用于治疗或预防草酸盐相关疾病的组合物和方法

专利名称：用于治疗或预防草酸盐相关疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和预防草酸盐相关病症的组合物和方法。尤 其是，本发明涉及包含降解草酸盐或还原草酸盐的细菌和酶的组合物 和方法。
背景技术：
肾-尿路结石疾病(尿石病)是全世界范围的主要健康问题。大多数 与尿石病有关的结石由单独的草酸钙组成，或者由草酸钙加上磷酸钙 组成。其它疾病状态也被证实与过量的草酸盐有关。包括慢性阴部疼 痛(vulvodynia)，与晚期肾病有关的草酸过多症，心脏传导失调，克 罗恩氏病及其它肠衣疾病。草酸和/或其盐，草酸盐存在于多种食物中，因此是人和动物膳食 的许多组分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能发生草 酸盐吸收的增加。诸如菠菜和食用大黄的食物公知含有高含量的草酸 盐，但是大量其它食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此 多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时还可口的膳食难以配制出 来。此外，依从低草酸盐膳食常常也是有疑问的。
内源性草酸盐也由正常组织酶代谢产生。包括可以吸收的膳食草 酸盐的草酸盐以及代谢产生的草酸盐不会被组织酶进一步代谢并且因 此必须被排出体外。这样的排泄主要经肾进行。肾液中草酸盐的浓度 非常关键，草酸盐浓度的增加会引起高危形成草酸钙晶体，并随后由此形成肾结石。肾结石的高危形成围绕着大量目前尚未完全明白的因素。肾或尿 路结石疾病发生在西方国家多至12%的人群中，并且约70%的结石由 草酸钙或草酸钙加上磷酸钙组成。
一些个体(例如，患有诸如克罗恩氏病，炎症性肠病或脂肪痢以及进行过空肠回肠(jejunoileal)分流外科手 术的病人)在其膳食中比其他来源吸收更多的草酸盐。对于这些个体， 草酸盐尿石病的发病率明显增加。发病率的提高是由于肾和尿液中草 酸盐水平的增加，并且人的这样最普遍的高草酸尿综合症被称为肠源 性高草酸尿。草酸盐也是晚期肾病病人的难题并且最近有证据 (Solomons, C. C.， M. H. Melmed， S. M. Heitler [1991] " Calcium citrate for vulvar vestibulitis " Journal of Reproductive Medicine 36 : 879-882)尿 草酸盐的升高也与外阴前庭炎(慢性阴部疼痛)有关。降解草酸盐的细菌已经分离自人的粪便(Amson M. J.， H. M. Cook, D. B. Milne， S. Gallagher, R. V. Clayman [1986] " Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans " J. Nutr. 116455-460)。这些细菌类似于草酸盐-还原细菌，这些草酸盐还原细菌分 离自大量动物品种的肠渣(Dawson， K. A.， M.J.Allison, P. A. Hartman [1980] " Isolation and some characteristics of anaerobic oxalate-degrading bacteria the rumen " Appl. Environ. Microbiol. 40: 833-839; Allison, M. J.， H. M. Cook [1981] " Oxalate degradation by microbes of the large bowel of herbivores : the effect of dietary oxalate " Science 212 : 675-676; Daniel, S. L.， P. A. Hartman, M. J. Allison [1987] " Microbial degradation of oxalate in the gastrointestinal tracts of rats " Appl. Environ.
Microbiol. 53: 1793-1797)。这些细菌不同于以前描述的生物体并且已 经产生了一个新种和一个新属命名(Allison， M. J.， K. A. Dawson， W. R. Mayberry， J. G. Foss [1985] " Oxalabacter formigenes gen. nov.， sp. nov. : oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract " Arch. Microbiol. 141: 1-7)。
并不是所有人在他们的肠道中均携带0. formigenes菌群(Allison， M. J., S. L. Daniel, N. A. Comick [1995] " Oxalate-degrading bacteria " In Khan， S. R.(编车葺.)，Calcium Oxalate in Biological Systems CRC Press; Doane， L. T.， M. Liebman， D. R. Caldwell [1989] " Microbial oxalate degradation : effects on oxalate and calcium balance in humans " Nutrition Research 9: 957-964)。在进行过回肠空肠分流外科手术的人的粪便样 品中只具有低浓度的草酸盐降解细菌或完全缺乏草酸盐降解细菌 (Allison等[1986] " Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans " J. Nuti'. 116 : 455-460)。同时，某些人和动物可以维持O. formigenes的菌落，但是因为不能清楚明白的理由仍然具有过量水平的 草酸盐。
目前需要治疗人和动物减少它们体内的草酸盐水平，由此治疗或 预防草酸盐相关疾病的方法。合乎需要的方法包括施用还原草酸盐的 组合物。
发明概述
本发明包括治疗和预防草酸盐相关病症的组合物和方法。本发明
的组合物包含可以降低草酸盐的微生物以及包含还原草酸盐的酶的组 合物。本发明的方法包含施用该组合物治疗或预防草酸盐—相关的病症。
一个实施方案包括通过降低肠道中草酸盐的量降低发展草酸盐-相关的 失调的危险的方法。肠道中的这种降低导致系统草酸盐水平的减少由 此促进身体健康。
在一个本发明的实施方案中，通过向肠道补充草酸盐-降解细菌实
现草酸盐吸收的减少。在优选的实施方案中，这些细菌是Oxalobacter formigenes.。这些细菌使用草酸盐作为生长底物。这样的利用降低了肠 中可溶性草酸盐的浓度，由此降低了用于吸收的草酸盐的量。肠道中 草酸盐的降低还可以从循环系统除去草酸盐。本发明的方法预计可以 全面降低个体体内草酸盐的量。
