专利名称：用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法
技术领域：
本发明涉及用于溶解不溶蛋白质和/或肽的方法。本发明也涉及将不溶性蛋白质和/或肽导入细胞中的方法。本发明进一步涉及呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法、由该产生方法产生的抗原呈递细胞、使用抗原呈递细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法和诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂，以及使用该抗原呈递细胞预防或治疗癌症和/或传染病的方法和试剂。
背景技术：
近年，作为用于难治疗性疾病包括癌症的新治疗方法，免疫细胞疗法备受关注。免疫细胞疗法是通过离体(ex vivo)培养患者的免疫细胞，特别是白细胞，活化细胞，并然后将活化的细胞再返回患者他本人/她本人，来人工活化免疫力的治疗方法。由于免疫细胞疗法使用患者他本人/她本人的细胞，因此相对于使用抗癌症药物的常规治疗，其特别的优势在于尤其降低了副作用。作为免疫细胞疗法，目前流行的是活化的自身淋巴细胞疗法，其中通过淋巴因子以抗原非特异性方式离体(ex vivo)活化淋巴细胞，并将活化的淋巴细胞返回身体。此外， 期望普及是使用具有强细胞毒活性并特异识别和损伤病变的细胞毒性T淋巴细胞(在下文中，也称为“CTL”)的治疗方法。对于目前尝试的用于诱导CTL的治疗方法，已经应用将癌症抗原肽等直接施用给患者的方法。该方法的问题是，肽被组织中的肽酶降解、患者的免疫应答的抑制等，并因此， CTL诱导的能力没有期望的那么多。另一方法是树突状细胞疫苗疗法等(例如，非专利文献1)，其中抗原呈递细胞例如树突状细胞(在下文中，也称为“DC”)自来源于患者的细胞离体诱导，并用抗原脉冲，以强烈地呈递抗原，然后将DC返回患者体内。具体地，树突状细胞疫苗疗法是这样的疗法，其中将DC摄入疾病抗原蛋白质等 (例如，癌症抗原蛋白质或者与传染病有关的抗原蛋白质)到细胞中，在细胞中加工，并然后将其一部分呈递给主要组织相容性复合物抗原(MHC抗原，主要组织相容性抗原、组织相容性抗原，在人类的情况下，称为人白细胞抗原HLA)，将DC作为疫苗施用以诱导在体内选择性攻击表达疾病抗原的异常细胞的疾病抗原特异性CTL(见例如非专利文献1)。以该方式，由于DC疫苗可以诱导疾病特异性CTL，在免疫细胞疗法中，其是治疗效果最好的疗法之
οMHC抗原分类为MHC I类和II类，I类诱导抗原特异性CTL，和II类诱导辅助性 T (Th)细胞。此外，在人类的情况下，将I类进一步分类成亚型例如HLA-A02和HLA-AM，并且甚至当抗原蛋白质是相同的时候，它们也呈递不同的肽。在DC疫苗疗法中，重要的事情是将抗原等呈递给DC。作为呈递方法，目前使用两种方法。第一种是将来源于抗原蛋白质的抗原肽与DC表面的MHC抗原(HLA)直接结合的方法，第二种是通过内吞作用等将蛋白质摄入到DC中的方法。其中，当使用来源于抗原蛋白质的MHC I类限制性抗原肽直接结合抗原呈递细胞的MHC I类抗原时，培养并充分成熟抗原呈递细胞，并然后将溶解于生理溶剂的肽加入到培养溶液中，以使浓度为约ι μ g/mL,并将溶液温育2至M小时，并然后允许与MHC I类分子
纟口口。然而，在将来源于抗原蛋白质的抗原肽直与抗原呈递细胞的MHC抗原直接结合的方法中，CTL可以通过由I类呈递的抗原诱导。在例如人类的情况下，已经鉴定了特异性 HLA，例如结合抗原肽的I类核心，例如A02和A24，但是还没有鉴定其他HLA类型。S卩，由于该肽限制于特异性HLA，所以其仅可以用于具有特定HLA相容性的患者。此外，在该情况下，由于也不可以使用II类，所以CD4阳性(辅助)T细胞功能也不可用。在另一方面，在通过内吞作用摄入抗原蛋白质的方法中，将肿瘤组织在生理缓冲溶液例如磷酸缓冲盐(在下文中，称为“PBS”)中制备成勻浆(破碎处理)，并且仅将裂解液中的蛋白质或肽(上清液)加入到DC的培养溶液中。在这种情况下，摄入的蛋白质在溶酶体中加工，装载在主要由II类组织相容性抗原(II类)呈递的通路上，并主要刺激⑶4阳性(辅助性)T细胞，以诱导其活化。此外，作为用于掺入胞外物质的系统，存在用于加工废物的机制，其掺入与受体结合的物质，例如，已知甘露糖受体将与受体结合的糖蛋白质等掺入到细胞中。这也涉及通过溶酶体的由II类呈递的通路。相反，胞质中的蛋白质用蛋白酶体加工，并装载在主要由I类组织相容性抗原(I类)呈递的通路上，并且主要刺激⑶8阳性(杀伤性)T细胞(CTL)，以诱导其活性。当将肿瘤组织在生理缓冲溶液中制备成勻浆时，将作为上清液的可溶性级分加入到DC中，但将作为沉淀的不溶性级分去除。因此，不能使用包含在不溶性级分中的抗原蛋白质。即使将蛋白质生产为重组蛋白质，由于其回收在不可溶部分中，因此不能通过DC呈递抗原。此外，当允许树突状细胞通过内吞掺入抗原时，实际上是将抗原运输到指向II类的抗原呈递通路，并因此不能充分地将抗原呈递给⑶8阳性(杀伤性)T细胞和来自I类的 CTL0为了解决该困难，最近，已经应用电穿孔等用于将蛋白质导入到细胞中的方法。然而， 为了导入不溶性蛋白质，需要将蛋白质溶解在生理溶剂中。为了溶解不溶性蛋白质，通常，在溶剂如具有变性作用的尿素或盐酸胍中一次性溶解蛋白质的技术，并且当蛋白质不容易溶解时，会使用添加的还原剂如二硫苏糖醇 (DTT)。因此，为了抑制随机分子间二硫键，加入谷胱甘肽。根据情况，为了抑制分子间聚集，也加入精氨酸并然后引起氧化还原反应(转变成谷胱甘肽)。氧化还原反应后，用PBS 缓冲溶液等(根据情况，加入约10%甘油到PBS中)进行透析等，从而用生理溶剂替换该溶剂以实现溶解和纯化(非专利文献幻。然而，在此类方法的情况下，许多蛋白质不能溶解， 并且即使是能溶解的蛋白质，当用生理溶解透析时，几乎全部蛋白质都可能沉淀。因此，不能获得足够的效果。如上所述，为了提供足够的抗肿瘤效果，需要将靶抗原蛋白质以溶解的状态掺入树突状细胞中并呈递给MHC I类，并因此，认为用于将不溶性蛋白质溶解在生理溶剂中的技术是必需的。现有技术文献非专利文献
