Tc－83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法

专利名称：Tc－83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法
背景技术：
本发明涉及重组DNA技术，且具体涉及将外来核酸引入真核细胞，且更具体涉及生产对免疫治疗和/或基因治疗应用有用的甲病毒属复制子颗粒的组合物和方法。具体地，本发明公开了基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)疫苗株TC-83的甲病毒属复制子颗粒系统的遗传背景。
甲病毒属是披膜病毒科(Togaviridae)的成员，多种病毒被归入甲病毒属。甲病毒属基因组是单链信使有义RNA，5’末端被甲基化帽修饰和3’末端被可变长度的聚腺苷酸带修饰。含有单个病毒蛋白，壳体的结构亚基与RNA基因组结合在二十面体的核壳中。在病毒粒体中，核壳由覆盖着规律排列的跨膜蛋白突起的脂质被膜围绕，每个突起由两个糖蛋白E1和E2的三个异源二聚体复合物组成。参见Paredes等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909095-9099。新培斯病毒和塞姆利基森林病毒被认为是原型甲病毒属并已被广泛研究。参见Schlesinger，The Togaviridae and Flaviviridae，PlenumPublishing Corp.，New York(1986)。VEE病毒也已被广泛研究，参见例如美国专利号5,185,440，5,505,947和5,643,736。
繁殖缺陷性甲病毒属颗粒，称作甲病毒属复制子颗粒作为病毒载体送递系统已经显示出巨大前景。构建复制子以携带可代替一些或全部甲病毒属结构基因的一个或多个异源抗原。复制子连同表达不是该复制子编码的病毒结构蛋白的辅助构建体一起被引入甲病毒属允许细胞，或做为选择，复制子被引入能够表达该结构蛋白的包装细胞。然后复制子被所表达的结构蛋白包装，类似于完整甲病毒属基因组的包装。接着，将这些包装的复制子或甲病毒属复制子颗粒接种给动物。该颗粒进入宿主细胞，然后复制子从次基因组mRNA以非常高水平表达引入的异源编码序列或其他功能性序列。随后的病毒子代被阻止装配，因为复制子并不编码全部必需的病毒包装(结构)基因。
复制子的甲病毒属遗传背景和用于包装复制子的甲病毒属结构蛋白都对复制子颗粒的最终性能具有重要影响。在甲病毒属当中，优选VEE病毒作为疫苗载体，因为它天然嗜淋巴细胞，这在相对低的免疫剂量下引发强烈的细胞和体液免疫反应(Davis，NL等人，(1996)J.Virol.70(6)3781-7；MacDonald，GH和Johnston RE，(2000)J.Virol.74(2)914-922；Caley IJ等人，(1997)J.Virol.713031-3038；Hevey M等人，(1998)Virology 251(1)28-37；Caley IJ等人，(1999)Vaccine 1723-24；Pushko，P等人，(2001)Vaccine 19142-153)。
已知几个委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)株，且在那些株内，已经识别了亚型。已经在新大陆热带和亚热带地区的马科动物蚊媒流行性脑脊髓炎期间分离了有毒力的VEE株。最具毒力的兽疫株之一Trinidad驴(TRD)株，其属于IA/B亚型，在组织培养中连续传代以产生称为TC-83的活减毒株(Berge等人，(1961)Amer.J.Hyg.73209-218)。这个株在大多数人和马中可诱导产生VEE特异性中和抗体并已在两个物种中成功用作疫苗(McKinney等人，(1972)“Inactivated and live VEE vaccines-A Review，in VenezuelanEncephalitis，pp.369-376，Sc.Pub.No.243 Pan American HealthOrganization，Washington，D.C.；Walton TE等人，(1972)Am.J.Epidemiol 95247-254；Pittman PR等人，(1996)Vaccine 14(4)337-343)。尽管如此，这个疫苗在安全和功效方面仍存在几个问题。首先，在人疫苗中它可以引起不利的，有时是中等严重的反应。其次，TC-83株显示出残留的鼠毒性且在脑内(i.c.)或皮下(s.c.)接种后对乳鼠是致死的(Ludwig G等人，(2001)Am.J.Trop.Med.Hyg.Jan-Feb；64(1-2)49-55)。第三，TC-83株在人中具有相当大的无反应者百分比，即接种后不显示出明显体液反应的个体(Pittman PR等人，(1996)Vaccine 14(4)337-343)。最后，已知与亲本TRD株或VEE的其他兽疫株相比，TC-83株对干扰素特别敏感(Spotts，DR等人，(1998)J.Virol.7210286-10291)。这种对干扰素增加的敏感性将引导人们料想复制子颗粒中的异源基因在感染细胞中表达效率较低和/或这种颗粒在体内免疫原性将较低。所有这些与VEE的TC-83疫苗株有关的有害因素已引导以前的研究者寻求更好的减毒株以用作有繁殖能力的VEE载体或用在复制子颗粒系统中(例如Davis NL等人，(1994)Arch.Virol.Suppl.999-109；Davis NL等人，(1996)J.Virol.70(6)3781；Pushko等人，(1997)同前；Pratt WD等人，(2003)Vaccine 21(25-26)3854-3862)。
继续需要最优化突变和甲病毒属株的组合以提供用于疫苗和/或基因治疗应用的最有效甲病毒属复制子颗粒。
发明概述本发明提供了有传染性、复制缺陷性、高免疫原性的基于具体甲病毒属株即VEE的TC-83的甲病毒属复制子颗粒组合物及其制备方法。如前所述(参见例如美国专利号5,792,462；6,156,558；5,811,407；6,008,035；6,583,121；WO 03/023026；美国公开号2003/0119182，全部在此引入作为参考)，已由几个不同的甲病毒属及其嵌合体制成了功能性的甲病毒属复制子颗粒(例如参见美国公开号2003/0148262)。这些颗粒对疫苗和基因治疗应用有用，且在这些应用中甲病毒属复制子颗粒的最佳特性不同。例如，它可能用于降低基因治疗应用过程中从复制子表达蛋白，且因此本域已经开发了技术来降低这种表(参见例如美国专利号5,843,723和6,451,592)。在疫苗应用的情况下，最大化从复制子表达异源RNA，最小化任何抗载体反应，和靶向免疫系统的组织和细胞是需要的特征。已证明甲病毒属委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和南非虫媒病毒86号在疫苗应用中特别有用。为提高这些甲病毒属载体在产生可复制病毒的罕见事件中的安全性，在甲病毒属基因组片段中引入至少一个减毒突变。本发明人现已发现VEE的TC-83株可以用作甲病毒属复制子颗粒系统的遗传背景，其提供了用于免疫原性组合物的惊人有效的VEE颗粒制剂且它具有对疫苗载体系统有用的其他惊人有利性能，包括轻易制备纯化制剂的能力。
本发明人已发现VEE的TC-83株是衍生得到复制子疫苗颗粒的好得出奇的甲病毒属株。TC-83序列的全序列已公开(Kinney RM等人，(1989)Virology 17019-30；且在Kinney RM等人，(1993)J.Virol.67(3)1269-1277记录有校正)。这个活减毒疫苗株的基因组与其所来源的毒性亲本株有12处差异。这些突变是在5’非编码区的第3位核苷酸的单个核苷酸置换(G→A)；在nsP2-16(Ala→Asp)、nsP3-260(Ser→Thr)、E2-7(Lys→Asn)、E2-85(His→Tyr)、E2-120(Thr→Arg)、E2-192(Val→Asp)、E2-296(Thr→Ile)和E1-61(Leu→Ile)的氨基酸置换；在E2-278(U→C)和E1-211(A→U)的两个沉默核苷酸置换；和在3’非编码区的第11,405位核苷酸的单个核苷酸缺失(UU→U)。Kinney等人，1993同前，已提示活TC-83株的减毒表型(即在小鼠中的神经毒力降低)是由于第3位核苷酸突变(G突变为A)和E2突变，特别是E2-120突变。已经表明这个第3位核苷酸突变当引入VEE野生型株时，使该株减毒(White LJ等人，(2001)J.Virol 753706-3718)。然而，所用方法不排除来自其他突变的贡献，而且TC-83基因组中很多其他非保守突变的存在使得不可能预测它是否可以充当复制子颗粒系统的有效遗传背景。
本发明人现在基于TC-83株生产了复制子颗粒疫苗，并且它具有疫苗和基因治疗应用的几个惊人有利特征，包括但不限于与用基于野生型VEE或基于携带其他减毒突变的VEE的颗粒所达到的产量相比，它的产量高得多；抗载体反应降低；纯度增加；免疫原性极好，可与仅携带一个、两个或三个减毒突变的其他VEE株相比，且与动物对用作疫苗的活TC-83株的显著无反应性相反，没有无反应性。
另外，本发明人已发现甲病毒属复制子包装在VEETC83结构蛋白中导致从细胞培养物产生的复制子颗粒疫苗产量显著更高。因此，VEETC83结构蛋白可以有利地用于包装来自其他甲病毒属的复制子，包括其他VEE株。
因此，本发明提供了一种重组甲病毒属颗粒，其包括(i)编码一个或多个异源RNA序列的甲病毒属复制子RNA，其中复制子RNA包含启动甲病毒属RNA转录的5’序列、一同编码复制子RNA复制所需的那些TC-83甲病毒属非结构蛋白的一个或多个核苷酸序列、表达异源RNA编码的多肽的工具和3’RNA聚合酶识别序列，(ii)TC-83衍生的壳体蛋白；和(iii)来源于TC-83的甲病毒属糖蛋白。
本发明还提供了其他VEE疫苗株，特别是具有类似于TC-83的特征的疫苗株，其可以被工程改造以用于免疫原性复制子颗粒组合物。
还提供了一群有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒，其中该群体包括包含VEE TC-83复制子RNA的复制子颗粒，该复制子RNA包含甲病毒属包装信号、编码目的核酸的一个或多个异源RNA序列且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列，且其中该群体的每108个TC-83复制子颗粒中含有不超过10个有复制能力的TC-83病毒颗粒。
还提供了包含一群有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒的组合物，其中(1)每个颗粒包含编码一个或多个异源RNA序列的甲病毒属复制子RNA且缺乏编码任何甲病毒属结构蛋白的序列，(2)如通过细胞培养物上传代测定的，该群体没有可检测到的有复制能力的病毒(RCV)，(3)复制子RNA来源于TC-83，且其中该群体与药物可接受载体一起配制。甲病毒属结构蛋白可以来源于甲病毒属VEE疫苗株TC-83、野生型VEE株、或在编码结构蛋白的甲病毒属基因组序列中含有一个或多个减毒突变的其他VEE株。在具体实施方案中，TC-83结构蛋白可以具有引入的一个或多个另外的减毒突变，例如在E1-81(例如从Phe突变为Ile)。
还提供了包含一群有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒的组合物，其中(1)每个颗粒包含编码一个或多个异源RNA序列的甲病毒属复制子RNA且缺乏编码任何甲病毒属结构蛋白的序列，(2)包含颗粒外壳的结构蛋白来源于VEETC83，和(3)如通过细胞培养物上传代测定的，该群体没有可检测到的有复制能力的病毒(RCV)，且其中该群体与药物可接受载体一起配制。在这个组合物中，甲病毒属复制子RNA来源于野生型VEE株或在复制子内所含的甲病毒属基因组序列中含有一个或多个减毒突变的VEE其他非TC83株。在具体实施方案中，TC-83结构蛋白可以具有引入的一个或多个另外的减毒突变，例如在E1-81(例如从Phe突变为Ile)。
