包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物的制作方法

专利名称：包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物、 该纤维素酶调制物的制造方法以及该纤维素酶调制物的用途。
背景技术：
一直以来，为了对含纤维素的纤维赋予所需的特性，用纤维素酶进行处理。例如， 在纤维行业中，为了改善含纤维素的纤维的手感及外观，或为了对被着色的含纤维素的纤维赋予提供其颜色的局部变化的“石洗”的外观，进行了利用纤维素酶的处理(专利文献 1)。到目前为止，通过由丝状菌等纤维素酶产生菌产生的纤维素酶复合物分离对含纤维素的纤维显示高活性的成分，来探索用于这样的用途的纤维素酶。其结果是，被分类为GH 家族5、GH家族12及GH家族45的内切葡聚糖酶主要在含纤维素的纤维中作为显示高活性的纤维素酶被分离出来。例如，作为被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶，已知源自绿色木霉(Trichoderma viride)的SCE3(专利文献2)，作为被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶，已知源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的PPCE (专利文献3)，另外，作为被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶，已知源自坚孢葡萄单孢(Staphylotrichum cocosporum)的 STCE (专利文献4)等。在商业性地制造这些纤维素酶时，一般通过培养将编码该纤维素酶的基因导入到丝状菌等微生物而得到的转化体，作为重组酶使其大量表达来进行。此时，调制出的纤维素酶调制物相对于含纤维素的纤维的活性依赖于大量表达的重组纤维素酶的活性。同样，纤维素酶调制物的PH值特性也依赖于大量表达的重组纤维素酶的性质。例如，SCE3的情况， 其最适PH值为弱酸性(专利文献2)，另外，PPCE的情况，其最适pH值为酸性(专利文献 3)。因此，将它们各自作为重组酶大量表达而得到的纤维素酶调制物也显示与SCE3及PPCE 同样的PH值特性。迄今为止，为了进行纤维素酶调制物的活性的提高和/或性质的改变，主要尝试了探索显示期望的性质的新型纤维素酶、以及利用蛋白质工程学方法来改变现有纤维素酶。但是，为了得到显示与现有纤维素酶相比为飞跃性的优异的活性的纤维素酶，首先，不得不分离出新型的微生物，这本身就不容易。而且，该微生物等产生具有期望的性质的纤维素酶的可能性低。另外，即使利用蛋白质工程学方法在已知的纤维素酶中引入突变，也难以飞跃性地改变其性质。从这些问题考虑，目前的现状是无法得到兼备高活性和优异的PH值特性的纤维素酶调制物。现有技术文献专利文献专利文献1 欧洲专利第307564号公报专利文献2 国际公开第98/54332号小册子
专利文献3 国际公开第2008/111613号小册子专利文献4 国际公开第2005/054475号小册子

发明内容
发明要解决的课题本发明是鉴于这样的状况而完成的，其目的在于提供一种具有高活性且具有优异的PH值特性的纤维素酶调制物。本发明的目的还在于提供一种简便地生产这样的纤维素酶调制物的方法。用于解决课题的方法本发明者为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过生产含有各一定比例以上的源自两种不同的丝状菌的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物，与单独表达各自的内切葡聚糖酶而得到的纤维素酶调制物相比，可得到惊人的高的针对含纤维素的纤维的活性。特别是通过使纤维素酶调制物中含有由源自绿色木霉(Trichoderma viride)的 SCE3(分类为GH家族5)和源自嗜松青霉的PPCE (分类为GH家族12)构成的组合、或者由源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的PPCE和源自坚孢葡萄单孢(Staphylotrichum cocosporum)的STCE (分类为GH家族45)构成的组合作为主要的纤维素酶，从而针对含纤维素的纤维的活性显著增加。另外判明这样得到的纤维素酶调制物的PH值特性与单独表达各自的内切葡聚糖酶所得的纤维素酶调制物相比显示广泛的轮廓(profile)，通过组合两种内切葡聚糖酶，可以改变纤维素酶调制物的PH值特性。