶性细胞质蛋白的易化分离。分离可以通过细胞质的离心或过滤容易地实现。在分离后，优选通过包括但不限于添加结合配体或改变pH的方法使重组蛋白溶解。一旦溶解后，可以通过例如沉淀将蛋白从溶液中移除，并储存或使用在例如本文公开的粒子中。本发明的方法包含用于分离和纯化重组的减少草酸盐的酶、例如突变的重组的减少草酸盐的酶蛋白的方法。重组蛋白在大肠杆菌中的表达常常引起蛋白质离析在包含体中，这是因为包含体中的蛋白质与可溶性重组蛋白相比，为细胞引起的有毒负担小得多。由于不溶形式，包含体中的蛋白质也较不容易被大肠杆菌的蛋白酶降解。然而，从包含体重新折叠蛋白质以产生有活性的酶，相当具有挑战性。如果在表达期间蛋白质能够以活性、但是在大肠杆菌细胞中不溶或仅仅微溶的形式表达，并且不作为包含体存在，那么蛋白质表达可以达到与形成包含体时所观察到的相似的水平。在细胞质中具有有限溶解性、因此在细胞的细胞质中沉淀的蛋白质，将不需要重折叠步骤。例如，草酸脱羧酶(OxDC)野生型重组蛋白在大肠杆菌细胞质中具有一定水平的溶解性，小部分(5%，表I)作为可溶性蛋白存在于细胞裂解物中，大部分(95%，表I)作为不溶性蛋白存在于破碎的细胞沉淀物中。不溶性部分可以溶解在高盐浓度例如IM NaCl 或O. 75M (NH4)2SO4中，并且溶解的OxDC含有两种主要形式，其可以通过疏水相互作用层析 (HIC)柱分离(图I)。两个OxDC峰都有活性，但是在较高盐浓度下洗脱的峰(峰1，图I) 中的OxDC显示出高出约20%的比活性。看起来，在较低盐浓度下洗脱的峰(峰2，参见图 I)中的OxDC是受损的。该蛋白级份更加疏水并且活性更低。细胞质中的可溶性蛋白更容易受到蛋白酶水解、其他酶催化反应、化学反应和物理修饰的损伤。
作为包含体表达的蛋白质已广泛报道，但是关于如何将蛋白表达成不溶或微溶例如沉淀状态和有活性形式，没有报道。使重组蛋白在宿主的细胞质中具有较低溶解性，产生了简化的蛋白质纯化方法。因为重组蛋白不溶或具有较低溶解性，因此一般作为宿主细胞裂解后的第一步，通过离心或过滤容易地分离宿主生物体例如大肠杆菌的可溶性蛋白。存在于离心沉淀物或过滤后的残留物中的不溶或微溶重组蛋白可以进行处理，例如使用选择性缓冲液溶解。通过选择PH和/或筛选特异性结合配体来发现选择性缓冲液。当pH接近 Pl时，许多蛋白质具有非常有限的溶解性，但是当PH高于或低于pi超过2个pH单位时具有增加的溶解性。也可以通过将沉淀悬浮在含有结合配体的溶液中来改变蛋白溶解性。例如，对于野生型重组蛋白来说，OxDC在pH4. 5-7. 8下具有有限溶解性，对于C383S突变蛋白来说，该范围为PH4. 0-8. O。C383表示草酸脱羧酶氨基酸序列中第383氨基酸位置处的半胱氨酸。S表示半胱氨酸已被丝氨酸代替。对于野生型OxDC来说，如果pH高于8. 5，OxDC 溶解性增加，而对于C383S突变体来说，该pH为9. O。Tris和精氨酸是OxDC的选择性结合配体。使用它们中的任一种将增加OxDC溶解性。本发明的方法包含纯化步骤，所述纯化步骤包含添加结合配体或改变介质的pH，以协助溶解存在于离心后的沉淀物或宿主细胞可溶性蛋白过滤后的存留物中的酶或蛋白质。此外，这种用于分离减少草酸盐的酶的突变重组蛋白的方法可以导致回收的蛋白量增加，并高于使用减少草酸盐的酶的重组野生型蛋白时所观察到的量。方法通常也具有较少的步骤，以使更简单的纯化方法成为可能。例如，通过例如离心或过滤，将宿主生物体例如大肠杆菌的可溶性蛋白与在宿主细胞的细胞质中不溶或溶解性比宿主蛋白质低的重组蛋白分离开。突变的减少草酸盐的重组蛋白可能以其他方式有别于野生型重组蛋白，例如突变的蛋白可能不形成引起聚集体形成的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，替换草酸脱羧酶中的半胱氨酸氨基酸产生不能形成二硫键的突变蛋白，导致更少至没有蛋白聚集体。