还提供了一种在受试者中产生免疫反应的方法，其包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，该组合物包含处于药物可接受载体中的一群传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒，其中该组合物包含含有VEE TC-83复制子RNA的颗粒，该复制子RNA包含甲病毒属包装信号、编码免疫原的一个或多个异源RNA序列，且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列，且其中该组合物的每108个TC-83复制子颗粒中具有少于10个有复制能力的TC-83颗粒。
还提供了生产有传染性的、繁殖缺陷性甲病毒属颗粒的辅助细胞，其包含(1)包含异源RNA序列且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列的VEETC83复制子RNA，所述异源RNA序列例如是对病毒异源的编码序列；和(2)编码TC-83结构蛋白的一个或多个核酸。可供选择地，结构蛋白可以选自野生型VEE结构糖蛋白、VEE 3014结构糖蛋白、VEE 3040糖蛋白、VEE 3042糖蛋白和VEE 3526糖蛋白，但是优选从含有赋予减弱的毒性的氨基酸置换的VEE结构糖蛋白中选择，且由野生型序列或自我蛋白酶解位点已缺失的序列产生VEE壳体。
还提供了生产有传染性的、繁殖缺陷性甲病毒属颗粒的辅助细胞，其包含(1)包含异源RNA序列且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列的甲病毒属复制子RNA，所述异源RNA序列例如是对病毒异源的编码序列；和(2)编码TC-83结构蛋白的一个或多个核酸。
本发明进一步提供了一种生产有传染性的、繁殖缺陷性的TC-83复制子颗粒的方法，其包括将编码所有VEE结构蛋白的重组DNA分子和编码至少一个异源RNA的TC-83复制子RNA引入一群细胞，从而使得产生有传染性的、繁殖缺陷性的TC-83复制子颗粒，且其中VEE结构糖蛋白来源于下列VEE株之一TC-83、3014、3040、3042和3526。这些株在此称为VEETC83、VEE3014等等。
还提供了一种生产有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属复制子颗粒的方法，其包括将编码所有VEETC83结构蛋白的重组DNA分子和编码至少一个异源RNA的甲病毒属复制子RNA引入一群细胞，从而使得产生有传染性的、繁殖缺陷性的复制子颗粒，且其中VEE复制子RNA来源于野生型VEE株或掺入了至少一个减毒突变，如第3位核苷酸突变为A。
一种生产有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属复制子颗粒的方法，其包括将(i)两个重组核酸分子，每个编码至少一个，但不是全部VEE结构蛋白和(ii)编码至少一个异源RNA的TC-83复制子RNA引入一群细胞，其中所述两个重组核酸分子一同编码在细胞中产生有传染性的、繁殖缺陷性的TC-83复制子颗粒所需的全部VEE结构蛋白，且此外，其中甲病毒属结构蛋白来源于下列VEE株之一TC-83、3014、3040、3042和3526。在本申请中，这些株通常称为“VEETC83”、“VEE3014”等。
还提供了一种通过肝素亲和层析提供有利纯化的、有传染性的、繁殖缺陷性的TC-83复制子颗粒的方法，所述肝素亲和层析是柱或分批纯化方法。TC-83衍生的复制子颗粒独特的肝素结合特征允许通过单一纯化步骤除去污染蛋白和核酸。
还提供了在受试者中引发免疫反应的方法，其包括给受试者施用免疫原性量的本发明的复制子颗粒群体。
本发明还适用于生产活减毒甲病毒属疫苗，其可以或可以不携带在受接种者中表达的异源基因，如美国专利号5,643,576所述，或指导功能性RNA(如反义、抑制性RNA或干扰性RNA或编码治疗性蛋白的RNA表达的活减毒甲病毒属载体。本发明的方法包括步骤(a)将TC-83复制子核酸引入宿主细胞，其中所述复制子核酸含有至少甲病毒属包装信号和至少一个在所述甲病毒属复制子核酸中可表达的目的蛋白或功能性RNA的编码序列，其中宿主细胞能够表达产生ARPs、产生修饰的宿主细胞所需的甲病毒属结构蛋白；(b)在允许结构蛋白表达和甲病毒属复制子核酸复制的条件下，在培养基中培养所述修饰的宿主细胞，然后包装甲病毒属复制子核酸以形成ARPs；(c)任选从培养基分离修饰的宿主细胞，和(d)步骤(b)或(c)后，使修饰的宿主细胞接触具有至少大约0.20M、理想地为约0.5至约5M离子强度的水溶液，(在此“释放培养基(ReleaseMedium)”)以将ARPs释放到水溶液以产生含有ARP的溶液。释放培养基的离子强度可以使用不灭活病毒粒体或ARPs的盐来实现，且合适的盐包括但不限于氯化钠、氯化镁、氯化铵、乙酸铵、氯化钾、氯化钙、碳酸氢铵和肝素Fast Flow。理想地，释放培养基包含pH约6至约9，优选约6.5至约8.5的缓冲液。在细胞不从培养基分离出来的情况下，可以通过添加固体盐或浓溶液增加培养基的离子强度，以为从细胞中释放ARPs(或病毒粒体)提供增加的离子强度。
附图简述

图1显示了肝素亲和层析过程中TC-83病毒复制子颗粒的洗脱图。
图2显示了肝素亲和层析后TC-83病毒复制子颗粒的SDS-PAGE结果，其中蛋白通过银染和通过使用壳体特异性和糖蛋白特异性抗体的蛋白印迹和染色而显现。
图3是TC-83复制子克隆载体pVEK的质粒图。
发明详述提供下列讨论和定义以提高本公开内容对本领域普通技术人员而言的清楚性。
在本申请的上下文中，nm是指纳米，ml是指毫升，VEE是指委内瑞拉马脑炎病毒、EMC是指脑心肌炎病毒、BHK是指幼仓鼠肾细胞、HA是指血凝素基因、GFP是指绿色荧光蛋白基因、N是指核壳、FACS是指荧光激活细胞分选仪、IRES是指内部核糖体进入位点和FBS是指胎牛血清。措辞“E2氨基酸(例如Lys、Thr等)号”是指E2基因的指定残基的指定氨基酸，并且也用来指E1基因中特定残基的氨基酸。
如在此使用的术语“甲病毒属”在本领域具有通用的意思，且包括各个物种，如VEE、SFV、新培斯、罗斯河(Ross River)病毒、西部马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、基孔贡亚、S.A.AR86、Everglade病毒、Mucambo、巴马森林(Barmah Forest)病毒、米德尔堡(Middelburg)病毒、Pixuna病毒、奥尼永尼永病毒、盖塔病毒、Sagiyama病毒、Bebaru病毒、麻亚若(Mayaro)病毒、乌纳病毒、奥拉病毒、Whataroa病毒、Banbanki病毒、Kyzylagach病毒、Highlands J病毒、Fort Morgan病毒、恩杜穆(Ndumu)病毒和BuggyCreek病毒。要求保护的本发明的构建体和方法中使用的优选甲病毒属是VEE、S.A.AR86、新培斯(例如TR339，参见美国专利号6,008,035)和SFV。
本发明方法中的“甲病毒属允许细胞”是用完全病毒RNA转录物转染后能够产生病毒颗粒的细胞。甲病毒属具有广泛的宿主范围。合适的包装细胞的实例包括但不限于Vero细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、鸡胚胎成纤维细胞、DF-1、293、293T、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和昆虫细胞。
如在此使用的短语“减毒突变”和“减毒氨基酸”是指核苷酸突变(其可以或可以不在编码多肽的病毒基因组区域中)或核苷酸突变编码的氨基酸，在活病毒上下文内，其导致其宿主中由甲病毒属引起的疾病的概率降低(即毒力丧失)，与本领域标准术语一致，参见例如B.Davis等人，Microbiology 132(3d ed.1980)，无论该突变是置换突变，还是符合读框的缺失或插入突变。短语“减毒突变”排除对病毒将是致死的突变，除非这种突变与“恢复”突变组合使用，这致使病毒虽然被减毒但仍有生活力。VEE结构蛋白中的示例性减毒突变包括但不限于Johnston等的美国专利号5,505,947、Johnston等的美国专利号5,185,440、Davis等的美国专利号5,643,576、Johnston等的美国专利号5,792,462和Johnston等的美国专利号5,639,650中描述的那些突变，它们的全部公开内容在此引入作为参考。VEE E1糖蛋白的具体减毒突变包括在氨基酸位置81、272或253的任何一个的减毒突变。由VEE-3042突变体制成的甲病毒属复制子颗粒含有E1-81(E1蛋白的第81位氨基酸)的异亮氨酸置换，且由VEE-3040突变体制成的病毒复制子颗粒含有E1-253的减毒突变。VEE E2糖蛋白的具体减毒突变包括在氨基酸位置76、120或209的任何一个的减毒突变。由VEE-3014突变体制成的甲病毒属复制子颗粒含有E1-272和E2-209的两个减毒突变(参见美国专利号5,792,492)。VEE E3糖蛋白的具体减毒突变包括由第56-59位氨基酸缺失组成的减毒突变。由VEE-3526突变体制成的病毒复制子颗粒含有E3的这个缺失(aa56-59)以及E1-253的第二个减毒突变。通常对于甲病毒属，E3和E2之间切割结构域中的缺失或置换突变使E3/E2多蛋白不被分割，它是减毒的。
术语“5’甲病毒属复制识别序列”和“3’甲病毒属复制识别序列”是指在甲病毒属中发现的序列，或从其衍生的序列，它们被非结构甲病毒属复制酶蛋白识别并引起病毒RNA复制。这些有时被称为5’和3’末端，或甲病毒属5’和3’序列。在本发明的构建体中，这些5’和3’末端的使用将导致两个末端之间编码的RNA序列复制。在甲病毒属中发现的3’甲病毒属复制识别序列的长度通常是大约300个核苷酸，其含有更充分限定的最小的3’复制识别序列。在甲病毒属当中保守的最小的3’复制识别序列是19个核苷酸的序列(Hill等人，J.Virology，2693-2704，1997)。可以用标准分子生物学技术修饰这些序列以进一步最小化重组潜力或引入克隆位点，条件是它们必须被甲病毒属复制机器所识别。
术语“最小的5’甲病毒属复制识别序列”是指允许被甲病毒属非结构蛋白识别，但不引起含有该序列的RNA分子显著的包装/重组的最小序列。在优选实施方案中，最小的5’甲病毒属复制识别序列引起含有那些序列的RNA包装/重组的观察频率中五十至一百倍的降低。辅助子(helper)的包装/重组可以用几个方法估计，例如Lu和Silver描述的方法(J.Virol.Methods 2001，91(1)59-65)。
术语“甲病毒属RNA复制子”、“甲病毒属复制子RNA”、“甲病毒属RNA载体复制子”、“复制子”和“载体复制子RNA”可以互换用于表示表达非结构蛋白基因，从而使得它可以指导其自身复制(扩增)的RNA分子，并且至少包含5’和3’甲病毒属复制识别序列(其可以是如上限定的最小序列，但做为选择可以是甲病毒属的整个区域)、甲病毒属非结构蛋白的编码序列和聚腺苷酸化带。它可以另外含有启动子和/或IRES。对要求保护的发明有用的具体复制子包括基于VEETC83的复制子，在此称为“VEETC83复制子”；基于VEE野生型序列的复制子，在此称为“VEE3000复制子”；和基于VEE3000，但是另外包括TC83中存在的一个减毒突变的复制子，所述突变即在第3位核苷酸突变为“A”，所述复制子在此称为“VEE3000nt3A”。
甲病毒属RNA载体复制子是设计用来表达异源核酸的，例如目的基因，在此也称作异源RNA或异源序列，其可以选自来源于病毒、原核生物或真核生物的各种序列。异源序列种类的实例包括但不限于免疫原，包括抗原性蛋白、细胞因子、毒素、治疗性蛋白、酶、反义序列和免疫反应调节剂。