进而，本发明者发现，在这样的纤维素酶调制物的生产中，通过将编码源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的DNA导入到同一宿主细胞中并使其表达，与将各自的内切葡聚糖酶单独导入到宿主细胞中并使其表达的情况相比，重组内切葡聚糖酶在分泌蛋白质中所占的比例提高，可得到高活性的培养上清液。S卩，本发明涉及包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物、 该纤维素酶调制物的制造方法、以及该纤维素酶调制物的用途，更具体而言，提供如下 (1) (13)(1) 一种纤维素酶调制物，其包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶；(2)如(1)所述的纤维素酶调制物，其中，内切葡聚糖酶源自两种不同的丝状菌；(3)如(1)所述的纤维素酶调制物，其中，源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶均为重组蛋白质；(4)如(1) (3)中任一项所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶分别以总纤维素酶的至少10重量％被含有；(5)如(4)所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶分别以总纤维素酶的至少20重量％被含有；(6)如(1) (3)中任一项所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶被分类为不同的GH家族；(7)如(6)所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶被分类为GH家族5、GH家族12及GH家族45中的任一者；(8)如(7)所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶为下述(a)或(b)的任一组合(a)由被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶和被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶构成的组合；(b)由被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶和被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶构成的组合；(9)如(8)所述的纤维素酶调制物，其中，被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶是包含序列号2所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质，被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶是包含序列号4所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质，被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶是包含序列号6所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质；(10) 一种生产(3)所述的纤维素酶调制物的方法，其包含培养转化体的工序，所述转化体是将编码两种内切葡聚糖酶的DNA导入到同一宿主细胞而得到的；(11)如(10)所述的方法，其中，宿主细胞为丝状菌；(12) 一种改良后的含纤维素的纤维的制造方法，其包括使含纤维素的纤维与 (1) (3)中任一项所述的纤维素酶调制物接触的工序；(13) 一种由生物质制造糖的方法，其包括使含纤维素生物质与(1) (3)中任一项所述的纤维素酶调制物接触的工序。发明的效果根据本发明，提供一种高活性且在广泛的pH值范围显示活性的纤维素酶调制物。 另外，根据本发明，提供一种简便地生产这样的纤维素酶调制物的方法。通过使用由本发明得到的纤维素酶调制物，可以有效地进行例如含纤维素的纤维的手感、外观的改良和/或生物质的糖化。


图1是表示SCE3单独表达菌株、PPCE单独表达菌株及SCE3-PPCE共表达菌株的绒毛除去活性中的PH值特性的分析结果的图。图2是表示STCE单独表达菌株、PPCE单独表达菌株及STCE-PPCE共表达菌株的绒毛除去活性中的PH值特性的分析结果的图。