在特定的实施方案中，本发明提供了向处在患草酸盐-相关疾病高 危中的人的肠道递送O. formigenes的方法和组合物。这些细菌及其子 代在肠中复制并从肠道除去草酸盐，由此降低可用于吸收的草酸盐的 量并引起从血液向肠中排泄草酸盐的提高。
根据本发明的教导，除了利用草酸盐作为底物的0. formigenes,
降解草酸盐的微生物也可用于实现治疗性的草酸盐降解由此降低患尿 石病及其它草酸盐-相关疾病的危险。这样的其它微生物可以是，例如， 诸如梭状芽孢杆菌或假单胞杆菌的细菌。另外，本发明包括用于给可 用于将最初不能分解草酸盐的天然微生物转化成能够还原草酸盐的微 生物的微生物提供赋予草酸盐还原功能的外源多核苷酸的方法和组合 物。
在本发明的一个实施方案中，组合物包含用于降解草酸盐产生使 这些微生物能够降解草酸盐的酶的微生物。在其他的实施方案中，该 组合物可以包含用使转化的微生物能够降解草酸盐的多核苷酸序列转 化的微生物。编码草酸盐-还原基因的多核苷酸序列包括在本发明的范 围内。编码草酸盐还原微生物，诸如细菌或真菌中发现的酶或其它草 酸盐-还原酶的多核苷酸序列可用于本发明的方法中。多核苷酸可被用 来转化细胞使细胞具有比天然存在的草酸盐还原微生物更高的草酸盐-还原活性，相同的草酸盐-还原活性，或者更低的草酸盐-还原活性。多 核苷酸也可用于合成的或者离体系统来提供具有草酸盐还原活性的蛋 白。
甲酰基-CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶已经被确定为在草酸盐降 解中起作用。用于本发明的方法和组合物中的酶包括但不限于甲酰基-CoA转移酶，草酰-CoA脱羧酶，草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶及其它酶，辅因子，以及辅酶，取代草酸盐降解途径或者参与草酸盐代谢途 径，尤其是草酸盐还原。在本发明的一个实施方案中，合适的宿主可以用编码这些酶或者 相关活性的酶由此使转化的宿主能够增加草酸盐降解的外源多核苷酸 转化。宿主可以是，例如，尤其最适宜于口服和/或定殖于肠的微生物。 或者，宿主可以是一旦转化将产生所需的酶活性，由此当消耗该植物 材料时使这些活性可以被肠利用的植物。或者，转化的植物可以具有 较低量的草酸盐，任选地由于由转化提供的蛋白的作用，由此当消耗 时，植物将不向膳食提供与未转化的植物一样多的草酸盐。本发明也包括用于用草酸盐降解或者草酸盐-还原酶转化的植物 的方法和组合物，其中这些植物具有对真菌提高的抗性，所述真菌需 要草酸盐用于使植物致病或者产生草酸使植物致病。本发明还包括含有用于降低草酸盐水平以便治疗或者预防草酸盐 相关病症的酶的方法和组合物。例如，通过施用起降解草酸盐作用的 酶实现。这些酶可以是分离和纯化的或者可以作为细胞裂解物施用。细胞裂解物可以由具有草酸盐-还原功能的微生物，例如O. formigenes 制成。在特定的实施方案中，施用的酶是本发明的一种或多种酶，诸 如但不限于草酸盐脱羧酶，草酸盐氧化酶，甲酰基-CoA转移酶和草酰 -CoA脱羧酶。任选地，可以施用改进酶活性的其他因子。这些其他因 子可以是例如，草酰CoA， MgCl2和TPP (硫胺素二磷酸，维生素Bi 的活性形式)。包括酶的组合物包含一或多种酶，和任选地，辅因子， 辅酶及其它分别或者组合加强酶活性的因子。
在本发明的一个实施方案中，通过施用由重组微生物诸如大肠杆 菌产生的草酸盐-降解酶实现草酸盐水平的降低，所述大肠杆菌已经被 转化表达草酸盐-降解酶。重组宿主可以活的或者非-活的形成施用。本 发明进一步的方面涉及用于口服的药物组合物和/或营养增补剂。这些 组合物释放草酸盐降解微生物或者草酸盐降解酶到人或者动物的肠 内。本发明的组合物包含药用的制剂。例如，本发明的方法和组合物 包含向预定位置提供组合物，诸如向受体的肠递送组合物的剂量输送 系统。本发明的组合物可以作为食物诸如，牛奶，肉和酸奶的成分施 用。
在本发明进一步的实施方案中，在缺乏草酸盐-降解细菌的驯养， 农业或者外来动物中通过分别或者组和施用草酸盐-降解微生物，植物 和酶实现草酸盐吸收的下降。
本发明的方法包含通过施用包括一或多种草酸盐还原微生物，一 或多种草酸盐还原酶或者其组合和混合物的有效量的草酸盐还原组合
物治疗或者预防人和动物的草酸盐相关的病症。草酸盐相关的病症包 括但不限于高草酸尿，原发性高草酸尿，自发草酸钙肾结石疾病(尿石 病)，肠源性高草酸尿，慢性阴部疼痛，与晚期肾病相关的草酸过多症， 心脏传导失调，炎症性肠病，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。


图1A是来自高钙膳食的数据的图。 图1B是来自低钙膳食的数据的图。
图2A是排泄的草酸盐的图。 图2B是排泄的草酸盐的图。 图2C是排泄的草酸盐的图。 图3A-C是排泄的草酸盐的图。 图4是排泄的草酸盐的图。 发明概述本发明包括用于降低草酸盐的方法和组合物。本发明的组合物包 含能够降低草酸盐的微生物，酶，多核苷酸序列，载体，细胞，植物和动物。组合物包含能够降低草酸盐的微生物。这样的微生物包括但不限于Oxalobacterformigenes，假单胞菌，梭状芽孢杆菌，乳酸杆菌， 双歧杆菌(Bifidobacteria), —些或者所有能够降低草酸盐，而且包括诸 如用外源的多核苷酸从而使其具有草酸盐降低能力的转化的细菌或者 真菌的微生物。另外，本发明的微生物包括用一或多种草酸盐降低载 体转化的微生物，所述载体包括编码草酸盐-还原酶或者相关的活性使 得该微生物为"超级降低剂"的内源或者外源的多核苷酸序列。超级 降低剂具有改进的天然草酸盐降低能力，例如，用其他的草酸盐降低 序列转化Oxalobactor formigenes，或者最初不具有草酸盐降低活性用 一或多种编码产生提高的草酸盐降低活性的草酸盐降低肽的一或多种 序列转化的微生物。草酸盐降低活性编码序列可能或者可能不插入基 因组中或者微生物中发现的其它载体中。这样的转化可以包括供应编 码草酸盐还原蛋白或者肽或者可以提供诸如反义或者iRNA的阻断核 苷酸的基因序列。组合物还包含作为草酸盐还原途径的组分的酶。这样的组合物包 含一或多种酶和任选地包括辅因子，辅酶及其它酶活性所需或者希望 的因子。组合物包含一或多种酶，包括但不限于草酸盐还原酶及其它 参与植物，动物或者人体内发现的草酸盐的代谢酶。组合物包含一种 或多种在这里教导的草酸盐还原酶。此处所述的术语"一或多种酶" 是指诸如甲酰基CoA转移酶的一种酶，或者例如甲酰基CoA转移酶和 草酸盐脱羧酶的超过一种的酶。本领域已知，该术语不指一种酶分子， 而是一或多种酶类型的多种分子。此处所述的术语草酸盐-降解酶和草酸盐-还原酶可互换使用，二者 均指参与任意生物体中的草酸盐还原或者降解的酶，或者指活性片段 或者包括能够还原或者降解草酸盐的活性片段的重组蛋白。
本发明的酶组合物还可以包含通过胃或者肠环境提供对活性酶分 子以免降解的保护的制剂。例如，酶的组合物包含可以保护或者包裹
(cage)酶的组合物。该酶可以与其它包括但不限于PEG的化合物共