本发明的甲病毒属RNA复制子也可以被工程改造以表达甲病毒属结构蛋白，由此产生抗结构蛋白所来源的甲病毒属的疫苗。Johnston等和Polo等(在背景中引用)描述了很多用于这种甲病毒属RNA复制子的构建体，且这种构建体在此引入作为参考。要求保护的本发明中使用的甲病毒属RNA复制子的具体实施方案可以含有一个或多个减毒突变，减毒突变是一个或多个核苷酸的核苷酸缺失、添加或置换，或包含重排或嵌合构建的突变，该突变导致含有该突变的活病毒与合适的野生型甲病毒属相比毒性丧失。减毒核苷酸置换(引起复制子中氨基酸改变)的实例包括甲病毒属S.A.AR86中nsP1第538位氨基酸、nsP2等96位氨基酸或nsP2第372位氨基酸的突变。
术语“甲病毒属结构蛋白/多个蛋白”是指由甲病毒属编码的结构蛋白之一或组合。这些是由病毒作为多蛋白产生的并且在文献中通常以C-E3-E2-6k-E1表示。E3和6k用作两个糖蛋白E2和E1的膜移位/转运信号。因此，术语E1在此的使用可以指E1、E3-E1、6k-E1或E3-6k-E1，且术语E2在此的使用可以指E2、E3-E2、6k-E2或E3-6k-E2。
术语“辅助子”或辅助构建体是指能够表达一个或多个甲病毒属结构蛋白的核酸分子。
术语“辅助细胞”和“包装细胞”在此可以互换使用并且是指在其中产生甲病毒属复制子颗粒的细胞。辅助细胞包含编码一个或多个甲病毒属结构蛋白的一组辅助子。如在此公开的，辅助子可以是RNA或DNA。该细胞可以是甲病毒属允许的任何细胞。在要求保护的本发明的某些实施方案中，辅助或包装细胞可以另外包括异源依赖于RNA的RNA聚合酶和/或序列特异性蛋白酶。
术语“甲病毒属复制子颗粒”、“病毒复制子颗粒”、“VRPs”或“重组甲病毒属颗粒”在此可互换使用，意思指掺合了表达一个或多个异源RNA序列的甲病毒属复制子RNA的病毒粒体样结构复合物。一般，病毒粒体样结构复合物包括嵌入脂质被膜的一个或多个甲病毒属结构蛋白，该被膜围绕包含壳体和复制子RNA的核壳。脂质被膜一般来源于产生该颗粒的细胞的质膜。优选，甲病毒属复制子RNA被包含甲病毒属壳体蛋白的核壳结构围绕，且甲病毒属糖蛋白嵌入来源于细胞的脂质被膜。这些复制子颗粒是繁殖缺陷性的(或同义“复制缺陷性的”)，意思是在给定宿主细胞中产生的颗粒在宿主细胞中不能产生子代颗粒，因为缺乏辅助功能，即包装复制子核酸所需的甲病毒属结构蛋白。然而，复制子核酸能够自我复制并且在引入它的宿主细胞内表达。本发明的复制子颗粒可以称为VEETC83复制子颗粒，并且这是指包含TC83复制子RNA、或TC83结构蛋白、或包含TC83复制子RNA和TC83结构蛋白两者的颗粒。
说明书中提及的氨基酸序列中存在的任何氨基酸都具有本领域常规使用的它们通常的三字母和单字母缩写A、Ala、丙氨酸；C、Cys、半胱氨酸；D、Asp、天冬氨酸；E、Glu、谷氨酸；F、Phe、苯丙氨酸；G、Gly、甘氨酸；H、His、组氨酸；I、Ile、异亮氨酸；K、Lys、赖氨酸；L、Leu、亮氨酸；M、Met、甲硫氨酸；N、Asn、天冬酰胺；P、Pro、脯氨酸；Q、Gln、谷氨酰胺；R、Arg、精氨酸；S、Ser、丝氨酸；T、Thr、苏氨酸；V、Val、缬氨酸；W、Try、色氨酸；Y、Tyr、酪氨酸。
如在此使用的，由特殊序列指导的表达是相关下游序列的转录，即从DNA分子产生信使RNA或从甲病毒属次基因组启动子产生信使RNA。如果合适和需要特殊应用，转录的mRNA接着被翻译，即蛋白被合成。因此，在本发明的一个实施方案中，复制子或辅助构建体包含分别指导编码异源目的核酸(NOI)的信使RNA转录或编码一个或多个甲病毒属结构蛋白的mRNA转录的次基因组启动子。这些mRNA在真核细胞内“加帽”，即mRNA 5’末端存在甲基-7-鸟苷(5’)pppN结构(“帽”或“5’帽”)，且这个帽被从该mRNA合成蛋白的翻译起始因子识别。因此，26S启动子指导转录，且“帽”提供翻译的起始信号。
在另一个实施方案中，复制子或辅助构建体包含指导转录的启动子；IRES元件；和编码序列，并且IRES元件被可操作定位，从而使得编码序列的翻译或全部或部分是通过IRES元件指导的不依赖于帽的机制，在WIPO公开号WO 2004/085660中详细描述。特别是，翻译水平的核酸表达的控制通过将内部核糖体进入位点(IRES)引入甲病毒属26S次基因组启动子下游和待翻译的编码序列上游来实现。IRES元件被放置于使得它指导mRNA翻译的位置，由此最小化、限制或阻止mRNA从5’帽起始翻译。这个“IRES指导的”不依赖于帽的翻译不需要或不引起可以改变复制和转录的甲病毒属非结构蛋白基因的任何显著改变。在具体实施方案中，复制子和/或辅助构建体可以包含位于启动子和IRES元件之间的间隔区核酸。间隔区核酸可以包含任何随机或特异性非编码核酸序列或由该序列组成，该序列长度足以防止至少一些，且在有些实施方案中，防止所有从信使RNA 5’帽的翻译，从而使得翻译部分或全部由IRES指导。做为选择，间隔区核酸可以具有给予核酸充分的二级结构以防止从信使RNA 5’帽的至少一些和可能所有翻译活性的长度和序列结构。
合适的IRES元件包括但不限于，来自小RNA病毒的病毒IRES元件，例如脊髓灰质炎病毒(PV)或人肠道病毒71，例如其7423/MS/87及BrCr株；来自脑心肌炎病毒(EMCV)；来自口蹄疫病毒(FMDV)；来自黄病毒属，例如丙型肝炎病毒(HCV)；来自瘟病毒属，例如经典的猪瘟病毒(CSFV)；来自反转录病毒属，例如鼠白血病病毒(MLV)；来自慢病毒属，例如猿免疫缺陷病毒(SIV)；来自细胞mRNA IRES元件如来自翻译起始因子的元件，例如eIF4G或DAP5；来自转录因子，例如c-Myc(Yang和Sarnow，Nucleic Acids Research252800-2807(1997))或NF-κB-抑制因子(NRF)；来自生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)和血小板衍生生长因子B(PDGF B)；来自同源异型基因，例如触角足(Antennapedia)；来自存活蛋白，例如X-连锁的细胞调亡抑制剂(XIAP)或Apaf-1；来自侣伴蛋白，例如免疫球蛋白重链结合蛋白BiP(Martínez-Salas等人，Journal of General Virology 82973-984，(2001))，来自植物病毒，以及现在已知的或以后鉴定的任何其他IRES元件。
在具体实施方案中，本发明的IRES元件可以来源于例如脑心肌炎病毒(EMCV，GenBank登录号NC001479)、蟋蟀麻痹病毒(GenBank登录号AF218039)、果蝇(Drosophila)C病毒(GenBank登录号AF014388)、珀蝽(Plautia stali)肠病毒(GenBank登录号AB006531)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病毒(GenBank登录号AF022937)、Himetobi P病毒(GenBank登录号AB017037)、急性蜜蜂麻痹病毒(GenBank登录号AF150629)、黑蜂王细胞病毒(GenBank登录号AF183905)、锥猎蝽属(Triatoma)病毒(GenBank登录号AF178440)、豌豆蚜(Acyrthosuohon pisum)病毒(GenBank登录号AF024514)、传染性蚕软化病病毒(GenBank登录号AB000906)和/或囊雏病病毒(GenBank登录号AF092924)。此外，已经描述了合成的IRES元件，根据本领域已知方法可以设计它以模仿天然存在IRES元件功能(参见Chappell，SA等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA(2000)97(4)1536-41。
在具体实施方案中，IRES元件可以是昆虫IRES元件或其他非哺乳动物IRES元件，该元件在选择用于包装本发明重组甲病毒属颗粒的特定辅助细胞系中有功能，但是在颗粒的靶宿主细胞(例如，人类受试者)中没有功能或将有最小的功能。这对那些对包装细胞有毒性或对甲病毒属包装过程有害的NOIs有用。
在此使用的用语“结构蛋白”或“甲病毒属结构蛋白”是指包装RNA复制子所需的一个或多个甲病毒属编码的蛋白，并且一般包括成熟甲病毒属中的壳体蛋白、E1糖蛋白和E2糖蛋白(某些甲病毒属，如塞姆利基森林病毒，在成熟外壳中含有另外的蛋白E3)。术语“甲病毒属结构蛋白”是指由甲病毒属编码的一个结构蛋白或它们的组合。这些作为多蛋白合成(来自病毒基因组)并且在文献中通常以C-E3-E2-6k-E1表示。E3和6k用作两个糖蛋白E2和E1的膜移位/转运信号。因此，术语E1在此的使用可以指E1、E3-E1、6k-E1或E3-6k-E1，且术语E2在此的使用可以指E2、E3-E2、6k-E2或E3-6k-E2。
在此描述的编码甲病毒属结构蛋白的核酸序列分布于一个或多个辅助核酸分子(例如第一个辅助RNA(或DNA)和第二个辅助RNA(或DNA))当中。此外，一个或多个结构蛋白可以位于与复制子核酸相同的分子上，前提是从复制子RNA缺失了至少一个结构蛋白，从而使得该复制子和产生的甲病毒属颗粒在生产更多的甲病毒属颗粒方面有繁殖缺陷。如在此使用的术语“缺失的”或“缺失”是指特定片段全体缺失或特定片段足够部分缺失，以致使按照标准使用，该片段不起作用或无功能。参见例如Temin等的美国专利号4,650,764。辅助核酸序列在多个核酸分子中的分布使通过重组事件产生有复制能力的病毒(RCV)的频率降至最低。在不使用甲病毒属识别信号进行复制和转录的DNA辅助构建体的情况下，重组的理论频率低于使用这种信号的二重RNA辅助系统。
辅助细胞，也称为包装细胞，用于产生有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒，必须表达或能够表达足以包装复制子核酸的甲病毒属结构蛋白。该结构蛋白可以由一组RNA产生，一般为两个，这一组RNA与复制子载体相伴引入或在它之前引入辅助细胞。第一个辅助RNA包括编码至少一个甲病毒属结构蛋白，但不编码全部甲病毒属结构蛋白的RNA。第一个辅助RNA可以包含编码甲病毒属E1糖蛋白而不编码甲病毒属壳体蛋白和甲病毒属E2糖蛋白的RNA。做为选择，第一个辅助RNA可以包含编码甲病毒属E2糖蛋白而不编码甲病毒属壳体蛋白和甲病毒属E1糖蛋白的RNA。在进一步的实施方案中，第一个辅助RNA可以包含编码甲病毒属E1糖蛋白和甲病毒属E2糖蛋白而不编码甲病毒属壳体蛋白的RNA。在第四个实施方案中，第一个辅助RNA可以包含编码甲病毒属壳体而不编码甲病毒属糖蛋白的RNA。在第五个实施方案中，第一个辅助RNA可以包含编码壳体和一个糖蛋白，即E1或E2，但不同时编码二者的RNA。
在优选实施方案中，两个辅助RNA与这些第一个辅助RNA中任何之一组合使用，所述第二个辅助RNA编码不由第一个辅助RNA编码的一个或多个甲病毒属结构蛋白。例如，第一个辅助RNA仅仅编码甲病毒属E1糖蛋白的情况下，第二个辅助RNA编码甲病毒属壳体蛋白和甲病毒属E2糖蛋白两者。第一个辅助RNA仅仅编码甲病毒属壳体蛋白的情况下，第二个辅助RNA编码两个甲病毒属糖蛋白。第一个辅助RNA仅仅编码甲病毒属E2糖蛋白的情况下，第二个辅助RNA编码甲病毒属壳体蛋白和甲病毒属E1糖蛋白两者。第一个辅助RNA编码壳体和甲病毒属E1糖蛋白的情况下，第二个辅助RNA可以包括编码甲病毒属壳体蛋白和甲病毒属E2糖蛋白之一或二者的RNA。