具体实施例方式纤维素酶调制物在本发明中，纤维素酶是指具有分解纤维素的活性的酶，另外，纤维素酶调制物是指包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β “葡萄糖苷酶等纤维素酶成分的调制物。本发明的纤维素酶调制物的特征在于，包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶所源自的两种不同的微生物优选为两种不同的丝状菌。作为丝状菌，例如可以举出属于木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)或圆孢霉属(Staphylotrichum)、腐质霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rizopus)、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)的丝状菌，作为优选的实例，可以举出绿色木霉(Trichoderma viride)、嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)或坚孢葡萄单孢(Staphylotrichum cocosporum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、Acremonium cellulolyticus、漂曲霉(Aspergillus niger)、 棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)、米根霉(Rizopus oryzae)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、闪光须霉(Phycomyces nitens)。本发明的纤维素酶调制物中所含的两种主要的内切葡聚糖酶优选从源自不同的微生物、且被分类为不同的GH家族的内切葡聚糖酶中选择。在此，“主要的内切葡聚糖酶” 是指纤维素酶调制物中所含的内切葡聚糖酶中蛋白质重量最多的内切葡聚糖酶。因此，“两种主要的内切葡聚糖酶”是指纤维素酶调制物中所含的内切葡聚糖酶中蛋白质重量最多的内切葡聚糖酶和蛋白质重量第二多的内切葡聚糖酶。蛋白质重量可以通过对纤维素酶调制物进行SDS-PAGE、利用密度测定法分析其电泳图像中的各蛋白质谱带的浓度(蛋白质量) 来算出。此外，某种内切葡聚糖酶除了未分解的物质之外，也存在被分解的物质，因此，在 SDS-PAGE的电泳图像的分析中，有时同一内切葡聚糖酶基因的翻译物作为不同的谱带被观察到。在本发明中，只要是同一内切葡聚糖酶基因的翻译物，则即使在SDS-PAGE的电泳图像中作为不同的谱带被检测出的情况下，也将它们评价为同种的内切葡聚糖酶，计算出蛋白质重量。被分类为不同的GH家族的内切葡聚糖酶优选从被分类为GH家族5、GH家族12或 GH家族45的任一种的内切葡聚糖酶中选择。在此，“GH家族”为着眼于糖苷水解酶的一级结构的分类，具体而言，通过 CAZY 的 TOB 页(http://www. cazy. org/fam/acc_GH. html)中所记载的方法来分类。作为被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶，可以列举源自绿色木霉(Trichoderma viride)的SCE3作为其一例。在此，“SCE3”的代表性天然型蛋白质用序列号2所记载的氨基酸序列表示，在本发明中，只要显示内切葡聚糖酶活性即可，也可以是包含在序列号2所记载的氨基酸序列中缺失、置换、插入或附加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶，可以列举源自嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)的PPCE作为其一例。在此，“PPCE”的代表性天然型的蛋白质用序列号4所记载的氨基酸序列表示，在本发明中，只要显示内切葡聚糖酶活性即可，也可以是包含在序列号4所记载的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶，可以列举源自坚孢葡萄单孢 (Staphylotrichum cocosporum)的STCE作为其一例。