本发明方法的实例包含制造减少草酸盐的酶的重组突变蛋白的宿主细胞的裂解。 在宿主细胞例如大肠杆菌细胞裂解后，通过例如过滤或离心除去所有可溶性宿主蛋白质。 在宿主细胞的细胞质中不溶或仅仅微溶并且不作为包含体存在的重组蛋白，例如减少草酸盐的酶的突变重组蛋白，存在于离心沉淀物中或作为过滤中的存留物。然后溶解突变蛋白， 例如通过用选择性缓冲液或结合配体或本领域技术人员已知的其他方法进行溶解。选择性缓冲液可以例如通过PH参数来确定。当pH接近pi时，许多蛋白质具有有限的溶解性，但是当pH高于或低于pi超过2个pH单位时具有增加的溶解性。例如,对于野生型重组蛋白来说，OxDC在pH 4. 5-7. 8下具有有限溶解性，对于C383S突变重组蛋白来说，该范围为pH 4. O-8. O ο溶解作用也可能受到蛋白结合配体的影响。当溶液中存在结合配体时，蛋白质溶解性可能改变。这种性质可以应用于通过选择性沉淀和溶解进行的蛋白质纯化。特定蛋白质的结合配体可以通过本领域技术人员已知的方法来发现，所述方法例如差示扫描量热术、UV光谱术、红外光谱术、荧光光谱术和检测配体与蛋白质相互作用的其他方法。例如， 存在大量能够与OxDC结合并影响溶解性的化学化合物和离子，例如Tris、精氨酸、Mn2+、Mg2+ 和Ca2+。优选情况下使用不抑制酶活性的化合物或离子，或者如果化合物或离子抑制活性， 容易地移除所述化合物或离子以回收活性酶蛋白。例如，对于野生型OxDC来说，当pH高于 8. O时Tris和精氨酸不抑制OxDC活性并增加OxDC溶解性，而对于OxDC的C383S突变体来说，该pH为8. 5。本发明的用于分离和纯化减少草酸盐的酶的突变重组蛋白的方法可以包含下列一种或两种，在宿主细胞质中重组突变蛋白的低溶解性，和在改变溶解条件例如添加结合配体和/或调整pH后减少草酸盐的酶的突变重组蛋白的高溶解性。在目前使用的用于分离和纯化重组蛋白的方法中，在使用大层析柱时常常出现问题，所述大层析柱对于构造和在大规模分离和纯化所需的规模下操作提出挑战。在实施例I 中证实了这种方法。消除这样的步骤将导致纯化成本降低和更简单的方法，其演示在实施例4中。本发明的方法包含从宿主细胞分离或纯化重组蛋白。分离的方法包含分离在宿主生物体的细胞质中微溶至不溶的重组蛋白。分离步骤包含获得宿主细胞裂解物，通过例如重悬浮裂解物并将其离心以形成裂解物沉淀来洗涤裂解物；将裂解物沉淀悬浮在蛋白溶解介质，例如含有结合配体或改变蛋白质的PH响应(例如增加蛋白质溶解性)的其他化合物的介质中；将混合物离心，并将对液相而不是不溶性的沉淀物进行作用。从液相移除重组蛋白。例如，调整液相的PH并将重组蛋白从溶液中沉淀出来。不溶性沉淀物可以重新提取多次以形成液相，从中通过例如沉淀来移除重组蛋白。移除的蛋白质可以洗涤一次或多次，并储存或在需要时使用。通过本文教导的方法分离到的，在细胞质中不溶或仅仅微溶并且不作为宿主细胞例如大肠杆菌的包含体存在的酶，可以包含非天然的或突变的减少草酸盐的酶的重组蛋白，其包含修饰或突变，包括但不限于使用含有减少草酸盐的酶的减少草酸盐的活性位点的结构域或肽片段、尤其是包含活性位点或由活性位点构成的肽片段所形成的嵌合体；修饰或突变，包括但不限于用于增加活性的缺失、插入、取代、反转、突变、用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸，或本领域技术人员已知的其他修饰。这类修饰过的酶可以具有与天然酶相比更高、更低或相等的活性，或者可以具有与天然或未经修饰的酶相同或不同的特性。本发明考虑到的方法和组合物包含减少草酸盐的酶的整个酶、片段、肽、结合区、活性位点或其他功能区、区段、序列以及启动子和控制序列。本发明包含重组蛋白的使用，并且所述重组蛋白被突变以使蛋白质以与野生型或未突变重组蛋白中所看到的相比更高的比率不溶或仅仅微溶于宿主的细胞质中。此外，这些重组蛋白不作为包含体存在于宿主细胞中。