在所有的辅助核酸中，应当理解这些分子进一步包含在辅助细胞中表达(包括翻译和适用时的转录或复制信号)所编码的结构蛋白序列所需的序列。这种序列可以包括例如启动子(病毒、原核或真核，诱导型或组成型)、IRES和5’和3’病毒复制酶识别序列。在辅助核酸表达一个或多个糖蛋白的情况下，本领域理解用核酸构建体中结构蛋白编码区N-末端的前导或信号序列有利地表达这些序列。前导或信号序列可以源自于甲病毒属，例如E3或6k，或它可以是异源序列，如组织纤溶酶原激活物信号肽或合成的序列。因此，例如，第一个辅助核酸可以是编码壳体-E3-E1的RNA分子，且第二个辅助核酸可以是编码壳体-E3-E2的RNA分子。可供选择地，第一个辅助RNA可以单独编码壳体，且第二个辅助RNA可以编码E3-E2-6k-E1。另外，存在于病毒基因组中的包装信号或“壳体化序列”并不是在所有辅助核酸中都存在。优选地，从所有辅助核酸中缺失任何这种包装信号。
甲病毒属颗粒的产生本发明的甲病毒属复制子颗粒是如下产生的，通过将辅助构建体和复制子核酸引入辅助细胞以致于辅助和复制子分子发挥作用以产生甲病毒属复制子颗粒。在利用RNA辅助子的实施方案中，辅助子可以以很多方法引入细胞。RNA可以作为可在辅助细胞中表达而不整合入细胞基因组中的RNA或DNA分子引入。引入方法包括电穿孔、病毒载体(例如SV40、腺病毒、野田村病毒、星状病毒)和脂质介导的转染。可供选择地，它们可以由一个或多个表达盒表达，该表达盒已稳定转化入细胞，由此确立了包装细胞系(参见例如美国专利号6,242,259)。
在其他实施方案中，辅助子是编码将病毒复制子RNA包装入传染性甲病毒属复制子颗粒所需的全部多肽的单个DNA分子。单个DNA辅助子可以用本领域已知的任何方法引入包装细胞，包括用电穿孔，一般用与RNA摄取所需相比增加的电压，但是所述电压不足以高至破坏包装细胞产生有传染性的甲病毒属复制子颗粒的能力。DNA辅助子可以在甲病毒属RNA载体复制子引入/表达之前、相伴或之后引入。可供选择地，以这种形式和在诱导型启动子下，辅助子功能可以在甲病毒属RNA载体复制子引入/表达前掺入包装细胞基因组，然后就在甲病毒属RNA载体复制子引入之前、相伴或之后用适当的刺激诱导。
表达甲病毒属结构蛋白的重组DNA分子还可以由在体内自行分解成两个分离分子的单个辅助子产生。因此，使用单个辅助子保留了容易制备和生产效率方面的优点，同时在没有使用二重表达系统的情况下，获得了二重辅助系统的优点。可以使用DNA辅助构建体，而在第二组，使用RNA辅助载体。Smith等“Alphavirus Replicon VectorSystems”，美国专利公开号2003-0119182A1详细描述了这种系统，在此引入作为参考。
对于DNA辅助构建体，使用指导RNA从DNA转录的启动子，即依赖于DNA的RNA聚合酶。在本文中，启动子是被聚合酶识别且足以引起相关联(下游)序列转录的核苷酸序列。在请求保护的本发明的一些实施方案中，该启动子是组成型的(参见下文)。可供选择地，可以调节启动子，即，非组成型地作用以引起相关联序列的转录。如果是诱导型的，则存在介导表达调节的序列，以致于相关联序列仅在(i)在其中或其上培养细胞的培养基中存在诱导物分子时，或(ii)细胞暴露的条件改变为诱导条件时转录。在本文中，转录调节序列包括启动子序列，且可以进一步包括用于关联序列响应环境信号的可调节的表达的顺式作用序列。
在RNA辅助子的实施方案中，使用启动子合成体外转录反应中的RNA，且适于这个用途的特异性启动子包括SP6、T7和T3 RNA聚合酶启动子。在DNA辅助子的实施方案中，启动子在细胞内起作用以指导RNA转录。用于构建体体内转录的潜在启动子包括真核启动子如RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子，或病毒启动子如MMTV和MoSV LTR、SV40早期区、RSV或CMV。用于本发明的许多其他合适的哺乳动物和病毒启动子是本领域可以利用的。可供选择地，来自细菌或噬菌体的依赖于DNA的RNA聚合酶启动子，例如SP6、T7和T3，可以在体内使用，同时通过单独的质粒、RNA载体或病毒载体向细胞提供匹配的RNA聚合酶。在具体实施方案中，匹配的RNA聚合酶可以在诱导型启动子控制下稳定转化入辅助细胞系。
在细胞内起作用的DNA构建体可以起转染入细胞的自主质粒的作用或它们可以稳定转化入基因组。在这些实施方案中，启动子可以是组成型启动子，即当引入细胞且与下游序列可操作连接时，在引入细胞后指导下游序列转录，而不需要添加诱导物分子或改变诱导条件的启动子。可供选择地，该启动子可以是诱导型的，以致当细胞暴露于适当的刺激(诱导物)时，细胞将仅仅产生构建体编码的有作用的信使RNA。当使用诱导型启动子时，辅助构建体在暴露于诱导物同时、之前或之后被引入包装细胞，且当构建体和诱导物都存在时发生甲病毒属结构蛋白表达。可供选择地，设计用来在细胞内起作用的构建体可以通过病毒载体引入细胞，例如腺病毒、痘病毒、腺伴随病毒、SV40、逆转录病毒、野田村病毒、小RNA病毒、水泡性口膜炎病毒和具有哺乳动物pol II启动子的杆状病毒。
一旦辅助细胞中存在编码本发明的辅助子或甲病毒属RNA复制子载体的RNA转录物(mRNA)(通过体外或体内方法，如上所述)，则它将最终被翻译以产生所编码的多肽或蛋白。在某些实施方案中，甲病毒属RNA载体复制子从DNA质粒体外转录，然后通过电穿孔引入辅助细胞。在其他实施方案中，本发明的RNA载体复制子从转染入辅助细胞的DNA载体质粒体内转录(例如参见美国专利号5,814,482)，或通过病毒或病毒样颗粒递送至辅助细胞。
在本发明的实施方案中，编码甲病毒属RNA复制子或辅助子的一个或多个核酸包含来源于VEETC83基因组的序列，该序列含有如上文所述的有助于TC83疫苗株的减毒性质的突变。此外，编码甲病毒属结构蛋白，即壳体、E1糖蛋白和E2糖蛋白的一个或多个核酸，或复制子构建体可以含有一个或多个另外的减毒突变。
免疫受试者的方法如在此使用的“引起免疫反应”和“免疫受试者”包括在受试者中对由本发明的颗粒和/或组合物产生的蛋白和/或多肽(例如免疫原、抗原、免疫原性肽和/或一个或多个表位)形成体液和/或细胞免疫反应。“体液”免疫反应，正如本领域熟知的这个术语，是指包括抗体的免疫反应，而“细胞”免疫反应，正如本领域熟知的这个术语，是指包括T-淋巴细胞和其他白细胞的免疫反应，特别是由HLA-限制的细胞溶解T-细胞即“CTL”引起的免疫原特异性反应。当加工的免疫原，即肽片段与主要组织相容性复合体(MHC)HLA蛋白相结合展示时，发生细胞免疫反应，所述HLA蛋白具有两个一般类型I型和II型。I型HLA-限制的CTL通常结合9-聚体肽并且将那些肽呈递在细胞表面上。HLA I型分子上下文中的这些肽片段被T-淋巴细胞上的特异性T-细胞受体(TCR)蛋白识别，从而引起T-细胞活化。活化可以引起许多功能性结果，包括但不限于特异性T-细胞亚型的扩增，从而通过细胞毒性或细胞凋亡事件直接导致携带HLA-肽复合物的细胞破坏或活化非破坏性机制，例如干扰素/细胞因子的产生。免疫原通过I型MHC蛋白呈递通常刺激CD8+CTL反应。
细胞免疫反应的另一个方面包括HLA II型限制的T-细胞反应，包括辅助T细胞的活化，其刺激和集中于对在其表面上展示与MHC分子结合的肽片段的细胞的非特异性效应细胞的活性。至少两个类型的辅助细胞被识别T-辅助1细胞(Th1)，其分泌细胞因子白细胞介素2(IL-2)和干扰素-γ，和T-辅助2细胞(Th2)，其分泌细胞因子白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素10(IL-10)。通过II型MHC蛋白呈递免疫原通常引起CD4+CTL反应以及B淋巴细胞的刺激，其引起抗体反应。
在此使用的“免疫原性多肽”、“免疫原性肽”或“免疫原”包括在受试者中引起免疫反应的任何肽、蛋白或多肽，且在某些实施方案中，免疫原性多肽适于给受试者提供对抗疾病的一定程度的保护。这些术语可以与术语“抗原”互换使用。
在某些实施方案中，本发明的免疫原可以包含一个或多个“表位”、基本上由该表位组成或由该表位组成。“表位”是参与由特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基。在T细胞上下文中，表位定义为被T细胞受体蛋白和/或MHC受体识别所需的氨基酸残基。在体内或体外免疫系统背景中，表位是指分子的集体特征，如一级、二级和/或三级肽结构，和/或电荷，它们共同形成被免疫球蛋白、T细胞受体和/或HLA分子识别的位点。在B-细胞(抗体)表位的情况下，它一般是最少3-4个氨基酸，优选至少5个，在最多大约50个氨基酸的范围内。优选，体液反应诱导性表位为5至30个氨基酸，通常为12至25个氨基酸，和最通常为15至20个氨基酸。在T-细胞表位的情况下，表位包括至少约7-9个氨基酸，且对于辅助T细胞表位，至少约12-20个氨基酸。一般，这种T-细胞表位将包括约7至15个氨基酸，例如7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
使用本发明的甲病毒属颗粒在受试者中表达编码免疫原性多肽的核酸(例如对于疫苗接种)或为了免疫治疗(例如，以治疗患有癌症或肿瘤的受试者)。因此，在疫苗的情况下，本发明因此提供了在受试者中引起免疫反应的方法，其包括给受试者施用免疫原性量的一群甲病毒属颗粒。
“免疫原性量”是足以在施用了包含甲病毒属颗粒的药物制剂的受试者中引起免疫反应的传染性甲病毒属颗粒的量。据信每剂约104至约109的量，特别是106至108传染性单位的量是合适的，这取决于所治疗受试者的年龄和物种。示例性的药物可接受载体包括但不限于无菌无致热原水和无菌无致热原的生理盐水溶液。
本发明的“受试者”包括但不限于恒温动物，例如人、非人灵长类、马、母牛、猫、狗、猪、大鼠和小鼠。本发明各种组合物(例如核酸、颗粒、群体、药物组合物)的施用可以通过几个不同途径的任一个完成。在具体实施方案中，该组合物可以肌内、皮下、腹膜内、皮内、鼻内、颅内、舌下、阴道内、直肠内、经口或局部施用。该组合物在此可以通过皮肤划痕法，或通过贴剂或液体经皮施用。该组合物可以以生物可降解材料的形式皮下递送，该材料在一段时间内释放该组合物。
本发明的组合物可以预防性地用于预防疾病或治疗性地用于治疗疾病。可以治疗的疾病包括由病毒、细菌、真菌或寄生物引起的传染病和癌症。还可以治疗包括畸变或异常蛋白表达或正常蛋白超表达的慢性疾病，例如阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、中风等。
本发明的组合物可以被最优化且与其他疫苗接种方案组合，以提供可能的最广泛(即免疫反应的所有方面，包括在上文描述的那些特征)的细胞和体液反应。在某些实施方案中，这可以包括使用异源预处理(prime)-加强策略，其中本发明的组合物与包含一种不同疫苗接种形式的组合物组合使用，如下列的一个或多个来源于病原体或肿瘤的免疫原、重组免疫原、裸核酸、与含脂质的部分配制的核酸、非甲病毒属载体(包括但不限于痘载体、腺病毒载体、疱疹载体、水泡性口膜炎病毒载体、副粘液病毒载体、细小病毒载体、乳多空病毒载体、逆转录病毒载体)及其他甲病毒属载体。病毒载体可以是病毒样颗粒或核酸。甲病毒属载体可以是含有复制子的颗粒、基于DNA的含有复制子的载体(有时称为“ELVIS”系统，参见例如美国专利号5,814,482)或裸RNA载体。在具体实施方案中，VRPs可以用于预处理接种，随后是使用上面所列组合物之一的一次或多次加强接种。可供选择地，VRPs可以用在使用上面所列组合物之一预处理接种后的一次或多次加强接种中。
本发明的组合物还可以用于产生抗慢性或潜伏传染物的免疫反应，所述传染物通常持续起作用，因为它们不能在受试者中引起强烈的免疫反应。例证性的潜伏或慢性传染物包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒和人乳头瘤病毒。编码来自这些传染物的肽和/或蛋白的本发明的甲病毒属复制子颗粒可以根据在此描述的方法施用于细胞或受试者。