在此，“STCE”的代表性天然型的蛋白质用序列号6所记载的氨基酸序列表示，在本发明中，只要显示内切葡聚糖酶活性即可， 也可以是包含在序列号6所记载的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质。在内切葡聚糖酶中被改变的“ 1个或多个氨基酸”通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内，3个氨基酸以内)。在内切葡聚糖酶的某氨基酸被置换为其它氨基酸的情况下，为了维持该内切葡聚糖酶活性，该置换优选为具有同样性质的氨基酸彼此的置换(保守性置换)。在本发明中，纤维素酶调制物中所含的主要的两种内切葡聚糖酶的组合特别优选为SCE3和PPCE的组合、或PPCE和STCE的组合。例如，在SCE3和PPCE的组合中，与各自单独表达的情况相比，每份总纤维素酶可以得到2. 4 3. 0倍左右的惊人的高绒毛除去活性。在这样显著的协同效应的基础上，由该组合得到的纤维素酶调制物的PH值特性与使它们各自单独表达的情况相比，为广泛的轮廓。特别是即使在PH值超过4的情况下，在一定pH值范围内，也可以得到与最适pH值的情况同等水平的高绒毛除去活性。例如在单独表达SCE3的情况下，在pH值为5的条件下， 为最适PH值下的绒毛除去活性的约75%，在单独表达PPCE的情况下，在pH值为5的条件下，为最适PH值下的绒毛除去活性的约30%，但在组合这两者的情况下，即使在pH值为5 的条件下，也可以显示与最适PH值下的绒毛除去活性同等的活性。在此，“同等的活性”是指至少90%以上、优选95%以上、最优选100%的活性。这样，SCE3和PPCE的组合在显示由各自单独的pH值特性无法预想的有利特性的方面也具有特征。另外，例如在PPCE和STCE的组合中，与各自单独表达的情况相比，每份总纤维素酶可以得到3. 2 3. 7倍左右的高绒毛除去活性。在这种显著的协同效应的基础上，由该组合得到的纤维素酶调制物的PH值特性与使各自单独表达的情况相比为广泛的轮廓。本发明的纤维素酶调制物通过含有主要的两种内切葡聚糖酶，如上所述，与各自单独表达的情况相比，具有改变为相对高活性的PH值特性。为了提高纤维素酶调制物的绝对活性，纤维素酶调制物含有主要的两种内切葡聚糖酶各10重量％ (相对总纤维素酶)以上、进一步优选含有20重量％以上。在SCE3和 PPCE的组合中，例如可以为含有40重量％以上SCE3和20重量％以上PPCE的纤维素酶调制物。另外，在PPCE和STCE的组合中，例如可以为含有15重量％以上PPCE和25重量％ 以上STCE的纤维素酶调制物。在此，“总纤维素酶”是指纤维素酶调制物中所含的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶的总重量。例如在以2株绿色木霉菌株为宿主使内切葡聚糖酶作为重组蛋白质表达的情况下，重组内切葡聚糖酶以及作为源自宿主的纤维二糖水解酶的CBH1、 CBH2、作为内切葡聚糖酶的EG1、SCE3、内切葡聚糖酶(GH家族74)、作为β -葡萄糖苷酶的 BGL各自的重量的合计为总纤维素酶量。编码内切葡聚糖酶的DNA及它们的获得在本发明中，编码内切葡聚糖酶的DNA是指编码上述内切葡聚糖酶的氨基酸序列的 DNA。在本发明中，编码内切葡聚糖酶的DNA可以通过以内切葡聚糖酶基因的碱基序列或内切葡聚糖酶的氨基酸序列为基础人工地进行化学合成来得到。另外，编码本发明的内切葡聚糖酶的DNA，可以使用以已知内切葡聚糖酶基因的碱基序列或已知内切葡聚糖酶的氨基酸序列为基础合成的引物，以基因组DNA、cDNA、质粒等含有该基因的DNA为模板，通过 PCR进行扩增。进而，编码本发明的内切葡聚糖酶的DNA也可以通过如下方法来得到将以已知内切葡聚糖酶基因的碱基序列或已知内切葡聚糖酶的氨基酸序列为基础合成的内切葡聚糖酶的部分基因作为探针，从包含该内切葡聚糖酶基因的基因组DNA文库或cDNA文库中筛选包含该内切葡聚糖酶基因的阳性克隆。
另外，为了使导入的编码内切葡聚糖酶的DNA在宿主细胞中作为具有活性的内切葡聚糖酶进行表达，在上述编码内切葡聚糖酶的DNA中优选含有用于选择控制其表达的碱基序列、转化体的基因标记等。作为控制表达的碱基序列，在其中包含启动子、终止子及编码信号肽的碱基序列等。启动子只要在宿主细胞中显示转录活性，就没有特别限定，可以作为控制编码与宿主细胞同种或异种的任一蛋白质的基因表达的碱基序列来获得。另外，信号肽只要在宿主细胞中有助于蛋白质的分泌，就没有特别限定，可以利用由编码与宿主细胞同种或异种的任一蛋白质的基因衍生的碱基序列得到。宿主细胞及其转化在本发明中，作为被导入编码内切葡聚糖酶的DNA的宿主细胞，可以利用大肠杆菌、放线菌、酵母、丝状菌等，但优选使用蛋白质生产性优异的丝状菌。