非专利文献1 Jonathan Μ. Weiss 等人，J. Immunother, VOL. 28 :542-550(2005)。非专利文献2 :Method in Enzymology 1999 ；309, 217-236发明_既述技术问题本发明已经考虑了上述情况，并提供了在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质和/或肽 (在下文中，也称为“不溶性蛋白质”的方法，所述不溶性蛋白质和/或肽在常规方法中不能充分溶解。此外，本发明也提供了将不溶性蛋白质有效转导入细胞中的方法。此外，本发明提供了呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法、由该产生方法产生的抗原呈递细胞、 使用抗原呈递细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法和诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂，以及使用该抗原呈递细胞预防和治疗癌症和/或传染病的方法或试剂。解决问题的手段本发明人实施了多种研究，以解决以上所提及的问题，并且当通过使用生理溶剂替换通过使用变性剂溶解了蛋白质的溶液时，已经发现，通过添加核苷酸可以有效地实现加溶溶解。此外，已经显示，通过电穿孔可以将通过本发明的溶解方法溶解的蛋白质导入细胞中。因此，本发明人已经发现，当将癌症、传染病等的疾病抗原蛋白质溶解并转导到抗原呈递细胞中时，可以诱导对疾病抗原特异的CTL。因此，本发明人完成了本发明。SP，本发明提供了以下(1)至02)。(1)用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，该方法包括在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合，并溶解不溶性蛋白质和/ 或肽，从而形成不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤；将核苷酸加入溶液的步骤；和从溶液中去除变性剂的步骤。(2)根据⑴所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。(3)根据(1)或(2)所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种，和加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。(4)根据⑴至(3)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。(5)根据⑴至(4)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。(6)根据⑴至(5)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在从溶液中除去变性剂的步骤中，在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂，并优选地，该生理溶剂包含核苷酸。(7)根据⑴至(6)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。(8)根据⑴至(7)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质。
(9)根据⑴至⑶中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。(10)根据⑴至(9)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。(11)根据⑴至(10)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。(12)用于将不溶性蛋白质和/或肽转导到细胞中的方法，该方法包括在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合，并溶解不溶性蛋白质和/ 或肽，从而形成不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤；将核苷酸加入溶液的步骤；和在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂，从而形成不溶性蛋白质和/或肽的生理溶液的步骤；和将生理溶液转导入目的细胞的细胞质或细胞内。(13)根据(12)所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。