可供选择地，免疫原性蛋白或肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。优选，肿瘤或癌症抗原在癌细胞表面上表达。对于具体乳腺癌的示例性癌症抗原是HER2和BRCA1抗原。其他例证性的癌症和肿瘤细胞抗原在S.A.Rosenberg，(1999)Immunity 10281中描述，并且包括但不限于MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE &、SART-1、PRAME、p15和p53抗原、肾母细胞瘤抗原、酪氨酸酶、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶(HAAH)和EphA2(上皮细胞酪氨酸激酶，参见国际专利公开号WO 01/12172)。
本发明的免疫原性多肽或肽还可以是“通用的”或“人造的”癌症或肿瘤细胞抗原，如国际专利公开号WO 99/51263所述，其对于这类抗原的教导的全部内容在此引入作为参考。
在各种实施方案中，本发明的异源核酸可以编码反义核酸序列。“反义”核酸是与全部或部分核酸(例如基因、cDNA和/或mRNA)互补(即能够在体内或在严格体外条件下杂交)的核酸分子(即DNA或RNA)，所述全部或部分核酸编码所靶向的在反义核酸作用下抑制或减少产生的多肽，或其参与编码该多肽的核酸的表达。在反义核酸与编码所靶向多肽的一部分核酸互补的情况下，反义核酸应该与编码该多肽的核酸5’末端足够紧密地杂交，从而它抑制功能性多肽的翻译。一般地，这意思指反义核酸应该与它所杂交的核酸5’二分之一或三分之一内的序列互补。
本发明的反义核酸还可以编码通过水解编码靶基因产物的mRNA而抑制靶核酸在细胞中表达的催化性RNA(即核酶)。另外，锤头RNA可以用作反义核酸以防止内含子剪接。可以根据反义技术领域常规的方案产生和检验本发明的反义核酸。
克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术，和各种分离技术是本领域技术人员已知和通常使用的。很多标准技术在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(ed.)(1993)Meth.Enzymol.218，PartI；Wu(ed.)(1979)Meth.Enzymol.68；Wu et al.(eds.)(1983)Meth.Enzymol.100 and 101；Grossman和Moldave(eds.)Meth.Enzymol.65；Miller(ed.)(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose(1981)Principles of Gene Manipulation，Universityof California Press，Berkeley；Schleif和Wensink(1982)PracticalMethods in Molecular Biology；Glover(ed.)(1985)DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(eds.)(1985)Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK；Setlow和Hollaender(1979)Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York；以及Ausubel等人(1992)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York，NY和在其中参考的其他来源中描述。缩写和命名，在使用的情况下，被认为是本领域标准的且在专业杂志如在此引用的杂志中最常使用。
本申请中引用的所有参考文献在此以与本公开内容不矛盾的程度引入作为参考。
当在此使用马库什基团或其他基团时，该基团的所有单个成员和该基团的所有组合和可能的亚组合(subcombination)意欲逐一包括在本公开内容中。当说明书中给出一个范围时，例如，温度范围、时间范围或组成范围，所有中间值和子范围，以及包括在该给定范围中的所有的单个值都意欲包括在本公开内容中。
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本领域普通技术人员会认识到除了具体示例的那些之外的方法、技术、程序，例如收集和/或纯化技术或程序、原材料、培养基和试剂，可以用于实施本发明，而不需依靠过度的试验。所有本领域已知的任何这种方法、技术、程序、原材料、培养基和试剂的功能等同物意欲包括在本发明中。
尽管在此的说明书含有很多具体叙述和实例，但是这些不应被认为限制本发明的范围，而仅仅是提供本发明一些实施方案的例证。在此引用的所有参考文献在此以与本说明书公开内容不矛盾的程度引入作为参考。在此提供的一些参考文献在此引入作为参考，以提供关于本发明另外的原材料、另外的合成方法、另外的分析方法和另外的用途的详细情况。
为了例证目的，提供下列实施例，并且它们不意欲限制在此要求保护的本发明的范围。本领域技术人员想到的例证内容中的任何变化意欲落在本发明的范围内。
实施例实施例1 TC-83复制子的产生基于VEE的TC-83株的复制子质粒是由从疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)获得的TC-83传染性cDNA克隆pVE/IC-92产生的。这个克隆的序列被Kinney等人，(1993)J.Virol.-671269公开。pVE/IC-92序列不同于TC-83病毒基因组序列之处在于在E1-119存在Ala-Val突变(Kinney引入的克隆人为构造)和在nsp1中存在三个沉默突变(1613A→G；1616C→A；1619T→C)，该沉默突变被特意引入，以将由克隆衍生的病毒与基因组序列区别开来。本发明人鉴定了pVE/IC-92克隆中E1位置的另外的沉默突变。“沉默”意思是核酸序列的改变不引起所述核酸序列编码的氨基酸的改变。
TC-83复制子载体(“pVEK”)是如下产生的，首先将编码卡那霉素抗性的可表达序列(“KN(R)”)转入TC-83全长克隆以产生pVEK/IC-92。插入多克隆位点取代TC-83结构蛋白基因，这通过用ApaI和NotI限制性内切酶消化具有VEE 26S启动子和3’UTR(非翻译区)的现存VEE复制子(如pERK质粒，参见美国专利公开号2002-141975，实施例2)，并将那个片段连接入pVEK/IC-92的相同位点。所产生的质粒使用COLE1复制起点(ORI)在细菌中复制并且含有TC-83 5’和3’UTR、TC 83非结构蛋白(nsP)序列、VEE 26S启动子和多克隆位点，全部置于T7聚合酶启动子下游，以用于体外RNA转录。
可供选择地，TC-83克隆的结构蛋白被替换为嵌合异源基因，例如HIV gag(GAG)基因、编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因或甲病毒属(VEE、EEE或WEE)糖蛋白多蛋白序列。
产生第二个基于TC-83的复制子，其中VEE 26S启动子驱动异源基因转录，而插入启动子下游的内部核糖体进入位点(IRES)用于指导从次基因组RNA翻译(在此称为“IRES复制子”和具体来说是“VEETC83IRES”)。从pERK-342EnGGAG(在此也称为“VEE3000IRES”)产生这个复制子，它是基于野生型VEE的复制子，含有342bp序列(SEQ ID NO1)(来自pCDNA3.1 DNA消化的AluI片段；Invitrogen，Inc；Carlsbad，CA)，所述序列在pERK的次基因组启动子和EMCV IRES之间的EcoRV限制性内切酶位点作为ApaI-SphI片段插入pVEK-IC92。插入342bp序列以确保IRES是翻译控制元件，且其具有下列序列CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG由于EMCV IRES中ApaI限制性内切酶位点的存在，两步进行克隆。
复制子质粒如下产生用质粒转化大肠杆菌(E.coli)，然后使用Marligen Biosciences(Ijamsville，MD)高纯度质粒纯化系统分离DNA质粒，该系统利用专有离子交换树脂以生产高度纯化的质粒DNA。可供选择地，可接受产生无RNA、蛋白或内毒素的DNA的另一个DNA纯化程序。
使用T7聚合酶，使等分试样的纯化复制子质粒从NotI线性化质粒DNA体外转录。一般地，使用T7 RiboMAX表达系统(Promega，Madison，WI)，其含有允许大规模RNA生产的T7 RNA聚合酶、重组RNsinRNA酶抑制剂和酵母无机焦磷酸酶的混合物。然后使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所产生的RNA，该试剂盒利用基于硅胶的膜以结合RNA并纯化它以使其不含污染蛋白。可供选择地，可接受产生溶于无RNA酶的水中的纯化RNA的另一个RNA纯化方案。
实施例2 TC-83辅助子的产生A.DNA辅助子TC-83 DNA辅助子由pCDNA-VSp构建而来，后者在美国专利公开号2003-0119182，实施例5中描述。pCDNA-VSp是其中VEE3014VEE结构蛋白直接从CMV启动子表达的DNA辅助子。使用SpeI和ScaI限制性内切酶从pVE/IC-92消化含有TC-83突变的糖蛋白基因序列并将其连接入已经用相同酶消化的pCDNA-Vsp。使用快速改变定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)，和引物TC83E1119F(GCCTTGCGGATCATGCTGAAGCATATAAAGCGC)(SEQ IDNO2)和TC83E1119R(GCGCTTTATATGCTTCAGCATGATCCGCAAGGC)(SEQ ID NO3)修复在E1-119引入的突变，以产生pCDNA-TC83r，该突变是由Kinney等人，(1993)J.Virol.见上文，指出但未校正，作为进行cDNA克隆以产生VE/IC-92的人为构造。
将DNA辅助质粒转化的大肠杆菌培养物送至Puresyn，Inc.(Malvern，PA)，在那里它们生长并使用PolyFlo技术纯化所产生的DNA，从而产生至少5mg/ml并且无可检测到的RNA、ssDNA、线性质粒或染色体DNA的DNA制剂。
B.RNA辅助子VEE株TC-83(“VEETC83”)壳体结构蛋白不含有任何氨基酸突变，因此TC-83壳体辅助子可以由任何VEE株构建而来，例如如Pushko等人，1997和美国专利号5,792,462；6,156,558；5,811,407和6,008,035所述。TC83糖蛋白辅助子从pCDNA-TC83r构建而来，(如上所述)，这通过用SpeI和NdeI消化并克隆入已用相同酶消化而除去3014糖蛋白序列，留下5’和3’序列的VEE糖蛋白辅助RNA(在上述参考文献和美国专利公开号2002-0141975，实施例4中描述，在此并入作为参考)中来实现。在某些实施方案中，E1 81的另外突变(从Phe突变为Ile)通过定点诱变被工程改造进入TC-83糖蛋白辅助子，在此称为“GP-E181I”。
使用T7聚合酶，使每个辅助质粒从NotI线性化质粒DNA体外转录，恰如对上述复制子质粒所述的。
实施例3用各种辅助子包装TC-83复制子VEETC83复制子颗粒(VRPs)通过TC83复制子RNA(表达HIV GAG基因)和一个或多个辅助核酸(参见表1)共同电穿孔入Vero细胞而产生。电穿孔后，将细胞接种入含有OptiPRO(Gibco，Carlsbad，CA)的2个T300瓶并温育大约18小时。从每个瓶中取出培养基，并向每瓶添加10ml溶于10mM磷酸钠缓冲液中的0.5M盐洗涤液，并在收集和过滤之前在室温下温育大约5分钟。通过将96孔板中Vero细胞上的盐洗涤和/或收集的培养基系列稀释物在37℃和5％CO2下温育过夜来滴定VRP。使用对MeOH固定的Vero细胞上的抗-GAG间接免疫荧光测定检测GAG VRP感染的细胞，且通过计数具体稀度下GAG阳性的细胞来测定滴度。类似地，通过计数UV显微镜下，具体稀度下GFP阳性细胞数目来测定GFP-VRP滴度。表1显示了结果。
表1.