价连接。酶可以包裹或者截留在结构内，诸如例如由聚合物制成的三 维网状结构内，所述聚合物或者降解释放酶或者具有使酶离开该结构 或者底物穿透该结构达到酶的孔径。例如，该孔径可以使低分子量草 酸盐和甲酸盐扩散到酶存在的区域。另外，该酶可以或者不与聚合物 结构共价连接。保护活性的酶以免在蛋白水解或者其它对酶有害的环 境下降解的方法和装置。
本发明的组合物还包含编码参与草酸盐还原途径的肽或者蛋白的 多核苷酸序列。这样的多核苷酸序列可以获自任意来源并且可用于本 领域技术人员公知的方法诸如用于转化微生物，植物或者动物来源的 细胞，并且包括全生物体。
本发明的组合物还包括具有改变的草酸盐还原功能的植物和动 物。例如，这样的植物包括已经由多核苷酸组合物转化的植物，使得 植物中草酸盐的量降低或者与未转化的植物比较产生的草酸的量提 高。本发明的组合物还包含具有提高的还原草酸盐能力的动物。例如， 具有提高的草酸盐还原能力的动物可用作体内模型研究草酸盐相关病 症。
本发明的方法包含制备和利用本发明的组合物。本发明的方法包 含由本领域技术人员公知的那些导入外源多核苷酸序列的方法转化细 胞，植物和动物。这样的多核苷酸序列可以获自任意来源并且可用于 本领域技术人员公知的那些方法，诸如用于转化微生物，植物或者动 物来源的细胞，并且包括全生物体。方法还包括制备包含具有草酸盐 还原活性的细胞裂解物的组合物，制备包括一或者多种具有草酸盐还 原活性的酶的组合物，以及制备包括由具有改变的草酸盐水平的植物
或者微生物制成的膳食组分的组合物。本发明的方法包含利用本发明的组合物。这样的应用包括向细胞 提供多核苷酸序列来提高或者抑制细胞的草酸盐还原能力。本发明包 括向植物或者动物施用本发明的组合物的方法，用于改变植物或者动 物草酸盐的水平。方法还包括膳食补充方法，使得本发明的组合物施 用于食物或者肥源中的植物或者动物或者与食物或者肥源同时施用于 植物或者动物来改变食物中食物降解期间或者由植物吸收期间草酸盐 的水平。本发明的方法包含治疗或者预防草酸盐相关病症的方法。方法包 含施用有效改变生物体中草酸盐水平的量的本发明的组合物。这样的 方法可有效治疗人以及动物的草酸盐病症，包括但不限于高草酸尿， 原发性高草酸尿，自发草酸钙肾结石疾病(尿石病)，肠源性高草酸尿， 慢性阴部疼痛，与晚期肾病有关的草酸过多症，心脏传导失调，炎症 性肠病，克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。本发明涉及向人或者动物肠道中导入包括一或多种草酸盐-降解 细菌和/或酶的组合物，其中组合物的活性降低了存在的草酸盐的量和/ 或浓度由此降低应归因于草酸盐的患病的危险。本发明包括用于治疗以及预防人和动物草酸盐相关病症的方法和 组合物。用于治疗草酸盐病症的方法包括施用包括一或多种草酸盐-还原酶的组合物。这样的组合物可以是每天一或多次共一或多天施用， 取决于草酸盐—相关病症的严重性或者人或者动物肠或者体液中草酸盐的量。可以连续治疗只要人或者动物体内存在不需要的水平的草酸盐。 例如，酶组合物可以每天施用一或多次，共从1天到数年的时间范围。 对于患有慢性草酸盐相关病症的人或者动物，该组合物可以在人或者 动物整个剩余的寿命时间内施用。
治疗和预防草酸盐-相关病症的方法包含施用含有有效量草酸盐 还原酶的组合物。组合物中酶的量包括将降低个体肠中存在的一部分 草酸盐的草酸盐-还原酶活性的活性单位量或者将启动草酸盐还原的量 或者维持个体与施用组合物以前存在的草酸盐的量相比草酸盐降低的 量的草酸盐-还原酶活性的活性单位水平。可被用于单个剂量组合物中的草酸盐-还原酶活性的活性单位量可以为从约0.0001个单位到约 5,000个单位，从约5个单位到IOO个单位，以及在其中所包括的所有 范围。该组合物此外可以包括其他的酶，辅因子，底物，辅酶，矿物 质及其他有助于草酸盐还原的因子。酶的单位是在37'C每分钟降解一 个微摩尔的草酸盐的酶量。在具体的实施方案中，本发明涉及制备和给人或者动物肠道施用 包含Oxalobacter formigenes的草酸盐降解细菌的细胞的组合物的方法， 在所述人或者动物肠道中，微生物的活性降低了存在于肠中的草酸盐 的量，从而引起肾和其他细胞液中草酸盐浓度的降低。在另一实施方 案中，本发明包括制备和给人或者动物肠道施用包含一或多种来自任 何来源的草酸盐-降解酶的方法，在所述人或者动物肠道中， 一或多种 酶的活性降低了存在于肠中的草酸盐的量，并引起肾和其他细胞液中 草酸盐浓度的降低。引入的细胞或者酶降解草酸盐并且细菌可能在肠 生物境中复制或者不复制以致原始细胞的后代定殖在肠上并继续除去 草酸盐。草酸盐还原细菌或者草酸盐还原酶的存在降低了形成肾结石 以及其他由草酸所引起的并发症的危险。在用于人的优选实施方案中， 所使用的具体O. formigenes菌株是分离自人肠样品的菌株。因此菌株 是正常人肠细菌群落的一部分。然而，因为他们并不是存在于所有人 的体内，或者以不充分的数目存在，这些生物体的引入纠正了存在于 一些人体内的缺陷。虽然并不希望受到任何理论的限制，人们相信肠渣中富集一或多 种草酸盐降解细菌或者草酸盐还原酶将引起肠渣中草酸盐的降低。一 些细菌或者施用的酶在吸收的位点或者附近进行草酸盐降解。细菌或
者所施用的酶的活性降低了吸收膳食草酸盐的水平。肠中草酸盐浓度 的下降还可以导致从细胞和体循环除去草酸盐。更具体地说，肠中草 酸盐浓度的降低还可以提高草酸盐从血液向肠中分泌，由此降低需要 排泄在尿中的草酸盐的量。由此，本发明施用草酸盐还原细菌或者草 酸盐还原酶的方法除治疗膳食的高草酸尿之外可用于治疗或者预防草 酸盐相关的病症，诸如原发性高草酸尿。本发明的组合物和方法尤其 可用于促进人和动物健康的草酸盐水平。向肠中单独或者组合引入草酸盐降解细菌或者一或多种草酸盐降 解酶的药物和营养组合物包括已经以液体或者浆糊形式冻干或者冷冻 并包胶在胶囊中或者其他肠衣保护层中的细菌或者酶。凝胶盖材料优 选为形成耐受胃酸度和胃酶降解，但是随着草酸盐降解组合物的释放 由肠中更高pH和胆汁酸内容物降解的递送药丸或者胶囊的聚合物材 料。然后释放的组合物将存在于肠中的草酸盐转化为无害的产物。药 物或者营养载体也可以与细菌或者酶组合。这些包括例如，盐水-磷酸 盐缓冲液。本发明的方法包含向人或者动物的肠道施用草酸盐-还原组 合物。包含一或多种草酸盐还原细菌或者一或多种草酸盐还原酶，或者 细菌和酶的组合的待施用的草酸盐-还原组合物可以作为设计用来保护 组合物免于胃酸过多的副作用的胶囊或者微胶囊进行递送。可以使用 若干肠道保护层方法的一或多种。这样的肠溶衣的描述包括使用苯二甲酸醋酸纤维素(CAP) (Yacobi， A.， E. H. Walega， 1988， Oral sustained release formulations: Dosing and evaluation, Pergammon Press)。其他圭寸 装技术的描述包括美国专利5，286,495，其在此处引入作为参考。本发 明的组合物还可以配制为栓剂。向肠施用这些包含一或多种微生物， 一或多种草酸盐还原酶或者 组合和混合物的组合物的其他方法包括向食物源直接添加组合物。一 或多种细菌可以新鲜采集的细胞，冻干的细胞或者保护的细胞的形式