另外，作为用作宿主细胞的丝状菌，可以利用属于腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属 (Trichoderma)、键抱属(Fusarium)、支顶抱属(Acremonium)、或青霉属(Penicillium) 的丝状菌，进而，作为它们优选例，可列举特异腐质霉(Humicola insolens)、黑曲霉 (Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)、或绿色木霉(Trichoderma viride)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)、Acremonium cellulolyticus、或嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)。在本发明中，对编码内切葡聚糖酶的DNA的宿主细胞的导入，除直接导入上述编码内切葡聚糖酶的DNA的方法之外，也可以通过用在宿主细胞内可复制且以能够表达的状态包含由该基因所编码的纤维素酶的表达载体转化宿主细胞的方法来进行。用于宿主细胞的转化的表达载体基本可以构建成作为自主复制载体即染色体外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制的载体，例如质粒。另外，表达载体被导入到宿主微生物中时，也可以插入到该宿主微生物的基因组中，与其所插入的染色体一起被复制。本发明的载体构建的步骤及方法可以使用在基因工程领域中常用的步骤及方法。在本发明中，利用上述编码内切葡聚糖酶的DNA及表达载体的宿主细胞转化，可以按照本领域中常用的方法来进行。将编码内切葡聚糖酶的DNA导入宿主细胞的导入法， 可以通过将编码两种内切葡聚糖酶的DNA或含有它们的表达载体同时导入到宿主细胞中来进行。另外，也可以通过如下将两种纤维素酶基因或含有它们的表达载体阶段性地导入到宿主细胞中的方法来进行将被导入的编码内切葡聚糖酶的DNA或含有它们的表达载体中的一个首先导入到宿主细胞中，接着在得到的转化体中进一步导入编码其它内切葡聚糖酶的DNA或表达载体。另外，在转化时所利用的基因标记可以根据转化体的筛选方法来适宜选择，可以利用例如编码耐药性的基因、补充营养缺陷型的基因。纤维素酶调制物的生产本发明中的纤维素酶调制物的生产，可以将上述转化后的宿主细胞在适当的培养基中培养，由其培养物得到重组纤维素酶。表达两种重组内切葡聚糖酶的宿主细胞的培养及其条件可以与所使用的宿主细胞的培养及其条件本质上相同。纤维素酶的用途在本发明中，通过用上述纤维素酶调制物或利用了该纤维素酶调制物的纤维素酶制剂，对含纤维素的纤维进行处理，可以制造手感及外观改良了的含纤维素的纤维。另外， 可以对被着色的含纤维素的纤维赋予提供其颜色的局部变化的“石洗”的外观。
进而，根据本发明，可以通过用上述重组纤维素酶调制物或利用了该重组纤维素酶调制物的纤维素酶制剂，处理稻秸、甘蔗渣、玉米秸、椰子的果实等果实的榨渣、废木材等生物质，从而由这些生物质制造糖(糖化)。这样得到的糖可以用酵母等进一步发酵而转换为乙醇。实施例利用实施例更具体地说明本发明，但只要不超出其要点，本发明并不限定于以下的实施例。[实施例1]共表达内切葡聚糖酶SCE3和内切葡聚糖酶PPCE的绿色木霉 (Trichoderma viride)的制作(1) SCE3表达质粒pCB_sce3的构建作为源自绿色木霉(Trichoderma viride)的内切葡聚糖酶SCE3的表达载体，使用pCBl-sce3，该pCBl_sce3是将国际公开第98/11239号记载的pCBl_Eg3X用XbaI切割， 将所得的约7kb的片段进行自连接而得到的。(2) PPCE表达质粒pPPCE-M的构建源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的内切葡聚糖酶PPCE表达载体使用国际公开第2008/11613号记载的pPPCE-M。(3)选择标记表达质粒PPYR4的构建包含源自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的pyr4基因的标记质粒使用国际公开第2005/056787号记载的pPYR4。