**IRES＝含有异源基因的翻译在IRES控制下的复制子实施例4.
A.用TC-83结构蛋白包装表达各种异源甲病毒属糖蛋白基因的VEETC83复制子使用表达来自TC-83株的完整甲病毒属结构多蛋白的单个TC-83DNA辅助子包装表达各种异源核酸的复制子。在这个实施例中，异源基因是来自其他甲病毒属的糖蛋白盒。还包括表达来自TC-83或3014株的VEE糖蛋白的TC-83复制子。在这些构建体的每一个中，编码糖蛋白的异源核酸包含来自各个病毒的E3-E2-6k-E1多蛋白。糖蛋白盒鉴定如下“WEE CBA87”来自西部马脑炎病毒株Cba 87，且“EEE4002”来自东部马脑炎病毒株Florida 91。
对于WEE盒，将WEE病毒糖蛋白基因(Cba 87株)的核苷酸序列克隆入TC-83复制子，其从E3氨基末端丝氨酸密码子开始直到E1羧基末端精氨酸密码子(SEQ ID NO4)，如下
TCACTAGTTACAGCGCTGTGCGTGCTTTCGAATGTCACATTCCCTTGCGACAAACCACCCGTGTGCTATTCACTGGCGCCAGAACGAACACTCGACGTGCTCGAGGAGAACGTCGACAATCCAAATTACGACACGCTGCTGGAGAACGTCTTGAAATGTCCATCACGCCGGCCCAAACGAAGCATTACCGATGACTTCACGCTGACCAGTCCCTACCTGGGGTTCTGCCCGTATTGCAGACACTCAGCGCCATGTTTTAGCCCAATAAAAATTGAGAACGTGTGGGACGAATCTGATGATGGGTCGATTAGAATCCAGGTCTCGGCACAATTCGGCTACAATCAGGCAGGCACTGCAGACGTCACCAAGTTCCGGTACATGTCTTACGACCACGACCATGACATCAAGGAAGACAGTATGGAGAAATTAGCTATTAGTACATCCGGACCATGCCGTCGTCTTGGCCACAAAGGGTACTTCCTGTTAGCTCAATGTCCTCCAGGTGACAGTGTAACCGTCAGTATCACGAGCGGAGCATCTGAGAATTCATGCACCGTGGAGAAAAAGATCAGGAGGAAGTTTGTCGGTAGAGAGGAGTACTTGTTCCCACCTGTCCATGGAAAGCTGGTAAAGTGCCACGTTTACGATCACTTGAAGGAGACGTCTGCCGGATATATAACTATGCACAGGCCAGGCCCACACGCGTATAAGTCCTACCTGGAGGAAGCGTCAGGCGAAGTGTACATTAAACCACCTTCTGGCAAGAACGTCACCTACGAATGTAAGTGTGGTGACTACAGCACAGGTATTGTGAGCACGCGAACGAAGATGAACGGCTGCACTAAAGCAAAACAATGCATTGCCTACAAGCGCGACCAAACGAAATGGGTCTTCAACTCGCCGGATCTTATTAGGCACACAGACCACTCAGTGCAAGGTAAACTGCACATTCCATTCCGCTTGACACCGACAGTCTGCCCGGTTCCGTTAGCTCACACGCCTACAGTCACGAAGTGGTTCAAAGGCATCACCCTCCACCTGACTGCAACGCGACCAACATTGCTGACAACGAGAAAATTGGGGCTGCGAGCAGACGCAACAGCAGAATGGATTACGGGGACTACATCCAGGAATTTTTCTGTGGGGCGAGAAGGGCTGGAGTACGTATGGGGCAACCATGAACCAGTCAGAGTCTGGGCCCAGGAGTCGGCACCAGGCGACCCGCATGGATGGCCGCATGAGATCATCATCCATTATTATCATCGGCATCCAGTCTACACTGTCATTGTGCTGTGCGGTGTCGCTCTGGCTATCCTGGTAGGCACTGCATCGTCAGCAGCTTGTATCGCCAAAGCAAGAAGAGACTGCCTGACGCCATACGCGCTTGCACCGAACGCAACGGTACCCACAGCATTAGCAGTTTTGTGCTGTATTCGGCCAACCAACGCTGAAACATTTGGAGAAACTTTGAACCATCTGTGGTTTAACAACCAACCGTTTCTCTGGGCACAGTTGTGCATCCCTCTGGCAGCGCTTATTATTCTGTTCCGCTGCTTTTCATGCTGCATGCCTTTTTTATTGGTTGCAGGCGTCTGCCTGGGGAAGGTAGACGCCTTCGAACATGCGACCACTGTGCCAAATGTTCCGGGGATCCCGTATAAGGCGTTGGTCGAACGTGCAGGTTACGCGCCACTTAATCTGGAGATTACGGTCGTCTCATCGGAATTAACACCCTCAACTAACAAGGAGTACGTGACCTGCAAATTTCACACAGTCGTTCCTTCACCACAAGTTAAATGCTGCGGGTCCCTCGAGTGTAAGGCATCCTCAAAAGCGGATTACACATGCCGCGTTTTTGGCGGTGTGTACCCTTTCATGTGGGGAGGCGCACAGTGCTTCTGTGACAGTGAGAACACACAACTGAGTGAGGCATACGTCGAGTTCGCTCCAGACTGCACTATAGATCATGCAGTCGCACTAAAAGTTCACACAGCTGCTCTGAAAGTCGGCCTGCGTATAGTATACGGCAATACCACAGCGCGCCTGGATACATTCGTCAACGGCGTCACACCAGGTTCCTCACGGGACCTGAAGGTCATAGCAGGGCCGATATCAGCAGCTTTTTCACCCTTTGACCATAAGGTCGTCATTAGAAAGGGGCTTGTTTACAACTACGACTTCCCTGAGTATGGAGCTATGAACCCAGGAGCGTTCGGCGATATTCAAGCATCCTCTCTTGATGCCACAGACATAGTAGCCCGCACCGACATACGGCTGCTGAAGCCTTCTGTCAAGAACATCCACGTCCCCTACACCCAAGCAGTATCAGGGTATGAAATGTGGAAGAACAACTCAGGACGACCCCTGCAAGAAACAGCACCATTCGGATGTAAAATTGAAGTGGAGCCTCTGCGAGCGACTAACTGTGCTTATGGGCACATCCCTATCTCGATTGACATCCCTGATGCAGCTTTTGTGAGATCATCTGAATCACCAACAATTTTAGAAGTCAGCTGCACAGTAGCAGACTGCATTTATTCTGCAGACTTTGGTGGTTCGCTAACACTACAGTACAAAGCTAACAGAGAGGGACATTGTCCAGTTCACTCCCACTCCACTACAGCTGTTTTGAAGGAAGCGACCACACATGTGACTGCCACAGGCAGCATAACACTACATTTTAGCACATCGAGCCCACAAGCAAATTTCATAGTTTCGCTATGCGGCAAGAAGACCACCTGCAATGCTGAATGTAAACCACCGGCCGACCACATAATTGGAGAACCACATAAGGTCGACCAAGAATTCCAGGCGGCAGTTTCCAAAACATCTTGGAACTGGCTGCTTGCACTGTTTGGGGGAGCATCATCCCTCATTGTTGTAGGACTTATAGTGTTGGTCTGCAGCTCTATGCTTATAAACACACGTAGA对于EEE盒，将EEE病毒糖蛋白基因(Florida 91株)的核苷酸序列克隆入TC-83复制子，其从E3氨基末端丝氨酸密码子开始直到E1羧基末端组氨酸密码子(SEQ ID NO5)，如下
TCGCTCGCCACTGTTATGTGCGTCCTGGCCAATATCACGTTTCCATGTGATCAACCACCCTGCATGCCATGCTGTTATGAAAAGAATCCACACGAAACACTCACCATGCTGGAACAGAATTACGACAGCCGAGCCTATGATCAGCTGCTCGATGCCGCTGTGAAATGTAATGCTAGGAGAACCAGGAGAGATTTGGACACTCATTTCACCCAGTATAAGTTGGCACGCCCGTATATTGCTGATTGCCCTAACTGTGGGCATAGTCGGTGCGACAGCCCTATAGCTATAGAAGAAGTCAGAGGGGATGCGCATGCAGGAGTCATCCGCATCCAGACATCAGCTATGTTCGGTCTGAAGACGGATGGAGTCGATTTGGCCTACATGAGTTTCATGAACGGCAAAACGCAGAAATCAATAAAGATCGACAACCTGCATGTGCGCACCTCAGCCCCTTGTTCCCTCGTGTCGCACCACGGCTATTACATCTTGGCTCAATGCCCACCAGGGGACACGGTTACAGTTGGGTTTCACGACGGGCCTAACCGCCATACGTGCACAGTTGCCCATAAGGTAGAATTCAGGCCAGTGGGTAGAGAGAAATACCGTCACCCACCTGAACATGGAGTTGAACTACCGTGTAACCGTTACACTCACAAGCGTGCAGACCAAGGACACTATGTTGAGATGCATCAACCAGGGCTAGTTGCCGACCACTCTCTCCTTAGCATCCACAGTGCCAAGGTGAAAATTACGGTACCGAGCGGCGCCCAAGTGAAATACTACTGCAAGTGTCCAGATGTACGAGAGGGAATTACCAGCAGCGACCATACAACCACCTGCACGGATGTCAAACAATGCAGGGCTTACCTGATTGACAACAAGAAATGGGTGTACAACTCTGGAAGACTGCCTCGAGGAGAGGGCGACACTTTTAAAGGAAAACTTCATGTGCCCTTTGTGCCTGTTAAGGCCAAGTGCATCGCCACGCTGGCACCGGAGCCTCTAGTTGAGCACAAACACCGCACCCTGATTTTACACCTGCACCCGGACCATCCGACCTTGCTGACGACCAGGTCACTTGGAAGTGATGCAAATCCAACTCGACAATGGATTGAGCGACCAACAACTGTCAATTTCACAGTCACCGGAGAAGGGTTGGAGTATACCTGGGGAAACCATCCACCAAAAAGAGTATGGGCTCAAGAGTCAGGAGAAGGGAACCCACATGGATGGCCGCACGAAGTGGTAGTCTATTACTACAACAGATACCCGTTAACCACAATTATCGGGTTATGCACCTGTGTGGCTATCATCATGGTCTCTTGTGTCACATCCGTGTGGCTCCTTTGCAGGACTCGCAATCTTTGCATAACCCCGTATAAACTAGCCCCGAACGCTCAAGTCCCAATACTCCTGGCGTTACTTTGCTGCATTAAGCCGACGAGGGCAGACGACACCTTGCAAGTGCTGAATTATCTGTGGAACAACAATCAAAACTTTTTCTGGATGCAGACGCTTATCCCACTTGCAGCGCTTATCGTATGCATGCGCATGCTGCGCTGCTTATTTTGCTGTGGGCCGGCTTTTTTACTTGTCTGCGGCGCCTTGGGCGCCGCAGCGTACGAACACACAGCAGTGATGCCGAACAAGGTGGGGATCCCGTATAAAGCTTTAGTCGAACGCCCAGGTTATGCACCCGTTCATCTACAGATACAGCTGGTTAATACCAGGATAATTCCATCAACTAACCTGGAGTACATCACCTGCAAGTACAAGACAAAAGTGCCGTCTCCAGTAGTGAAATGCTGCGGTGCCACTCAATGTACCTCCAAACCCCATCCTGACTATCAGTGTCAGGTGTTTACAGGTGTTTACCCATTCATGTGGGGAGGAGCCTACTGCTTCTGCGACACCGAAAACACCCAGATGAGCGAGGCGTATGTAGAGCGCTCGGAAGAGTGCTCTATCGACCACGCAAAAGCTTATAAAGTACACACAGGCACTGTTCAGGCAATGGTGAACATAACTTATGGGAGCGTCAGCTGGAGATCTGCAGATGTCTACGTCAATGGTGAAACTCCCGCGAAAATAGGAGATGCCAAACTCATCATAGGTCCACTGTCATCTGCGTGGTCCCCATTCGATAACAAGGTGGTGGTTTATGGGCATGAAGTGTATAATTACGACTTTCCTGAGTACGGCACCGGCAAAGCAGGCTCTTTTGGAGACCTGCAATCACGCACATCAACCAGCAACGATCTGTACGCAAACACCAACTTGAAGCTACAACGACCCCAGGCTGGTATCGTGCACACACCTTTCACCCAGGCGCCCTCTGGCTTCGAACGATGGAAAAGGGACAAAGGGGCACCGTTGAACGACGTAGCCCCGTTTGGCTGTTCGATTGCCCTGGAGCCGCTCCGTGCAGAAAATTGTGCAGTGGGAAGCATCCCTATATCTATAGATATACCCGATGCGGCTTTCACTAGAATATCTGAAACACCGACAGTCTCAGACCTGGAATGCAAAATTACGGAGTGTACTTATGCCTCCGATTTCGGTGGTATAGCCACCGTTGCCTACAAATCCAGTAAAGCAGGAAACTGTCCAATTCATTCTCCATCAGGTGTTGCAGTTATTAAAGAGAATGACGTCACCCTTGCTGAGAGCGGATCATTTACATTCCACTTCTCCACTGCAAACATCCATCCTGCTTTTAAGCTGCAGGTCTGCACCAGTGCAGTTACCTGCAAAGGAGATTGCAAGCCACCGAAAGATCATATCGTCGATTATCCAGCACAACATACCGAATCCTTTACGTCGGCGATATCCGCCACCGCGTGGTCGTGGCTAAAAGTGCTGGTAGGAGGAACATCAGCATTTATTGTTCTGGGGCTTATTGCTACAGCAGTGGTTGCCCTAGTTCTGTTCTTCCATAGACATTC-83-VEE复制子颗粒(VRPs)是如下产生的，通过复制子RNA(表达指出的甲病毒属糖蛋白多蛋白)和编码TC-83结构蛋白的单个DNA辅助子共同电穿孔入108个Vero细胞。电穿孔后，将细胞接种入含有OptiPROSFM(Gibco，Carlsbad，CA)的2个T300瓶并温育大约18小时。然后从瓶中取出培养基，并向每瓶添加10ml溶于10mM磷酸钠缓冲液中的0.5M盐洗涤液，并在收集和过滤之前在室温下温育大约5分钟。通过将96孔板中的Vero细胞上收集的的VRP的系列稀释物在37℃和5％CO2下温育过夜来滴定VRP。使用对1∶1丙酮∶MeOH固定的Vero细胞上的抗-WEE、抗-VEE或抗-EEE间接免疫荧光测定检测表达甲病毒属糖蛋白的VRP感染的细胞，且通过计数具体稀度下抗原阳性的细胞来测定滴度。表2显示了结果。
表2.