(14)根据(12)或(13)项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种；并加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。(15)根据(12)至(14)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。(16)根据(12)至(15)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中在将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。(17)根据(12)至(16)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中用于替换蛋白质和/或肽的溶液的生理溶剂包含核苷酸。(18)根据(12)至(17)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述细胞是具有抗原呈递功能的细胞。(19)根据(12)至(18)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述具有抗原呈递功能的细胞是树突状细胞。(20)根据(12)至(19)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。(21)根据(12)至00)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质或肽。(22)根据(12)至中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。(23)根据(12)至02)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。(24)根据(12)至03)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。(25)根据(12)至04)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中通过电穿孔将所述溶解的不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞质和/或细胞内。(26)用于产生呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的方法，该方法包括在一种溶液中将不溶性抗原与变性剂混合，并溶解不溶性抗原，从而形成含不溶性抗原的溶液的步骤；将核苷酸加入溶液的步骤；在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂，从而形成含不溶性抗原的生理溶液的步骤；和将含不溶性抗原的生理溶液转导入抗原呈递细胞的细胞质或细胞内。(27)根据06)所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。(28)根据06)或(27)所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种；并加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。(29)根据06)至(28)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。(30)根据06)至(29)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中用于替换抗原的溶液的生理溶剂包含核苷酸。(31)根据06)至(30)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是获自肿瘤细胞、肿瘤组织、传染病细胞或病原性细胞的破碎物的不溶性级分。(32)根据06)至(31)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是蛋白质或肽。(33)根据06)至(32)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。(34)根据06)至(33)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。(35)根据06)至(34)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。(36)根据06)至(35)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。(37)根据06)至(36)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。(38)通过根据06)至(37)中任一项所述的产生方法产生的抗原呈递细胞。(39)用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法，该方法包括将通过根据据06)至 (37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。(40)用于治疗或预防癌症和/或传染病的方法，该方法包括将通过根据06)至 (37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。