添加。 一或者多种酶可以作为冻干蛋白质，包胶或者微囊酶组合物， 与维持酶活性的其他材料复合的酶，利用本领域技术人员熟知的向组 合物添加酶的其他方法添加。食物可以补充有不影响食物味道或者外 观的草酸盐降解组合物。这些食物可以是例如酸奶酪，牛奶，花生酱 或者巧克力。摄取后，当食品被消化并为肠所吸收时，包括一或多种 微生物， 一或多种酶或者组合的草酸盐降解组合物降解存在于肠种的 草酸盐由此降低吸收到血流中的草酸盐。如上所述，多种食物可以补充以草酸盐降解组合物。制备这样包 含草酸盐降低组合物的食物的方法包括将食物与草酸盐降低组合物混 合。例如，草酸盐降低微生物可以在培养基中生长或者经例如离心作 用与培养基隔开。从商业乳品店获得的传统的酸乳培养物可以与草酸 盐降解微生物培养物混合。然后这些培养物的混合物可以添加到乳品 店碱性酸乳预混合料中，并不影响味道或者稠度。然后利用传统的商 业方法产生和包装酸乳。在另一实施例中，草酸盐降解细菌可以添加 到已经产生的酸乳中。通过相似的方法，包含一或多种草酸盐还原酶 的草酸盐降低组合物可以添加到酸乳细菌培养物或者酸乳食品中。本发明方法的另一实施例是向匀化并杀菌后的牛奶添加草酸盐降 低组合物。这样的方法目前被用于向牛奶添加嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilis)微生物的乳品加工业。包含细菌的所有食物源 可以通过补充草酸盐-降解细菌使用。这些食品包括在加工期间添加所 希望的微生物的乳酪或者肉制品。包括含有草酸盐还原酶的草酸盐降 低组合物的食物不局限于包含微生物的那些食物，而是包括所有可以 添加活性酶的食物源。通常被认为是食物材料的材料可以用作酶的载 体材料，以便酶在食物的所有生产或者生长阶段，或者由人或者动物 消化的所有阶段对存在于食物中的草酸盐或者存在于肠中的草酸盐有 活性。在更进一步的实施方案中，本发明提供了新型的酶递送系统。该
系统包括已经转化有异源多核苷酸表达草酸盐降解酶的植物。该表达 酶的转基因植物可以作为例如沙拉的组分施用于病人。此外，表达酶 的植物可以作为例如饲料的组分施用给动物，或者生长在牧场中。可 以喂给这些产物的动物包括，例如，牛，猪，狗和猫。由此，作为向肠施用的替代方法，对植物进行遗传工程化来表达 草酸盐降解酶。这些转基因植物被添加到膳食中，酶的活性引起草酸 盐的下降。编码这些酶的DNA序列是本领域已知的，例如描述在WO98/16632中。除可以用作膳食的组分促进人或者动物体内健康草酸盐的水平的 植物之外，本发明提供了对微生物感染具有增强的抗性的植物。具体 地，本发明的转化的植物可以抗需要或者利用所存在的草酸盐对植物 致病的微生物。本发明被转化表达草酸盐降解酶的植物抗例如某些需 要草酸盐致病的真菌。编码酶的基因可以被修饰提高在植物中的表达 和/或稳定性。同时，表达可以在指导在特定组织中表达的启动子的控 制下。在一个实施方案中，根据本发明使用的细菌，例如O. formigenes 的菌株是分离自已经用来自正常人或者为动物时，来自正常动物的肠 渣的稀释物接种的厌氧培养物的纯培养物。可以使用包含可以检测草 酸盐降解菌落的包含专用的草酸钙的培养基。在一个实施方案中，每 个菌株的纯度可以通过利用至少2个随后的重复克隆步骤进行确认。根据本发明使用的0. formigenes菌株已经基于若干检验进行了表 征，包括细胞脂肪酸图谱，细胞蛋白质图谱，DNA和RNA (Jensen, N. S.， M. J. Allison (1995) " Studies on the diversity among anaerobic oxalate degrading bacteria now in the species Oxalobacter formigenes " Abstr. to the General Meeting of the Amer. Soc. Microbiol" 1-29)，禾口对寡 核苷酸探针的应答(Sidhu等，1996)。已经描述了 2组这样的细菌(I和
II组，均存在于目前种的描述中)。所使用的菌株是基于草酸盐降解能 力，以及定殖于人肠道的能力的证据进行选择的。所选的菌株包括I 以及II组的种的代表。本发明的一个实施方案中包括选择，制备以及向多种受试者施用 合适的草酸盐-降解细菌的方法。主要但不是排他地，这些是在他们的 肠中没有这些细菌的人或者动物。利用即使在混合细菌群落中，诸如 肠渣中发现的相对低浓度的生物体，也可以快速并且明确检测到0.formigenes的检验可以鉴定这些没有被定殖或者只被微弱定殖的人或 者动物。本发明的方法还可以用于治疗由于例如抗生素治疗或者手术 后的情况耗尽了草酸盐-降解细菌的个体或者动物。本发明的方法还可 以用于治疗具有草酸盐-降解细菌的菌落但是仍然由于例如，草酸盐敏 感性和/或过量产生内源草酸盐具有不健康草酸盐的水平的个体或者动 物。根据本发明可以使用的细菌可以由至少两种方法进行鉴定1) 可以使用这些细菌的特异性寡核苷酸探针；和/或2) 其中接种具有10 mM草酸盐的厌氧培养基并在37"C培养1至7 天后的培养物检验，确定草酸盐的损失。0. formigenes菌株的纯培养物可以在大发酵罐中分批培养并利用 本领域技术人员公知的技术收获。来自选择的单个或者或者已知菌株的混合物的细胞可以根据需要进行处理(例如与海藻糖或者甘油冻干;)来保存活力然后置于设计用来保护细胞通过传代到达酸性胃的胶囊 (肠溶包衣的胶囊)中。根据个体需要确定的量和间隔摄取细胞。有时候，单个或者周期 利用可能都需要，在其它情况下可能只需要定期摄取(例如，与饮食一 起)。
本发明更进一步涉及给人或者动物肠道施用从草酸盐降低生物体诸如0. formigenes细胞或者其他来源制备的草酸盐-降解产物或者酶， 或者通过诸如重组体手段的方法。在一个实施方案中，可以纯化草酸 盐降解酶并制备成用于经口消耗的药物或者营养组合物。在优选实施 方案中，这些酶是重组产生的。编码这些酶的DNA序列是本领域已知 的，例如描述在WO 98/16632中。这些序列，或者其他的编码草酸盐-降解蛋白质的序列可以表达在合适的宿主中。宿主可以是例如E. coli 或者乳酸杆菌。转化的宿主将包括合适的调节和运输信号。可以如本 文所述分离，纯化和施用表达的蛋白质。或者，可以施用表达所需的 草酸盐降解蛋白质的重组体宿主。重组体宿主可以活或者非活的形式 施用。在另一优选实施方案中，酶是有涂层的或者配制或者修饰成保 护酶，使其在胃中不失活，并且在小肠中发挥其草酸盐降解活性。这 样的制剂的实例是本领域已知的，例如描述在美国专利5，286，495中。在这里使用的草酸盐降解酶包括所有参与草酸盐途径的酶，并且 包括但不局限于草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，甲酰基CoA转移酶和 草酰-CoA脱羧酶。草酸盐氧化酶表达在高等植物中，并催化草酸盐氧 依赖的氧化至C02，同时伴随11202的形成。草酸盐氧化酶纯化自许多 来源，例如大麦苗根和叶；甜菜茎叶；小麦胚芽；高粱叶；和香蕉皮。 己经开发了用于从大麦根获得草酸盐氧化酶的快速三步纯化方法。己 经克隆，测序并表达了编码大麦根草酸盐氧化酶的基因。草酸盐脱羧酶主要存在于真菌中。最近已经报到了在B. subtilis 中的细菌草酸盐脱羧酶并由yvrk基因编码。草酸盐脱羧酶催化游离草 酸盐降解成C02和甲酸盐。这些酶已经报道在若干真菌中，包括疣孢 漆斑菌(MyrotheciumVerrucaria)，黑曲霉的某些菌株和白腐真菌，云芝。 编码金针菇(Flammulina velutipes)草酸盐脱羧酶的基因已被克隆并测 序；参见WO 98/42827。草酰-CoA脱羧酶在CoA-激活的底物上有活性并将其转化成甲酰