存在几种改变蛋白质溶解性的方法，例如用亲水性更低的残基取代亲水性残基、用不带电荷的氨基酸取代带电荷氨基酸和/或在C-和 /或N-端添加疏水性肽尾。修饰不应使蛋白质失活，并且具有低溶解性的修饰蛋白应该以活性形式被宿主细胞例如大肠杆菌表达。本发明包含用于突变减少草酸盐的酶的方法，并且突变的酶包括但不限于草酸脱羧酶、草酸氧化酶、草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶。突变优选不降低或失活酶的功能性。描述了本发明所设想的突变的实例。OxDC的N-和C-端两者都远离催化位点并且相当柔性。正如从X-射线晶体学所确定的，两个末端的柔性揭示出N-端尾的前7个氨基酸和C-端的最后6个氨基酸由于构象非均质性而不衍射。在C-端的6个残基中,选择 C383用于突变，这是因为有许多氨基酸比Cys更疏水或亲水，可以被选择用于取代它。C383 表示草酸脱羧酶氨基酸序列中第383位的半胱氨酸。此外，C383是OxDC中唯一的CysJM 是已被显示易于在OxDC六聚体之间形成二硫键并进一步产生聚集体。取代C383可以消除这种聚集体的形成，因此增加了 OxDC在溶液中的稳定性。将突变引入到C-端区域中。从原始的yvrk基因序列(野生型yvrk)草酸脱羧酶产生了多个基因。原始基因来自于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis),并使用来自于GenScript Corporation, Piscataway, NJ的算法为基因序列在大肠杆菌中的表达进行优化。针对密码子使用、平衡 GC含量、去除重复元件以及确保不含用于克隆的内部限制性位点，对基因进行优化。密码子优化的基因产生了具有与野生型yvrk相同的氨基酸序列的蛋白质。然后对野生型yvrk基因和优化过的yvrk基因两者的单个半胱氨酸密码子进行修饰，产生了其他独特的基因序列。将半胱氨酸密码子用丝氨酸、精氨酸或丙氨酸密码子替换。可以使用相同方法对野生型yvrk基因的基因序列进行优化，以用于其他表达系统例如毕赤酵母属(Pichia)或酵母菌属(Saccharomyces)。此外,可以通过针对最适密码子使用和GC含量以及去除重复元件进行基因优化，来改进在芽孢杆菌表达系统中的表达。 密码子优化还可用于在已修饰的半胱氨酸密码子之外的位置处、或除了半胱氨酸修饰之外修饰蛋白质的二级结构，作为例如提高聚乙二醇化、微球结合或包胶的方法，或作为提高在低PH下的pH稳定性的方法，或作为提高蛋白质活性的方法。SEQ ID Iyvrk原始序列,其中半胱氨酸密码子用粗体标出。AAAAAACAAAATGACATTCCGCAGCCAATTAGAGGAGACAAAGGAGCAACGGTAAAAATCCCGCGCAAT ATTGAAAGAGACCGGCAAAACCCTGATATGCTCGTTCCGCCTGAAACCGATCATGGCACCGTCAGCAATATGAAGTT TTCATTCTCTGATACTCATAACCGATTAGAAAAAGGCGGATATGCCCGGGAAGTGACAGTACGTGAATTGCCGATTT CAGAAAACCTTGCATCCGTAAATATGCGGCTGAAGCCAGGCGCGATTCGCGAGCTTCACTGGCATAAAGAAGCTGAA TGGGCTTATATGATTTACGGAAGTGCAAGAGTCACAATTGTAGATGAAAAAGGGCGCAGCTTTATTGACGATGTAGG TGAAGGAGACCTTTGGTACTTCCCGTCAGGCCTGCCGCACTCCATCCAAGCGCTGGAGGAGGGAGCTGAGTTCCTGC TCGTGTTTGACGATGGATCATTCTCTGAAAACAGCACGTTCCAGCTGACAGATTGGCTGGCCCACACTCCAAAAGAA