(41)用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的组合物，该组合物包含，作为活性成分的通过根据06)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。(42)用于治疗或预防癌症和/或传染病的组合物，该组合物包含，作为活性成分的通过根据06)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。发明的有利效果使用本发明的加溶方法，可以溶解不溶性蛋白质例如天然存在的蛋白质和重组的蛋白质。此外，当使用经溶解的蛋白质时，通过电穿孔可以将它们直接转导入胞质。使用本发明的具体方法包括，用于呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法，产生免疫应答药物和制备试剂和药物的应用，以及提供含溶解的蛋白质抗原的例如蛋白质疫苗、肽疫苗或树突状细胞疫苗。附图简述
图1显示在添加精氨酸、核苷酸和它们二者的情况下溶解TRP-2融合蛋白，以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2融合蛋白的结果。图2显示通过分别添加4种类型核苷酸或它们的组合溶解TRP-2，以及通过 SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。图3显示通过添加核糖核苷酸(GTP)或脱氧核糖核苷酸(dGTP)溶解TRP-2，以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。图4显示通过加入GMP或GTP溶解TRP-2，以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。图5显示通过加入UMP或UTP溶解TRP-2，以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。图6显示通过加入UMP溶解TRP-2、使用具有不同pH的溶液透析，以及通过 SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。图7a显示当通过蛋白质印迹分析人黑素瘤细胞系勻浆物的可溶性级分( 和不溶性级分(P)时，在没有转移的情况下，在凝胶中残留的蛋白质的CBB染色结果。图7b显示使用抗MART-I抗体的蛋白质印迹结果。图8显示当通过本发明的溶解方法溶解Mewo不溶性级分，并使用抗MART-I抗体的蛋白质印迹的结果。图9显示当使用UMP溶解小鼠黑素瘤(B16)勻浆物的沉淀级分，并通过SDS-PAGE 检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。图10显示当使用UMP溶解人乳腺癌(MDA-MB-231)勻浆物的沉淀级分，并通过 SDS-PAGE检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。图11显示当使用UMP溶解人前列腺癌(DU145)勻浆物的沉淀级分，并通过 SDS-PAGE检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。图12显示在用⑶lib/⑶Ilc和⑶80/⑶86抗体诱导树突状细胞后，表型的分析。图13显示通过四聚体分析证实TRP-2特异的CTL诱导效应。图1 是证实B16的H-2Kb*H_2Db表达的图。图14b是显示当通过电穿孔将 B16的裂解物(可溶性级分sup)或者溶解的不溶性级分(ppt)导入DC中时，通过使用 Terascan VP系统测定细胞毒活性，证实在用DC免疫的小鼠的体内诱导了特异识别B16的癌抗原的CTL的图。实施方案的描述在下文中，描述了实施本发明的实施方案。然而，无需说明的是，本发明并不受限于这些实施方案，并且在不超出概述的范围的情况下，可以将本发明实施于多个实施方案。用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法首先，描述了根据本发明的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法(在下文中，也称为“本发明的用于溶解的方法”)。在说明书中使用的“不溶性”指蛋白质的性质，以及蛋白质在液体中，特别地在水或生理溶剂中不能溶解或较少溶解，以致在室温不能形成均质的混合溶液的性质。在蛋白质存在于水、水和盐，以及水和不会变性蛋白质的生理溶剂中的情况下，在15100Xg离心 (进行离心)该蛋白质的溶液1小时后，当该蛋白质基本上不存在于上清液中，或者该蛋白质的至少50%、期望地75%或更多、和更期望地100%在上清液中不存在时，将在本发明书中所描述的天然不溶性蛋白质的性质称为不溶性。本文中所述的“蛋白质”包括肽、多肽等，并且其并不限于在自然界中存在的天然存在蛋白质，但其包括来源于通过基因转移等转化的细胞的重组蛋白质、通过使用无细胞蛋白质表达系统体外表达的蛋白质和以无机合成化学方式产生的合成蛋白质。