基-CoA。然后甲酰基CoA转移酶起作用交换CoA上的甲酸盐和草酸 盐。在草酸盐降解细菌，存在于土壤中的Pseudomonas oxalaticus和残 留在包括人的脊椎动物胃肠道中的Oxalobacter formigenes中对这些酶 进行了研究。0. formigenes已经显示出与其宿主通过调节肠中吸收的 草酸以及血浆中的草酸水平为共生关系。缺少这些细菌已经被认为是 草酸盐有关的紊乱，例如复发性的自发草酸钙尿石病和回肠空肠分流 手术继发的肠源性的高草酸尿和炎症性肠病的危险因素。描述多种草酸盐-降解酶和编码这些酶的基因的专利包括美国专 利5,912,125; 6,090,628禾P 6,214,980。这些专利在此处全文引入作为参 考，与具体引用一样。术语草酸盐-降解酶包括但是不局限于草酸盐氧 化酶，草酸盐脱羧酶，草酰-CoA脱羧酶和甲酰基CoA转移酶，并且包 括能够与草酸盐或者草酸相互作用的酶。这些酶可以源自于天然源或 者使用本领域已知的重组方法合成的，并且包括诸如结合部位，活性 部位或者能够与草酸盐或者草酸相互作用的片段的所有的片段。这个 术语还包括但是不局限于所有必需的辅因子，辅酶，金属，或者酶与 草酸盐或者草酸相互作用必需的结合或者基质材料。本发明还包括这 些酶的所有的结合伴侣并且包括结合于或者与酶相互作用的抗体和抗 体片段。
. formigenes的使用尤其有利，因为它是不在需氧组织环境中生 长并且不产生对人和动物有毒性的化合物的厌氧菌。作为0. foraiigenes 或者重组宿主的替代，可以使用其它草酸盐降解细菌，诸如梭菌，枯 草芽孢杆菌，假单胞菌，乳酸杆菌，双歧杆菌。可以施用从这样替代 性的细菌制备的草酸盐降解酶或者可以施用整个微生物。此外，上述的实施方案适用于驯养，农业或者动物园饲养的缺乏 草酸盐降解细菌的动物以及人类。例如，草酸盐-降解酶和/或微生物可 以施用于宠物，诸如狗，猫，兔，雪貂，豚鼠，仓鼠和沙土鼠以及农 用牲畜，诸如马，羊，牛和猪，或者用于育种目的的野生动物，诸如 水獭。许多能够降低草酸盐的动物当被捕获时就丧失了降低草酸盐的能力。本发明包括恢复丧失或者还原草酸盐还原活性的方法和组合物。本发明的一个方面包括用本发明教导的组合物处理从野外获得的丧失 或者降低了草酸盐还原活性的动物。本发明包括用于向人或者动物的胃肠道施用包括一或多种草酸盐 -降解细菌， 一或多种酶，或者细菌和酶的组合的组合物的组合物和方 法。这样的组合物和方法可有效降低草酸盐的量和/或浓度。这样的方法和组合物可有效治疗和预防草酸盐相关的病症。本发明的一个方面 包括用于将草酸盐-降解酶导入人或者动物的胃肠道的组合物和方法。本发明包括向人或者动物的胃肠道递送一或多种草酸盐-降解酶作为药 物和/或营养载体组合物的方法。这样的酶包括但不限于草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，-CoA脱羧酶和甲酰基CoA转移酶。这些酶可以获自本 领域公知的来源。例如，植物酶，草酸盐氧化酶(OXO)可以纯化自大麦 幼苗，草酸盐脱羧酶可以纯化自细菌或者真菌来源。或者，可以通过重组法衍生草酸盐降解酶。例如，诸如克隆，表 达和纯化的重组法可用来获得草酸盐还原酶，例如枯草芽孢杆菌草酸 盐脱羧酶。这样的重组方法是本领域公知的。例如，通常公开的是枯 草芽孢杆菌草酸盐脱羧酶(YvrK)基因的克隆和表达草酸盐脱羧酶蛋 白(YvrK)的基因已经被克隆到pET-9a和pET-14b质粒(Novagen， WI) 中，在强噬菌体T7启动子的控制下，用于过表达可溶性cytosolic蛋白。 表达宿主是E. coli菌株BL 21 (DE3)pLysS，缺乏蛋白酶并且含有在 lacUV5控制下的T7-RNA聚合酶基因的染色体拷贝的入DE3溶源菌。 此外，该菌株携带编码T7溶菌酶的pET-相容的质粒，所述T7溶菌酶 是切割细胞壁肽聚糖层中的键并抑制T7 RNA聚合酶的双功能酶。能够 更有力的控制未诱导的基态表达并使用破裂内膜的方法，诸如冻融， 或者温和洗涤剂，等等，来有效地裂解细胞。通过添加异丙基-e-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导基因产物的表达。因此，本发明的一 个方面包括含有施用已经通过重组微生物产生的草酸盐降解酶的方
法。可以使用多种表达载体和宿主来产生作为重组蛋白的草酸盐降解 酶，并且这样的方法是本领域技术人员已知的。本发明的另一个方面包括通过给人或者动物的胃肠道补充草酸盐 -降解细菌降低草酸盐吸收的方法。这样的细菌可以包括但不限于Oxalobacterformigenes,梭菌，乳酸杆菌，双歧杆菌以及假单胞菌。0. formigenes已经分离自人粪便样品并通过选择单个菌落被克隆。包括最 初由Dr. Milton Allison在1996的Ixion生物技术获得的分离物HC-l。 例如，可以使用人菌株HC-1的冷冻原种。本发明的方法包含使肠富集 一或多种草酸盐降解细菌，总体降低肠渣中的草酸盐，降低肠中吸收 的草酸盐，降低血液和肾液中的草酸盐浓度并降低由于草酸盐的存在 对身体的有害作用。因此，本发明一个方面包括补充草酸盐-还原细菌和草酸盐降解酶 的组合物和方法，所述还原细菌和草酸盐降解酶可以降低具有草酸盐-相关疾病和/或病症的高危人肠道中的草酸盐。这样的疾病和病症包括 但不限于高草酸尿，原发性高草酸尿，自发草酸钙肾结石疾病(尿石病)， 肠源性高草酸尿，慢性阴部疼痛，与晚期肾病有关的草酸过多症，心 脏传导失调，炎症性肠病，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，进行回肠空 肠分流外科手术的人，具有不充分浓度的草酸盐降解细菌的人，及其 它肠疾病。进行抗生素治疗，化学治疗或者其它治疗改变了肠内菌丛 的人和动物可用本发明的组合物和方法进行治疗。本发明可用于恢复 肠内菌丛改变的人或者动物的草酸盐还原能力。尿草酸盐排泄水平的 提高促进肾结石的形成，有助于肾瘢痕，并且甚至可以引起肾衰竭。 因此，本发明的一个方面包括降低肾结石的形成的组合物和方法。肠中草酸盐总浓度的减少还可以使草酸盐从细胞和体循环除去。 更具体地说，肠中草酸盐浓度的降低还可以引起草酸盐从血液向肠分 泌的加强。尽管不希望受到任何特定理论的限制，人们相信存在草酸 盐从肠消除的跨上皮梯度。因此，本发明的一个方面包括通过促进草