GTCATTGCTGCGAACTTCGGCGTGACAAAAGAAGAGATTTCCAATTTGCCTGGCAAAGAAAAATATATATTTGAAAAC CAACTTCCTGGCAGTTTAAAAGATGATATTGTGGAAGGGCCGAATGGCGAAGTGCCTTATCCATTTACTTACCGCCT TCTTGAACAAGAGCCGATCGAATCTGAGGGAGGAAAAGTATACATTGCAGATTCGACAAACTTCAAAGTGTCTAAAACCATCGCATCAGCGCTCGTAACAGTA GAACCCGGCGCCATGAGAGAACTGCACTGGCACCCGAATACCCACGAATGGCAATACTACATCTCCGGTAAAGCTAG AATGACCGTTTTTGCATCTGACGGCCATGCCAGAACGTTTAATTACCAAGCCGGTGATGTCGGATATGTACCATTTG CAATGGGTCATTACGTTGAAAACATCGGGGATGAACCGCTTGTCTTTTTAGAAATCTTCAAAGACGACCATTATGCT GATGTATCTTTAAACCAATGGCTTGCCATGCTTCCTGAAACATTTGTTCAAGCGCACCTTGACTTGGGCAAAGACTT TACTGATGTGCTTTCAAAAGAAAAGCACCCAGTAGTGAAAAAGAAATGCAGTAAA被优化用于大肠杆菌的Yvrk基因序列，其中在5’和3’末端处具有限制性位点 (下划线)，并且半胱氨酸密码子用粗体标出。SEQ ID 2CATATGAAAAAACAGAATGACATTCCACAGCCGATTCGCGGCGATAAAGGCGCGACCGTCAAAATTCCT CGCAATATCGAACGCGACCGCCAGAATCCGGATATGCTGGTGCCGCCGGAGACGGACCATGGCACGGTGTCTAACAT
权利要求
1.一种用于分离在宿主细胞的细胞质中不溶并且不作为包含体存在的重组蛋白的方法，所述方法包含a)将不作为包含体存在的不溶性重组蛋白与可溶性宿主细胞蛋白分离开；以及b)溶解分离的重组蛋白。
2.权利要求1的方法，其还包含c)从溶解溶液分离溶解的重组蛋白。
3.权利要求1或2的方法，其中分离重组蛋白包含离心或过滤。
4.前述权利要求任一项的方法，其中溶解重组蛋白包含添加结合配体或提供使蛋白可溶的PH。
5.前述权利要求任一项的方法，其中重组蛋白是减少草酸盐的酶。
6.前述权利要求任一项的方法，其中重组蛋白是突变的减少草酸盐的酶。
7.权利要求2-6任一项的方法，其中分离包含将重组蛋白从溶解溶液中沉淀出来。
8.权利要求7的方法，其还包含清洗沉淀的重组蛋白。
9.前述权利要求任一项的方法，其中重组蛋白由选自下列的序列编码SEQ.ID NO. 3、SEQ. ID NO. 4、SEQ. ID NO. 5、SEQ. ID NO. 6、SEQ. ID NO. 7、SEQ. ID NO. 8、SEQ. ID NO. 9、SEQ.ID NO. 10、SEQ. ID NO. 11、SEQ. ID NO. 12、SEQ. ID NO. 13、SEQ. ID NO. 14、SEQ. IDNO. 15、SEQ.ID NO. 16、SEQ. ID NO. 17、SEQ. ID NO. 18 或 SEQ. IDNO. 19。
10.权利要求1-8任一项的方法，其中重组蛋白是OxDC野生型重组蛋白的C383S突变体，或者是由选自 SEQ. ID NO. 3、SEQ. ID NO. 4、SEQ. ID NO. 5、SEQ. ID NO. 6、SEQ. ID NO. 7 或SEQ. ID NO. 8的序列编码的蛋白。