(4)选择标记表达质粒pDT-118的构建在pUCl 18 (宝酒造社制)的XbaI部位上插入具有用XbaI由国际公开第98/03667 中记载的PMKDOl切下的源自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的启动子和终止子的源自Sti^ptomyces rimofacience的越霉素抗性基因(DtR)，构建质粒pDT-118。(5) SCE3单独表达菌株的制作和培养实施例I-(I)中得到的质粒pCBl-SCe3及实施例1_(3)中得到的质粒pPYR4的绿色木霉的转化按照国际公开第2005/056787号中记载的方法进行。即，将作为尿嘧啶生物合成基因(pyr4)缺失株的2株绿色木霉菌株作为宿主，使用粗糙脉孢菌的pyr4基因作为选择标记通过共转化(co-transformation)法实施转化。首先，按照国际公开第 2005/056787号中记载的方法调制2株绿色木霉菌株的原生质体，将得到的原生质体悬浮液100 μ L与7 μ g的pCBl-sce3及3 μ g的pPYR4混合。将混合液在冰冷下静置5分钟， 加入400 μ L的PEG溶液(60%聚乙二醇4000、IOmM氯化钙、IOmM Tris-盐酸缓冲液、pH值 7. 5)，进一步在冰冷下静置20分钟。将进行了以上处理的原生质体悬浮液用SUTC缓冲液 (0. 5M蔗糖、IOmM氯化钙、IOmM Tris-盐酸缓冲液、pH值7. 5)洗涤后，在含有0. 5M蔗糖的基本培养基上与软琼脂一起叠层，在28°C下培养5天。培养后，将长出的菌落再次移植至基本培养基，将在这里长出的菌落作为转化体。将得到的转化体200株接种至PSW培养基 (1. 0%葡萄糖、4. 0%乳糖、2. 0%大豆粕、1. 0%小麦胚芽、0. 2%磷酸二氢钾、0. 2%硫酸铵、 0. 2%磷酸铵、0. 2%碳酸钙)，在28°C下培养5天。培养后，通过离心分离除去菌体，将得到的培养上清液作为粗酶液。将粗酶液进行SDS-PAGE。SDS-PAGE使用七4 7〒4 一七义笑二 STC-808电泳槽(于7 -社制)7° 'J今弋7卜笑二 y卟12% -SDS-PAGEminiU. 0讓凝胶厚度(，” 二社制)，电泳方法按照制品操作说明书。分子量标记使用LMW Calibration For SDS Electrophoresis (GE A ζ》7 K ^才寸^工> 7社制)。电泳后，按照制品操作说明书，用考马斯亮蓝R250( t ^ 7 r ^々社制)进行染色、脱色。其结果是在转化体中特异性地表达45kDa的蛋白质。将表达量特别多的2-99菌株作为SCE3单独表达菌株。(6) SCE3-PPCE共表达菌株的制作和培养用实施例1_(2)中得到的pPPCE-M及实施例1_(4)中得到的pDt_118转化实施例 1-(5)中得到的SCE3单独表达菌株。转化的方法按照实施例1-(5)的方法，将SCE3单独表达菌株作为宿主，使用越霉素抗性基因(DtR)作为选择标记通过共转化法进行转化。使用 7 μ g的pPPCE-M及3 μ g的pDt-118转化SCE3单独表达菌株，在含有20 μ g/ml的潮霉素B 的PDA培养基上与PDA琼脂一起叠层，在28°C下培养5天。培养后，将长出的菌落再次移植至含有潮霉素B的PDA培养基中，将在这里长出的菌落作为转化体，得到70株的转化体。将得到的70株转化体接种至实施例1-(5)中记载的PSW培养基，在28°C下培养5天。培养后， 通过离心分离除去菌体，将得到的培养上清液作为粗酶液。将粗酶液进行SDS-PAGE，结果是在转化体中特异性地表达约26kDa的蛋白质。将表达量特别多的11-8菌株作为SCE3-PPCE 共表达菌株。(7) PPCE单独表达菌株的制作和培养实施例1-⑵中得到的pPPCE-M及实施例1_(3)中得到的pPYR4的2株绿色木霉菌株的转化按照实施例1_(5)中记载的方法进行。S卩，使用7 μ g的pPPCE-M及3 μ g的 PPYR4转化2株绿色木霉菌株，在基本培养基上与软琼脂一起叠层，在28°C下培养5天。培养后，将长出的菌落再次移植至基本培养基，将在这里长出的菌落作为转化体。将得到的转化体用实施例1_(5)中记载的方法进行培养，将显著表达PPCE的菌株作为PPCE单独表达菌株。(8)表达蛋白质浓度的测定对SCE3单独表达菌株、PPCE单独表达菌株及SCE3-PPCE共表达菌株的重组内切葡聚糖酶表达量进行评价。使用BIO-RAD Protein Assay Kit (Bio Rad社制)，依据附带的方案测定各自的培养上清液的总蛋白质量。接着，将作为蛋白质量为Ilyg量的培养上清液用实施例1_(5)中记载的方法进行电泳。使用Molecular Imager FX( 才，” F 7