酸盐从血液经草酸盐的跨上皮梯度排泄用于结肠草酸盐排泄，用于降 低血液草酸盐的水平以及提高草酸盐排泄的组合物和方法。本发明的 方法包括给人或者动物的肠提供用于降低草酸盐浓度或者人或者动物 的水平的组合物。这样的降低可以包含降低肠中，血液中，血清中， 组织液中和其它体液中发现的草酸盐的量。本发明的一个组合物包括制备用于口服的0. formigenes糊剂。对 于每一批0. formigenes糊剂，HC-1的单原种瓶用于产生种子培养以便 启动大规模生产发酵的生长。来自每一发酵的细菌通过离心收集并与 防冷冻的赋形剂混合，所述赋形剂提供对冷冻干燥的保护作用。细胞 糊剂还可以进行冷冻干燥产生具有107到109 CFUs/克的效价的细粉末。 将所产生的粉末置入肠溶包衣的用于向小肠安全递送细菌的胶囊中。本发明的组合物包含由一或多种草酸盐-还原细菌的提取物制成 的组合物，范围从约103到约1(^cfus/克，从约103到约10^cfus/克， 从约105到约1012cfus/gram，从约105到约10"cfus/克，从约107到约 10、fus/克，从约107到约1()8cfus/克以及在这些范围之间的所有范围。本发明的组合物还包括含有一或多种具有还原草酸盐活性的酶的 组合物。本发明的一个方面包括给人或者动物的胃肠道施用有效量的 酶组合物。有效量的酶组合物能够还原肠中部分草酸盐或者使人或者 动物的草酸盐浓度从施用该组合物之前测定的水平降低。这样的测定 可以是测定存在于食物来源的肠中的草酸盐或者可以是类似血液或者 尿液的体液中测定的水平。本发明包括向人或者动物的胃肠道施用含有0. formigenes的组合 物的方法。受试者优选剂量给药含有^10、fus的活0. formigenes细胞 的肠衣胶囊。这样的剂量给药优选每天发生两次，伴随两次正餐。本 发明还包括施用含有一或多种草酸盐还原微生物， 一或多种草酸盐还 原酶或者其组合的草酸盐还原组合物的方法。本发明的方法含有至少 一天一次施用有效量的草酸盐还原组合物，其中草酸盐还原组合物含 有一或多种草酸盐还原酶。该方法还包括施用这样的组合物每天超过 一次，每天超过两次，每天超过三次，并且在每天1到15次的范围内。 这样的施用可以连续地每天进行持续几天，几周，几个月或者几年， 或者可以发生在治疗或者预防草酸盐相关病症的特定时间。例如，可 以给人或者动物施用草酸盐还原组合物至少一天一次共几年来治疗或 者预防草酸盐相关病症，或者可以给人或者动物施用草酸盐还原组合物至少一天一次仅仅当摄取含有草酸盐的食物时，或者限定的时件段，诸如几天或者几周，依照干扰正常细菌群落的进程或者治疗。这样的给药可以发生在药物给药已知的整个过程。通过口服或者肠途径给药 或者与食物材料结合的给药也包括在本发明的范围内。人们注意到，在本说明书和权利要求中使用的单数形式的"a"， "an"和"the"包括复数对象除非上下文另有清楚的指示。在这里包括的所有专利，专利申请和参考文献在这里具体地全文 引入作为参考。当然，应该理解上述仅仅涉及本发明优选的实施方案，而且可以 进行很多的修改或者变化，只要不背离在本发明阐述的本发明的精神 和范围。下面是说明用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应该 以任何方式被理解为是对本发明范围的限制。相反地，应该清楚地理 解，在阅读了在这里描述后可以暗示本领域技术人员进行多种其它实 施方案，修改和其等价物，只要不背离本发明的精神和/或权利要求的 范围。实施例1 高危患者的治疗
用含有冷冻干燥O.formigenes粉末的肠溶包衣胶囊喂养原发性高 草酸尿病人每天两次，优选与它们每天的两次正餐一起进食。每个规 格-2胶囊含约137毫克包括至少l()S个集落形成单位(CFUs) /克的冷冻 干燥的散粉末。对于高危受试者而言，可能需要终生的治疗。对受试者进行的临 床研究表明当停止治疗时定殖现象减少了。在临床研究中，进行4周 的治疗并且根踪两周的时间。4周的治疗导致血液中的草酸盐水平与基 本水平相比显著下降了。但是在根踪过程中，大便计数中的草酸杆菌 减少了且血浆和尿液草酸盐值开始增加了。因此，有人提出需要连续 服用降低草酸盐的组合物来提供降低的草酸盐条件。含有可在内脏中定殖和形成的细菌的组合物可导致对施用较少草酸盐-降低组合物的需 求。0. formigenes细胞的肠溶包衣胶囊可被处于草酸盐相关疾病高危 状态的病人群体摄食。这些人包括1. 由于例如遗传缺损类原发性高草酸尿产生过多内源草酸盐的人2. 由于肠道疾病(肠源性-高草酸尿)处于具有高尿草酸盐的尿石 病危险中的人3. 具有尿石病病史患有多急性发作自发性结石病的人。4. 由于晚期肾病具有高血清草酸盐水平的人。5. 具有外阴前庭炎的人。6. 诸如在印度和沙特阿拉伯的某些特定地区和季节食用高水平草 酸盐的人。这些也包括偶然优先选用草酸盐含量高诸如菠菜的食物的 个体。本发明的组合物提供给了上述的任意人或者动物。例如，对具有 比正常内源草酸盐水平高的人每天用设计用于将其内含物递送到大肠 的胶囊治疗两次，其中的胶囊含有约106cfus的a/or/m'gw^。胶囊优 选与食物一起施用。
实施例2低危患者的治疗肠衣保护的a/onm'gen"细胞，诸如在肠溶包衣胶囊中提供的， 还可以被处于较低草酸盐相关疾病危险中的个体摄食。理想地，在用 含有草酸盐-降低物质诸如草酸盐-还原细菌的组合物治疗一两次的这 些病人中定殖。这些病人还可以定期接受草酸盐-降低物质的治疗，作为补充物或作为食品诸如奶或酸奶的添加剂。这些包括1. 由于用口服抗生素治疗或痢疾性疾病而丧失正常的草酸盐降解 细菌群体的人。2. 可接种婴儿使得当竞争性排斥原理起作用时正常的草酸杆菌保 护性群体比随后的生命阶段更容易形成。对处于低危险中的人或动物用设计用于将内含物递送到大肠的胶 囊治疗一天两次，其中胶囊含有至少107 cfus的一或多种降低草酸盐 的生物，诸如a/o^m'geMM。优选地，胶囊与食物一起施用。实施例3使用来自Oca/o6a"er/o環/gw"的草酸盐降解酶来控制高草酸尿 进行研究来评价来自Om/o^c^/orm/geww的草酸盐降解酶控制 高草酸尿的效力。使用的动物雄性斯普拉格道利(Sprague Dawley)大鼠体重 250-300 g使用的食谱正常的食谱(N. D.): Harlan TekladTD 89222; 0.5% Ca， 0.4% P使用的药物Oc"/o幻cto"/ormZgwM裂解物(酶源)与草酰CoA， MgCh和TPP的冷冻干燥的混合物。药物递送系统(胶囊)规格9胶囊用于临床前大鼠研究 (Capsu-Gel)。肠溶包衣Eudragit L-100-55 ( Hulls America, Inc.)。 24小 时尿液的基线收集。粪便的Ora/o6a"er /orm/g^M分析-大鼠没有 (9x"/o6a"er/o簡/ge"es定殖。