B.用VEETC83或VEE3014结构蛋白包装表达SARS基因的VEETC83和野生型VEE复制子从SARS冠状病毒壳体克隆(SARS冠状病毒的Urbani株；登录号AY278741；从美国疾病控制和预防中心，Atlanta，GA获得)PCR扩增来自严重急性呼吸综合征病毒(“SARS-S2”)的S2糖蛋白基因，并作为BamHI限制片段插入紧靠pERK复制子(上述实施例1中描述的)的肠道病毒71(EV71)IRES下游。使用3014或TC83结构蛋白将能够表达SARS-S2糖蛋白基因的这个复制子包装入VRPs。结构蛋白从两个分开的RNA辅助子或从单个DNA辅助子表达。对于分开的RNA辅助子方法，将30μg复制子RNA与各30μgVEE壳体RNA辅助子和VEE糖蛋白辅助子(来自VEE3014或VEETC83，参见上面实施例2B)结合并共同电穿孔入1.2×108个Vero细胞。在这个实验中，以0.4cm间隙杯，使用四脉冲，每个在580V和25μF进行电穿孔。对于用单个DNA辅助子(编码VEETC83结构多蛋白或VEE3014结构多蛋白的完整序列)进行包装，将30μg复制子RNA与150μgDNA辅助子结合并在0.4cm间隙杯共同电穿孔入1.2×108个Vero细胞，其中使用单个脉冲，于250V和950μF。产生VRPs，收获并如实施例3A所述进行滴定，且表3报道了每个细胞基础上的得率。使用TC-83糖蛋白辅助子的VRPs的每个细胞得率(如早先描述，壳体序列在VEETC83和VEE3014是相同的)，无论是RNA还是DNA辅助子形式的，都是用3014糖蛋白辅助子回收的得率的几乎4倍。
表3.来自用表达VEE3014或VEETC83糖蛋白基因的RNA对比DNA辅助子电穿孔的细胞的SARS-S2 VRP得率
C.使用VEETC83 DNA辅助子，VRPs的增加的得率3B.中的实验表明VEETC83 DNA辅助子与VRPs更高的得率(EP#_3-5与EP#_6-8比较)有关。在第二组实验中证实了这点，其中用pCDNA-TC83r或pCDNA-VSp辅助子包装表达GAG基因或GFP的复制子RNAs(参见表4)。这些研究还证实了共同电穿孔前，重悬着DNA辅助子的溶液(例如水(H2O)、磷酸缓冲盐水(PBS)或Tris EDTA(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)不显著影响得率，即使DNA在-20℃贮藏许多个月(例如1、3、4、5或6个月)。
表4.来自VEETC83 DNA辅助子对比VEE3014 DNA辅助子的VRP得率
实施例5.TC-83 VRPs的肝素亲和层析将通过1M盐洗涤细胞从Vero细胞收集的TC-83 VRPs，用16mM磷酸钠(SP)pH 7.4稀释至0.12M或更小的氯化钠浓度。然后将溶液加载到含有肝素琼脂糖速流树脂的柱(Amersham)，以5ml/分钟的线速度运行。用氯化钠浓度不断增加(大约120mM至1M)的线性梯度洗脱TC-83 VRPs。以大约3M的氯化钠浓度，于pH7.4洗脱TC-83 VRPs。图1显示了用这个方法纯化的TC-83 VRPs洗脱图。锐利的UV峰(级分14和23之间)相当于VRP洗脱。从柱收集含有大于1e9 VRP的级分(级分18-23)并通过直接稀释于1％人血清清蛋白和5％蔗糖中来配制。配制前，通过SDS-PAGE分级分离纯化的大块VRP的1e8传染性的单位(IU)并通过银染或使用壳体或糖蛋白特异性抗体的蛋白印迹进行分析，以估计纯度(图2)。在银染凝胶中，仅相应于壳体和糖蛋白大小的条带明显，从而表明纯度水平令人惊奇。
实施例6.TC-83 VRPs的免疫原性已经在实验动物中研究了TC-83 VRPs的免疫原性。
用指出的VRP颗粒通过在爪垫中皮下接种指定的剂量来免疫BALB/c小鼠，每组五只动物。将动物免疫三次(以3周间隔)。第一次和第二次加强接种后7天，用GAG ELISA测量体液反应，且在第二次加强接种后7天，用干扰素-γELISPOT测量细胞反应。表6中提供的ELISA和ELISPOT数据分别是几何和算术平均数，其由来自每组的五只小鼠计算而来。用VEE中和测定估计对VEE载体的反应(参见下文)。
表6.在小鼠中的免疫原性，实验1
*3000和3014 VRPs中的复制子在复制子的第3位核苷酸含有变为A的突变**分别用野生型(VEE3000)和VEE3014结构蛋白包装VEE3000和VEE3014 VRPs；VEETC83 VRPs含有用TC83结构蛋白包装的来源于TC83的复制子RNA为证明每个TC-83处理组的每只小鼠都作出体液和细胞两种免疫反应，下列表7中示出了每个处理组记录的五个反应的范围表7.体液和细胞免疫反应(实验1，小鼠)
表8.体液和细胞免疫反应(实验2，小鼠)
*ELISPOT数字是平均值**爪垫注射，10只动物/组，且肌内注射，5只/组**无第3位核苷酸的突变表9.抗载体反应(对于表8中的动物)
也进行灵长类动物研究。在南方研究所(Southern ResearchInstiture)，Frederick，MD的猕猴中实施含有相同HIV C分支gag基因的TC-83复制子疫苗的免疫原性。这个研究中使用的构建体是如上所述的TC-83 IRES复制子，其含有EMCV IRES和342个核苷酸的间隔区序列(参见实施例1)。每个疫苗通过皮下和肌内注射(三只动物/途径)施用于六只动物。动物在第0、1和6月接受三次1×108个疫苗颗粒的接种。每次加强接种后2周，以及第一次加强后20周，即在第二次加强前，分析对gag的体液免疫反应。也测量抗载体反应(参见实施例6C)。通过临床化学和血液学(血红蛋白、WC、血小板计数)获得另外的安全数据，这在每次接种后2周进行。
表10.灵长类动物中的免疫猕猴(单个动物)的ELISA反应施用途径 ELISA(滴定)
表11.ELISA GMT(几何平均滴度，猕猴)
也测量灵长类动物模型中的细胞免疫。使用干扰素-γ ELISPOT测定测量各种VRPs(其中表达HIV gag编码序列)接种的猕猴中的抗-Gag T细胞反应，该测定使用来自HIV Gag蛋白的重叠9聚体或15聚体肽库。表12中提供了阳性反应动物数目/接受接种方案的全部动物的数据。阳性反应动物定义为在减去对无关肽库的反应的背景后，其反应大于10个斑点的动物。
表12.猕猴中的抗Gag T细胞反应
PP＝预处理后，PB1＝第一次加强后，PB2＝第2次加强后*同源辅助子包装的复制子还利用胞内细胞因子染色(ICS)分析法来分析猕猴T细胞反应，其中在第二次加强后6周纯化细胞并用ICS分析对Gag重叠15聚体肽反应的IL-2和IL-4生产。表13中提供了结果，其中阳性反应动物定义为其反应是对无关肽库反应的至少2倍的动物。
表13.接种的猕猴的ICS分析
表14总结了猕猴中累积的T细胞反应。
表14.总结猕猴中的Gag特异性T细胞反应
使用Gag特异性ELISA(酶联免疫吸附测定)测定体液免疫。将来自HIV-1亚型C分离物DU-422(AIDS Res.Hum.Retroviruses.2003 Feb；19(2)133-44)的纯化的重组组氨酸标记的(his)-p55用作包被抗原。简言之，用表达his-p55的VEE复制子RNA转染BHK细胞，并制备Triton-X 100溶解产物。用金属离子亲和(镍)层析，使用市场上可买到的树脂且根据供应商的说明书纯化蛋白。
加强后7天，用标准间接ELISA估计鼠血清中Gag特异性抗体的存在。对于Gag-特异性总Ig的检测，将检测IgM、IgG和IgA的第二个多克隆抗体用于终点滴度测定。简言之，用50μl 0.05M碳酸钠缓冲液，pH 9.6(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)包被96孔Maxisorp ELISA板(Nunc，Naperville，IL)，其中每孔含有40-80ng his-p55。用粘性塑料覆盖板，并在4℃温育过夜。第二天，丢弃未结合的抗原，并将板与200μl封闭缓冲液(含有3％w/vBSA的PBS)在室温下温育1小时。将孔用PBS洗涤6次，并向抗原包被的孔中添加在缓冲液(含1％w/v BSA和0.05％v/v Tween 20的PBS)中连续稀释两倍的50μl测试血清。每个测定中都包括小鼠抗p24单克隆抗体(Zeptometrix，Buffalo，NY)作为阳性对照。每个测定中的阴性对照包括空白(含有除了血清之外的所有试剂和处理的孔)和流血前血清。将板在室温下温育一小时，然后用PBS冲洗6次。向每孔添加50μl/孔的被在稀释缓冲液中稀释至预定浓度的碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗小鼠聚同种型第二抗体(Sigma)，并在室温下温育1小时。添加100μl对硝基苯磷酸(pNPP)底物(Sigma)前，用PBS冲洗孔6次。血清抗体ELISA滴度定义为在405nm下给出超过背景(空白孔)大于或等于0.2的光密度的最大血清稀度的倒数。
使用IFN-γELISPOT测定检测分泌GAG抗原特异性干扰素-γ(IFN-γ)的细胞。如下制备来自TC-83 VRP-GAG-免疫的BALB/c小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液，通过在R-10培养基(补加了100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液、0.01M HEPES、2mM谷氨酰胺和10％热灭活胎牛血清的RPMI培养基1640)中物理破坏脾被膜。用Lympholyte M密度梯度离心(Accurate Scientific，Westbury，NY)分离淋巴细胞，洗涤两次并重悬于新鲜的R-10培养基中。检测全部未分离的脾淋巴细胞群体。
使用小鼠IFN γ ELISPOT试剂盒(Monoclonal AntibodyTechnology，Nacka，瑞典)进行本测定。将活细胞接种入已经被抗IFN-γ单克隆抗体预先包被的Multiscreen Immobilon-P ELISPOT板(ELISPOT认证的96-孔过滤板，Millipore，Bedford，MA)中的单个ELISPOT孔，并温育16-20小时。通过用缓冲液多次洗涤取出细胞，并将孔与生物素化的抗IFN-γ单克隆抗体温育，随后洗涤并与抗生物素蛋白-过氧化物酶-复合体(Vectastain ABC Peroxidase Kit，Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育。温育后，洗涤孔并在室温下与底物(抗生物素蛋白-过氧化物酶复合体片剂，Sigma)温育4分钟，以促进斑点形成，所述斑点代表培养过程中个体IFN-γ分泌细胞的位置。通过用Zeiss KS ELISPOT系统自动分析对板进行计数。
为对来自用表达gag的各种VRP构建体免疫的小鼠的淋巴细胞的Gag特异性IFN-γ分泌细胞计数，用免疫显性CD8 H-2Kd-限制的HIV-Gag肽或无关CD8 H-2Kd-限制的流感-HA肽刺激淋巴细胞16-20小时(5％CO2，37℃)。以10μg/ml测试肽，并以20μg/ml测试nef对照。将细胞减去肽作为背景对照。作为阳性对照，用4μg/mL伴刀豆球蛋白A刺激细胞相似的时间段。合成肽并纯化至于NewEngland Peptide＞90％。
C.VEE中和测定使用VEE复制子颗粒(VRP)测量免疫的动物(小鼠或猕猴)血清样品中的抗委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的中和抗体活性。这个试验是设计用来估计血清中存在的中和抗体对VRP易感细胞有效VRP感染的阻止。在这个测定中，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的限定量的繁殖缺陷性VRP与动物血清系列稀释物混合、温育并接种到细胞单层上。另一个温育时间段后，在紫外线下检查细胞单层的GFP阳性细胞。表达GFP的VRP(“GFP-VRP”)的传染性被血清中的VEE病毒特异性中和抗体阻止或“中和”。
该测定如下进行第1天将来自免疫的动物(小鼠或猕猴)的血清在56℃热灭活30分钟，然后在培养基(含Earle氏盐和L-谷氨酰胺的MEM，Invitrogen 11095072，补加了0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中系列稀释。将这些稀释物与限定量(5×103至1.5×104)的GFP-VRP混合并在4℃温育过夜。第2天向汇合的Vero细胞的96孔板添加50μl血清GFP-VRP混合物并在37℃温育1小时。取出血清GFP-VRP混合物并用100μl新鲜培养基替换，并在37℃温育过夜。第3天在紫外线下定量GFP-阳性细胞的数目。对每个样品测定80％中和水平并被定义为给出每格平均GFP-阳性细胞(GPC)的最大血清稀释度，所述每格平均GFP-阳性细胞小于或等于单独用GFP-VRP感染或用与阴性对照血清(即预免疫血清)预温育的GFP-VRP感染的对照孔中每格GPCs数目的20％。
表15.GAG-VRP免疫的小鼠中的抗-VEE反应
*为计算GMT，将＜1∶10的抗载体滴度任意分配为1的值。
表16.GAG-VRP免疫的弥猴中的抗-VEE反应
1动物标识号2施用途径s.c.＝皮下；i.m.＝肌内3W＝周4PP＝预处理接种后5PB＝第一次加强接种后序列表<110>AlphaVax，IncRayner，JonSmith，Jonathan F.