7卜一文社制)及Quantity One (才，” F 7 7卜一文社制)进行谱带分析，测定表达纤维素酶在总纤维素酶成分中所占的比率。在此，谱带分析的条件为Sensitivity 7. 513,Rolling Disk size 10。结果示于表1。由本结果可知，在SCE3-PPCE共表达菌株中， SCE3和PPCE为主要的两种内切葡聚糖酶，各自在总纤维素酶中所占的比例分别为40. 8% 及 20. 2%。另外，如表1所示，通过使SCE3及PPCE两者同时表达，与使它们各自单独表达的情况相比，可以得到具有高重组内切葡聚糖酶比率的培养上清液。[表1]2株绿色木霉菌株重组体中的蛋白质成分比率
权利要求
1.一种纤维素酶调制物，其包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶。
2.如权利要求1所述的纤维素酶调制物，其中，内切葡聚糖酶源自两种不同的丝状菌。
3.如权利要求1所述的纤维素酶调制物，其中，源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶均为重组蛋白质。
4.如权利要求1 3中任一项所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶分别以总纤维素酶的至少10重量％被含有。
5.如权利要求4所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶分别以总纤维素酶的至少20重量％被含有。
6.如权利要求1 3中任一项所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶被分类为不同的GH家族。
7.如权利要求6所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶被分类为GH 家族5、GH家族12及GH家族45中的任一者。
8.如权利要求7所述的纤维素酶调制物，其中，主要的两种内切葡聚糖酶为下述(a)或 (b)的任一组合(a)由被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶和被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶构成的组合；(b)由被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶和被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶构成的组合。
9.如权利要求8所述的纤维素酶调制物，其中，被分类为GH家族5的内切葡聚糖酶是包含序列号2所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质，被分类为GH家族12的内切葡聚糖酶是包含序列号 4所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质，被分类为GH家族45的内切葡聚糖酶是包含序列号6所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的蛋白质。
10.一种生产权利要求3所述的纤维素酶调制物的方法，其包括培养转化体的工序，所述转化体是将编码两种内切葡聚糖酶的DNA导入到同一宿主细胞而得到的。
11.如权利要求10所述的方法，其中，宿主细胞为丝状菌。
12.一种改良后的含纤维素的纤维的制造方法，其包括使含纤维素的纤维与权利要求 1 3中任一项所述的纤维素酶调制物接触的工序。
13.—种由生物质制造糖的方法，其包括使含纤维素生物质与权利要求1 3中任一项所述的纤维素酶调制物接触的工序。
全文摘要
本发明提供一种纤维素酶调制物，在所述纤维素酶调制物中，通过含有一定量以上的源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶，从而实现与单独含有各种微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物相比更高的活性和更广泛的pH值特性。另外，通过将两种不同的纤维素酶基因导入到同一宿主细胞中使其同时表达，可以简便地生产具有高活性和广泛的pH值特性的纤维素酶调制物。
文档编号C12P19/00GK102471764SQ201080029439
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月3日
发明者冈仓薰, 村岛弘一郎 申请人:明治制果药业株式会社