实验方案A. 长期研究动物方案组l(n-4):喂养草酸盐与裂解物。大鼠每天在4:00p.m.施用两 个胶囊并且在前一天晚上喂食草酸盐。在白天不给予草酸盐饮食(8: 00 a. m.至4: 00 p.m.)。组n(n-4):如组i所述喂养草酸盐饮食(高草酸尿对照)。在上述治疗的第7天和第9天收集24小时尿液样品。以上的两个组的大鼠平均尿草酸盐浓度的数据显示与高草酸尿 (对照组II)相比，喂养草酸杆菌裂解物降低了组I的尿草酸盐浓度。酶 在胃肠道中不能长时间有活性；因此，进行如下所述的短期研究。B. 短期研究动物方案组I (n = 4):在8:00a.m.喂养1个胶囊；给草酸盐饮食两个小时(大鼠禁食过夜使得它们在这个期间食欲最佳)并且在上午io:oo喂食i个胶囊。组lI(n-4):如组I所述施用草酸盐饮食两个小时。 收集所有动物接下来5小时的时间的尿液并且分析其草酸盐的浓度。在第11,12和15天进行这些研究。这些研究结果表明与高草酸尿对照组(组II)相比，给予草酸杆菌裂 解物导致组I大鼠给药草酸盐和药物后5小时时间中尿草酸盐的水平显 著下降。在两个大鼠组之间进行交叉研究。C. 交叉研究 动物方案
组I :每天在上午8 : 00-10:00和下午3 : 00-5:00给与草酸盐饮食两次。组n:在给组i喂草酸盐饮食之前每天每次喂食l个胶囊共两次。如部分-B所述，在交叉研究后第2天和第5天进行喂食草酸杆菌裂解物对尿草酸盐水平的影响的短期研究。交叉研究表明先前高草酸尿的II组大鼠，其被喂食草酸杆菌裂解 物，显示出尿草酸盐水平的下降。相反，组-I大鼠因停止药物回复为高 草酸尿症。实施例4用Ox"/o6a"er/o簡Zgg"es细胞治疗大鼠进行评价当Ora/o/^c^/o，/gs"细胞被包含在饮食中时，饮食 草酸盐的去向的研究。方法在两个独立的实验过程中，给雄性威斯塔大鼠喂养正常的钙(1%)，高草酸盐(0.5%)饮食，或低钙(0.02%)，高草酸盐饮食(0.5%)。在研究 的第1天和第7天给予"C-草酸盐(2.0y Ci)。在第5-11天，通过大鼠 饮用水施用Oxa/oMcter/orm/ge""细胞(380 mg/d)。基于对粪便、尿液 和呼出气中"C的分析测定来自草酸盐的"C的去向。大鼠自身用作对 照并在第1-4天进行对照期间(喂养草酸杆菌细胞之前)的测定；在第 7-11天进行实验期间(当喂养细菌细胞时)的测定。结果1.当大鼠给予正常的(r/。)钙饮食时，在呼出气中回收到小于1% 的施用剂量的来自草酸盐的"C(如肠中由'"C草酸盐产生的二氧化碳， 被吸收到血液中然后被呼出)，然而，在所有
反，当大鼠进料草酸杆菌细胞时在实验期间在呼出气中回收到超过50% 来自草酸盐的14c为二氧化碳的形式(图lb)。这些结果与在对照期间(给 予草酸杆菌细胞前)回收到的非常低量的"C(小于5%)明显不同。因此 将Ocfl/o6acter/ormZgew^细胞喂食于大鼠显著地增加了在肠道中降解 的饮食草酸盐的量。2.喂食草酸杆菌细胞也降低了在尿液排泄的"C-草酸盐的量。在对 照和实验期间收集4天的值以及在这些期间的单一一天的值分别显示 于附图2a和2b中。在大鼠粪便中回收的草酸盐的量在实验时间期间(给 予草酸杆菌细胞时)也比对照期间的量降低(图2c)。大多数的实验室大鼠在它们的肠道中不携带草酸杆菌(它们不定 殖)。此结果表明有目的地将这些草酸盐降解细菌施用于大鼠导致大部 分的饮食草酸盐被降解，而且因此较少的来自饮食的草酸盐被排泄在 尿液中。饮食钙对草酸盐降解的作用是显著的。钙与草酸盐的复合物使其 溶解度和被草酸杆菌攻击的利用率得到限制，并且当大鼠喂食高钙饮 食时其降解的量比当饮食中低钙时降解的量少得多。喂食a/Mm/ga"对猪尿草酸盐排泄的影响猪天然定殖草酸杆菌。通过饮食补充抗生素在实验猪中实现去定 殖。将培养肉汤中的草酸杆菌喂食给猪，很容易被吸收。猪也被喂养 基于大豆/谷物的饲料，所述词料补充有1300毫克草酸盐/公斤。基本 饮食中含有680 mg草酸盐/ kg。三只个体猪的结果显示于图3a-c中。在所有三只猪的草酸杆菌消耗过程中，尿草酸盐显著降低。在这 三只猪中，草酸盐排泄的水平降低到最少约6 mg/g肌酐。这与在采取 无草酸盐规则饮食的人中观察到的8-10mg/g肌酐的水平相当。此水平
等于饮食装载已被消除的人体内源合成的水平。看上去这个水平反映 了猪的内源合成而且肠吸收已经通过草酸杆菌治疗被消除。此外，这 些结果表明摄食的草酸杆菌能够除去添加的结晶草酸盐以及可生物利 用的食物-来源的草酸盐。在该实验中，各只猪被喂养1.0 g的细胞糊状物作为早餐。在0.6的O.D6。。，活细胞计数为2.1 xl()S细胞/毫升，其外推至2.1xlO"细胞/100 L。 100 L发酵罐运转为我们提供了平均来说50-60 gm湿重的细胞。因 此，lgm湿重的细胞为大约3.5xl()H的活细胞。如上所述的3.5x1011活细胞的剂量可消除每公斤饮食存在的约2.0 gm草酸盐的肠吸收(1300mg添加的草酸盐+ 680 mg存在于饮食的草酸 盐)。动物每一餐消耗1 kg饮食。猪的体重大约为200磅且猪的消化系统被认为非常接近于人的消 化系统。取决于饮食组成，人的草酸盐平均日消耗量为大约100-400 毫克，其也分成三餐/天，因此108至l(T活细胞的平均日剂量足以预 防草酸盐的饮食吸收。实施例60. /orm/gw^补充物对喂养高草酸饮食的大鼠的尿草酸排泄的影响进行研究来测定IxOC-3制剂对定殖状况以及高草酸饮食后尿草 酸水平的影响。IxOC-3制剂含有草酸还原细菌的冷冻干燥活细胞，诸 如a/onm'ge/^。该制剂含有大约10、10、fus/克每剂量。制剂也含有 cyropreservation试齐U ， 诸如trehelose禾口麦芽糊精。方法将雄性哈伦斯普拉格道利(Harlan Sprague Dawley)大鼠随机分配 为3个组(6个动物/组)。组1的动物用作对照组并以10。集落形成单位(CFU)的剂量水平每天两次通过口服施用规格9的肠溶衣安慰剂制剂。 通过分别口服106和107CFUs的剂量水平对组2和3的动物以规格9 肠溶衣胶囊的形式施用Ocfl/o^"er/orm/gew"IxOC-3制剂。填喂胶囊 后，通过用高压灭菌的自来水冲洗所有的三个组。最初的适应时间之 后，对所有的组喂食补充每克1%草酸的标准饮食。遵循标准方案制备试验材料和安慰剂对照。在使用前，分析各试 验材料的代表样品来证实同一性、纯度以及试验胶囊的效力，以及来 证实剂量给药期间安慰剂对照材料中不存在axa/o^"er/or甜'gew^。饮食被限制在早晚两次填喂15分钟之后的1小时内以确保胶囊被 空腹给药。水不限量供给。每天记录食物消耗两次。在第1天(草酸补 充物饮食前)以及此后一周一次收集粪便以及24小时的尿液样品。通过 重复的测定分析分析尿液数据中交叉剂量组以及时间的平均尿参数的 差异。也包括剂量组与时间的相互关系来评价剂量组和时间之间任意 可能的相互关系。结果分析结果显示剂量组和时间之间有统计上显著的相互关系 (pO.OOOl)，因为所有参数表明尿参数与时间交叉的分布不同于与剂量 组交叉的分布。为有助于解释这些相互关系，根据各参数的时间点对 数据进行分析来测定剂量组的平均尿参数之间是否有差异。这些分析 显示对于小剂量和高剂量组，从开始到第7天尿草酸盐增加了(两个组 的p<0.0001)，但是从第7天到第28天没有增加(p = 0.1094小剂量和p =0.6910高剂量)。然而，安慰剂组从开始到第28天有增加(p《.0010)。 同样在21天和28天，安慰剂组I中的平均尿草酸盐水平显著地高于低 剂量组(组II)和高(组III)剂量组，但是低剂量和高剂量之间没有显著性 差异。因此，与喂食安慰剂的大鼠相比，治疗的大鼠的尿草酸盐排泄 明显降低了。