Hubby，BolynReap，Elizabeth<120>TC-83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法<130>124-03 WO<140>unassigned<141>2005-05-18<150>US 60/572,212<151>2004-05-18<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>342<212>DNA<213>人工的<220>
<223>克隆的DNA片段以确保正确的翻译控制<400>1ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagcttgta 60tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag120atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg180cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc240cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag300cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc ag 342
<210>2<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作引物的寡核苷酸<400>2gccttgcgga tcatgctgaa gcatataaag cgc 33<210>3<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作引物的寡核苷酸<400>3gcgctttata tgcttcagca tgatccgcaa ggc 33<210>4<211>2931<212>DNA<213>人工的<220>
<223>西部马脑炎病毒盒<400>4tcactagtta cagcgctgtg cgtgctttcg aatgtcacat tcccttgcga caaaccaccc 60gtgtgctatt cactggcgcc agaacgaaca ctcgacgtgc tcgaggagaa cgtcgacaat120ccaaattacg acacgctgct ggagaacgtc ttgaaatgtc catcacgccg gcccaaacga180agcattaccg atgacttcac gctgaccagt ccctacctgg ggttctgccc gtattgcaga240cactcagcgc catgttttag cccaataaaa attgagaacg tgtgggacga atctgatgat300
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<210>5<211>2943<212>DNA<213>人工的<220>
<223>西部马脑炎病毒盒<400>5tcgctcgcca ctgttatgtg cgtcctggcc aatatcacgt ttccatgtga tcaaccaccc 60tgcatgccat gctgttatga aaagaatcca cacgaaacac tcaccatgct ggaacagaat 120tacgacagcc gagcctatga tcagctgctc gatgccgctg tgaaatgtaa tgctaggaga 180accaggagag atttggacac tcatttcacc cagtataagt tggcacgccc gtatattgct 240gattgcccta actgtgggca tagtcggtgc gacagcccta tagctataga agaagtcaga 300ggggatgcgc atgcaggagt catccgcatc cagacatcag ctatgttcgg tctgaagacg 360gatggagtcg atttggccta catgagtttc atgaacggca aaacgcagaa atcaataaag 420atcgacaacc tgcatgtgcg cacctcagcc ccttgttccc tcgtgtcgca ccacggctat 480tacatcttgg ctcaatgccc accaggggac acggttacag ttgggtttca cgacgggcct 540aaccgccata cgtgcacagt tgcccataag gtagaattca ggccagtggg tagagagaaa 600taccgtcacc cacctgaaca tggagttgaa ctaccgtgta accgttacac tcacaagcgt 660gcagaccaag gacactatgt tgagatgcat caaccagggc tagttgccga ccactctctc 720cttagcatcc acagtgccaa ggtgaaaatt acggtaccga gcggcgccca agtgaaatac 780tactgcaagt gtccagatgt acgagaggga attaccagca gcgaccatac aaccacctgc 840acggatgtca aacaatgcag ggcttacctg attgacaaca agaaatgggt gtacaactct 900ggaagactgc ctcgaggaga gggcgacact tttaaaggaa aacttcatgt gccctttgtg 960cctgttaagg ccaagtgcat cgccacgctg gcaccggagc ctctagttga gcacaaacac1020
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1.一种制备TC-83衍生的甲病毒属复制子颗粒(ARPs)的方法，所述方法包括步骤(a)将TC-83-衍生的甲病毒属复制子核酸引入宿主细胞，所述复制子核酸包含至少病毒包装信号和至少一个可在所述甲病毒属复制子核酸中表达的异源编码序列或功能性序列，其中所述宿主细胞包括至少一种辅助功能，以产生修饰的宿主细胞；(b)在允许至少一种辅助功能表达的条件下培养所述修饰的宿主细胞，从而允许所述TC-83-衍生的甲病毒属复制子核酸复制和将所述甲病毒属复制子核酸包装以形成ARPs。
2.权利要求1的方法，进一步包括步骤(c)使步骤(b)后的修饰的宿主细胞与离子强度为至少0.2M的水溶液接触以将ARPs释放到水溶液中，以产生含ARP的溶液；(d)从步骤(c)的含ARP的溶液中收集ARPs。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的宿主细胞中的至少一种辅助功能由稳定整合在所述宿主细胞基因组内的核酸序列编码。
4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞中的至少一种辅助功能被引入至少一个辅助核酸上，该核酸编码能够结合所述甲病毒属复制子核酸的壳体蛋白，和至少一个甲病毒属糖蛋白，其中所述甲病毒属糖蛋白与所述甲病毒属复制子核酸和所述壳体蛋白结合，其中至少一个辅助核酸分子与所述甲病毒属复制子核酸一起被引入宿主细胞。
5.权利要求1的方法，其中至少一种辅助功能由至少两个辅助核酸分子编码，其中所述两个辅助核酸分子中的每一个编码至少一种病毒辅助功能。
6.权利要求2的方法，其中所述离子强度为0.5M至5M。
7.权利要求1的方法，其中所述至少一个辅助核酸分子是DNA分子。
8.权利要求1的方法，其中所述复制子核酸通过电穿孔引入所述宿主细胞。
9.权利要求1或2的方法，进一步包括在权利要求2的步骤(c)之前的细胞洗涤步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞洗涤液不含盐和进一步包含DNA酶。
11.一种制备TC-83衍生的甲病毒属复制子颗粒的方法，其包括将甲病毒属复制子载体和一个或多个辅助核酸分子通过电穿孔引入甲病毒属允许细胞，其中电穿孔过程中培养基中的甲病毒属允许细胞处于最小108个细胞/ml培养基的浓度，且其中甲病毒属RNA复制子载体在电穿孔前以每ml大约35μg的浓度加入细胞中。
12.权利要求1或11的方法，其中所述电穿孔在电穿孔杯中进行，其中电极之间的间隙为0.4至1.0cm。
13.权利要求10的方法，其中所述辅助核酸是编码全部甲病毒属结构蛋白的单个DNA分子。
14.权利要求13的方法，其中所述DNA辅助子的浓度是至少100μg/ml。
15.权利要求1或11的方法，其中所述甲病毒属允许细胞培养物是Vero细胞培养物。
16.权利要求1或11的方法，其中步骤(d)之后是离子交换层析步骤。
17.权利要求1或11的方法，其中该方法中使用的盐洗涤步骤选自NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4HCO3和乙酸胺。
18.由权利要求1或17的方法制备的甲病毒属复制子颗粒制剂。
19.TC-83-衍生的甲病毒属复制子核酸。
20.一种在受试者中产生免疫反应的方法，其包括给所述受试者施用有效量的组合物，该组合物包含传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒和药物可接受载体，其中每个颗粒包含甲病毒属复制子RNA，该RNA包含甲病毒属包装信号和编码免疫原的一个或多个异源RNA序列，且其中所述甲病毒属复制子RNA缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列，且其中每个颗粒包含来自VEETC83的结构蛋白。
21.权利要求20的方法，其中该组合物通过肌内、皮下或腹膜内注射施用。
22.权利要求20的方法，其中所述甲病毒属复制子RNA来自委内瑞拉马脑炎病毒。有两个异源RNA序列。
24.一种包含有传染性的、繁殖缺陷性的甲病毒属颗粒的组合物，其中该颗粒包含委内瑞拉马脑炎病毒TC83结构蛋白和甲病毒属复制子RNA，所述甲病毒属复制子RNA包含甲病毒属包装信号和编码至少一个免疫原的一个或多个异源RNA序列，并且所述甲病毒属复制子RNA缺乏编码结构蛋白的序列。
25.权利要求24的组合物，其中所述甲病毒属复制子RNA来自委内瑞拉马脑炎病毒。
26.权利要求24的组合物，其中所述组合物是药物制剂。
27.一种生产有传染性的、繁殖缺陷性甲病毒属颗粒的辅助细胞，其包含(a)编码异源RNA序列并且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列的甲病毒属复制子RNA；(b)编码至少一个但不是全部委内瑞拉马脑炎病毒TC83结构蛋白的第一个辅助RNA；和(c)第二个辅助RNA，该辅助RNA不编码由第一个辅助RNA编码的至少一个委内瑞拉马脑炎病毒TC83结构蛋白并且编码不由第一个辅助RNA编码的至少一个委内瑞拉马脑炎病毒TC83结构蛋白。
28.一种生产有传染性的、繁殖缺陷性甲病毒属颗粒的辅助细胞，其包含(a)编码异源RNA序列并且缺乏编码甲病毒属结构蛋白的序列的甲病毒属复制子RNA；和(b)编码全部委内瑞拉马脑炎病毒TC83结构蛋白的一个或多个辅助DNA质粒。
全文摘要
本公开内容提供了TC－83 VEE－衍生的复制子、甲病毒属复制子颗粒和含有TC－83甲病毒属复制子颗粒的免疫原性组合物，它们当被引入合适的宿主细胞时指导至少一种抗原表达。在此描述的TC－83VEE－衍生的ARPs有所改进，因为它们产生比现有技术的ARPs更低的载体特异性免疫反应。
文档编号A61K39/21GK1989250SQ200580024121
公开日2007年6月27日 申请日期2005年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者J·O·雷纳, J·F·史密斯, B·哈比, E·A·里普 申请人:阿尔法瓦克斯公司