11.权利要求1-8任一项的方法，其中重组蛋白是OxDC野生型重组蛋白的C383A或C383R 突变体，或者是由选自 SEQ. ID N0. 9、SEQ. ID NO. 10、SEQ. ID NO. 11、SEQ. ID NO. 12、SEQ. ID NO. 13、SEQ. IDNO. 14、SEQ. ID NO. 15、SEQ. ID NO. 16、SEQ. ID NO. 17、SEQ. ID NO. 18或SEQ. ID NO. 19的序列编码的蛋白。
12.—种喷雾干燥的粒子，其包含如权利要求1-11任一项所限定的分离的一种或多种重组蛋白，和聚合物材料。
13.权利要求11的喷雾干燥的粒子，其中重组蛋白是减少草酸盐的酶。
14.权利要求13的喷雾干燥的粒子，其中一种或多种减少草酸盐的酶是草酸脱羧酶、草酸氧化酶、或草酰辅酶A脱羧酶与甲酰辅酶A转移酶的组合，或一种以上酶的组合。
15.权利要求13或14的喷雾干燥的粒子，其中一种或多种减少草酸盐的酶是草酸脱羧酶。
16.权利要求13-15任一项的喷雾干燥的粒子，其中减少草酸盐的酶是OxDC野生型重组蛋白的 C383S 突变体，或者是由选自 SEQ. ID N0. 3、SEQ. ID NO. 4、SEQ. ID NO. 5、SEQ. IDNO. 6、SEQ. ID NO. 7或SEQ. ID NO. 8的序列编码的蛋白。
17.权利要求13-15任一项的喷雾干燥的粒子，其中减少草酸盐的酶是OxDC野生型重组蛋白的C383A或C383R突变体，或者是由选自SEQ. ID N0. 9、SEQ. ID NO. 10、SEQ. IDNO. 11、SEQ. ID NO. 12、SEQ. ID NO. 13、SEQ. ID NO. 14、SEQ. ID NO. 15、SEQ. ID NO. 16、SEQ. IDNO. 17、SEQ. ID NO. 18 或 SEQ. ID NO. 19 的序列编码的蛋白。
18.权利要求13-17任一项的喷雾干燥的粒子，其中一种或多种减少草酸盐的酶当在PH约为3. 2的3. 2mg/ml胃蛋白酶溶液中温育40分钟时，其活性最多降低至约30%，其中初始活性被设定为100%。
19.权利要求12-18任一项的喷雾干燥的粒子，其中聚合物材料是聚(甲基)丙烯酸酯。
20.一种组合物，其包含权利要求12-19任一项中所定义的喷雾干燥的粒子。
21.权利要求20的组合物，其中组合物是口服剂型。
22.权利要求20或21的组合物，其采取小袋、片剂、胶囊、咀嚼片剂、速溶片剂、口服崩解片剂、液体、糖浆或酏剂的形式或其他递送形式。
23.一种用于减少草酸盐吸收的方法，所述方法包含a)向人类或动物的胃口服给药包含喷雾干燥的粒子的组合物，所述粒子包含一种或多种减少草酸盐的酶和聚合物材料；以及b)减少胃中存在的至少显著部分的草酸盐。
24.权利要求23的方法，其中喷雾干燥的粒子如权利要求13-19任一项中所限定。
25.权利要求23或24的方法，其中减少草酸盐的吸收为草酸盐相关病症提供了治疗， 所述病症选自高草酸盐尿、吸收性高草酸盐尿、肠原性高草酸盐尿、原发性高草酸盐尿、特发性草酸盐钙肾结石病(尿石症)、外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃肠手术后病症和减肥手术后病症、肥胖症手术后病症或抗生素治疗后病症。
全文摘要
本发明包含用于在人类中减少草酸盐的方法和组合物，以及用于纯化和分离重组的减少草酸盐的酶蛋白的方法。本发明提供了用于以粒子组合物递送减少草酸盐的酶的方法和组合物。本发明的组合物适合于治疗或预防草酸盐相关病症的方法。
文档编号C12N9/10GK102597225SQ201080029636
公开日2012年7月18日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月2日
发明者卡尔-古斯塔夫·格兰德, 哈密特·司杜, 李青山, 阿隆·布莱克·科里 申请人:奥克斯泰拉知识产权公司