实施例7口服对患原发性高草酸尿(PH)病人的尿草酸盐水平 的影响。方法有九个用活组织检査证明患有原发性高草酸尿(PH)病人参与该研 究。接收开始的基本评价后，所有受试者与主餐一起施用Ocfl/oZ^c^ /orm/ge"^ 1 g细胞糊状物O10"cfus/克)持续4周。在此期间，所有病 人继续接受正常的药物治疗，食用正常的饮食，并且保持它们的液体 摄入和正常的一样高。除了菠菜和大黄根，不禁用高草酸盐的食物。 在第5和6周测定草酸杆菌定殖及其对尿和草酸盐血浆水平的影响。 跟踪具有正常肾功能的受试者的尿草酸盐排泄以及患有晚期肾病 (ESRD)的受试者的血浆草酸盐来评价疗效。结果1. 治疗证明了具有正常尿功能的受试者的尿草酸盐显著的下降。 九个受试者之中有七个受试者的血浆草酸盐显著降低。患ESRD的两 个受试者的血桨草酸盐急剧下降，证明肠道消除了进入内脏中的内源 性草酸盐以免跨上皮梯度。2. 每一餐消耗从0.25g到2.0g的a/onw'ge"^菌株HC-1可以被接收包含平均或高草酸盐水平饮食的正常、健康的志愿者所容忍。持 续28天每天两次1.0 gm细胞糊状物的剂量可以被PH病人较好的耐受。实施例8用草酸盐还原酶组合物治疗高危病人对原发性高草酸尿病人施用一或多种包含冻干草酸盐-还原酶组 合物肠溶包衣胶囊，所述组合物包括草酸脱羧酶和/或草酸盐氧化酶， 优选与每天的两次正餐一起每天两次施用。施用有效量的酶组合物。
例如，每个规格-2的胶囊包含大约5-100单位的各种酶。对于高危受试者而言，应长时间的连续给药，或许是终生性的治 疗。当治疗停止时，定殖将下降。含有草酸盐还原酶的草酸盐还原组合物的肠溶衣胶囊可施用于处 于草酸盐相关疾病高危状态的病人群体。这些人包括1. 由于例如遗传缺损类原发性高草酸尿产生过多内源草酸盐的人2. 由于肠道疾病(肠源性-高草酸尿)处于具有高尿草酸盐的尿石病危险中的人3. 具有尿石病病史患有多急性发作自发性结石病的人。4. 由于晚期肾病具有高血清草酸盐水平的人。5. 具有外阴前庭炎的人。6. 诸如在印度和沙特阿拉伯的某些特定地区和季节食用高水平草 酸盐的人。这些也包括偶然优选用草酸盐含量高诸如菠菜的食物的个体。将本发明的组合物提供给了上述的任意人或者动物。例如，用设 计用于将其内容物递送到大肠内的胶囊对具有比正常内源草酸盐水平 更高水平的人一天治疗两次，其中胶囊包含大约具有类似于通过107 cfus的草酸盐-降低细菌，例如a/orm/ge^^提供的酶活性的有效量的 酶组合物。胶囊优选与食物一起施用。实施例9用草酸盐还原酶组合物治疗低危病人还可以将包括草酸盐还原酶，草酸盐脱羧酶和/或草酸盐氧化酶的 混合物的肠衣保护的草酸盐降低组合物，例如以在肠溶衣胶囊中提供 的，施用于草酸盐-有关疾病的低危人群或具有患草酸盐-有关病征危险的人群。以理想的治疗方案施用有效量的酶组合物。理想地，将组合物施用于这些他们处于草酸盐-相关病征的危险中 的病人时较短的时间或与有助于改善草酸盐-相关病征的物质一起施 用。这些病人还可以有规律地接收草酸盐-降低组合物的治疗，作为食 品例如乳或酸奶酪的补充物或添加剂。这些包括因口服抗生素治疗或 患痢疾丧失正常草酸盐降解细菌菌群的人或婴幼儿。低危的人或动物用设计用于将其内容物递送到大肠的胶囊治疗一 天两次，其中胶囊含有有效量的酶组合物。例如，每个规格-2的胶囊含有约5-100个单位的每种酶。胶囊优选与食物一起施用。应该理解，在这里描述的实施例和实施方案仅仅用于说明性的目 的。且对其进行各种的修饰或改变对本领域技术人员来说时显而易见 的，并且这些被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。
权利要求
1.降低草酸盐浓度的方法，包括，给人和动物施用有效量的包含一或者多种草酸盐还原酶的组合物，其中该量可以有效降低所存在的草酸盐的比例。
2. 权利要求1的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶为草酸盐 氧化酶，草酸盐脱羧酶，草酰-CoA脱羧酶或甲酰基-CoA转移酶或其组
3. 权利要求1的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶来自所有来源。
4. 权利要求3的方法，其中的草酸盐还原酶是重组产生的。
5. 权利要求l的方法，其中的组合物进一步包括辅酶，辅因子， 底物和其他草酸盐降解途径的替代物。
6. 权利要求l的方法，其中的组合物包括肠溶衣。
7. 权利要求l的方法，其中通过口服施用途径进行施用。
8. 治疗草酸盐相关病症的方法，包括，给人和动物施用有效量的包含一或者多种草酸盐还原酶的组合 物，其中该量可以有效降低人和动物体内所存在的草酸盐的比例。
9. 权利要求8的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶为草酸盐 氧化酶，草酸盐脱羧酶，草酰-CoA脱羧酶或甲酰基-CoA转移酶或其组
10. 权利要求8的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶来自所 有来源。
11. 权利要求10的方法，其中的草酸盐还原酶是重组产生的。
12. 权利要求8的方法，其中的组合物包括肠溶衣。
13. 权利要求8的方法，其中通过口服施用途径进行施用。
14. 权利要求8的方法，其中的组合物进一步包括辅酶，辅因子， 底物和其他草酸盐降解途径的替代物。
15. 权利要求8的方法，其中的组合物每天施用超过一次。
16. 预防草酸盐相关病症的方法，包括，给人和动物施用有效量的包含一或者多种草酸盐还原酶的组合 物，其中该量可以有效降低人和动物体内所存在的草酸盐的比例。
17. 权利要求16的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶为草酸 盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，草酰-CoA脱羧酶或甲酰基-CoA转移酶或其组合。
18. 权利要求16的方法，其中的一或者多种草酸盐还原酶来自所 有来源。
19. 权利要求16的方法，其中的草酸盐还原酶是重组产生的。
20. 权利要求16的方法，其中的组合物包括肠溶衣。
21. 权利要求16的方法，其中通过口服施用途径进行施用。
22.权利要求16的方法，其中的组合物进一步包括辅酶，辅因子， 底物和其他草酸盐降解途径的替代物。
全文摘要
本发明涉及用于降低人、动植物中的草酸盐的方法和组合物。例如，本发明提供了将一或多种草酸盐-还原酶递送到人和动物肠道中的方法和组合物。该方法和组合物可用于治疗和预防草酸盐-相关的病症。
文档编号A61K35/74GK101166421SQ200580024172
公开日2008年4月23日 申请日期2005年6月15日 优先权日2004年6月15日
发明者哈梅特·锡杜 申请人:奥克斯泰拉公司