此外，可以包括这样的蛋白质，其中构成蛋白质的氨基酸的一部分或者全部由乙酰化、磷酸化、甲基化等的功能基团提供，或者用糖链、蛋白质、脂类等修饰。值得注意的是，在本说明书、权利要求和摘要中，为了明确本发明也包括不溶性肽，在一些情况下，可以将蛋白质和肽二者描述为“不溶性蛋白质和/或肽”。本文中所用的“不溶性蛋白质”指当在室温搅拌时，在水或生理溶剂中不溶解或者较少溶解的蛋白质，和使用变性剂是溶解的但当用生理溶剂替换该溶剂时产生沉淀的蛋白质。此外，即使本来的天然形式是可溶性蛋白质，但如果通过使用异种生物表达为重组蛋白质(例如，在基因重组技术中，构建表达系统大肠杆菌的情况下)，将回收为包涵体(包含体)的靶蛋白质也称为不溶性蛋白质。在肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中含有的不溶性蛋白质的实例包括具有跨膜结构的膜蛋白。由于膜蛋白包括亲水部分和疏水部分，所以通常已知，其被回收在不溶性级分中。膜蛋白包括已知为癌抗原的分子，非常重要的是，将这些蛋白质溶解并用于免疫细胞疗法。在肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中含有的不溶性蛋白质的实例包括MART-1、PSMA和 TRP-2。此外，也考虑，当本来可溶的抗原蛋白质突变时，改变了氨基酸的组成，并且该蛋白质不再具有正常的结构，并从而变成不溶的。在蛋白质如阮病毒(J. Mol. Neurosci. 2007 ； 32 90-96)、超氧化物歧化酶(J. Biol. Chem. 2008 ；283 :866-874)和 α A-晶体蛋白 (Biochemistry 2008 ；47 :9697-9706)中已经观察到了上述现象。在该说明书中，术语“加溶”指在维持其氨基酸序列的情况下，在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质。其指当将使用变性剂溶解不溶性蛋白质的溶液用生理溶剂替换，并离心时， 在离心后，增加在上清液中回收的不溶性蛋白质的量。在本发明的加溶方法中使用的核苷酸是结合了碱基、糖和磷酸的化合物。糖部分为D-2-脱氧核糖的核苷酸称为脱氧核糖核苷酸，其是构成DNA的一部分。此外，糖部分为核糖的核苷酸称为核糖核苷酸，其是构成RNA的一部分。对于磷酸部分，结合的是1个至3个磷酸。对于碱基部分，结合的是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在本发明的加溶方法中，可以使用任一脱氧核糖核酸和核糖核酸。此外，与核苷酸结合的磷酸的数目可以是1至3个中的任意一种。作为构成核苷酸的碱基，可以使用与核苷酸结合的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任一碱基。然而，由于取决于构成的碱基和溶解的蛋白质，加溶的效率不同，期望的是使用任意一种或多种碱基的组合。实例包括腺苷一磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)、腺苷二磷酸(ADP)、尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(⑶P)、胞苷二磷酸(⑶P)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、脱氧腺苷一磷酸 (dAMP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP ；dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物)。在本发明的加溶方法中使用的变性剂一般是尿素、盐酸胍、表面活性剂等，并指具有切割形成不溶性三维结构的离子键、氢键、疏水相互作用等的性质的试剂。以将变性剂溶解于水溶液的状态下使用此类变性剂。例如，优选其PH可以调整的缓冲溶液如磷酸钠水溶液。在本发明的加溶方法中使用的还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、2_巯基乙醇QME)等， 并指具有切割形成不溶性三维结构的二硫键的性质的试剂。可以以将它们事先与还原剂混合或者溶解于不同溶剂的状态下使用此类还原剂。在本发明的加溶方法中，从含有变性剂的蛋白质溶液中去除变性剂的方法的实例包括，通过透析或者凝胶过滤替换该溶剂的方法。特别地，出于易于操作考虑，优选的是透析。用于替换的溶剂可以是不含变性剂的任一溶剂，并例如，可以使用水和生理溶剂。特别地，当将蛋白质溶剂加入细胞的培养溶液时，或者当将蛋白质溶剂施用给活体时，优选地， 将该溶液用生理溶剂替换。例如，作为生理溶剂，优选的是PBS(磷酸缓冲盐水)、生理盐水等。此外，当将核苷酸加入生理溶剂时，可以更有效地溶解不溶性蛋白质。加入到生理溶剂的核苷酸的浓度优选地为约 ο μ Μ。基于蛋白质的来源，本发明的加溶方法的实施方案不同。例如，a)获自肿瘤组织和细胞的蛋白质，作为天然存在的蛋白质，如下溶解。a-Ι)细分组织，然后通过反复冻融破坏细胞，或者通过超声波等破碎细胞，并通过离心分级成上清液(可溶性级分)和沉淀(不溶性级分)。a-2)将回收的沉淀使用变性剂，例如4至8M尿素溶解。当沉淀不易溶解时，可以加入还原剂，例如DTT、2ME等。a-3)当加入还原剂时，优选地加入氧化的谷胱甘肽等。a-4)在用变性剂溶解不溶性蛋白质的状态下，加入核苷酸。优选地，以使得终浓度为0. 5mM至IOmM的量加入核苷酸。a-5)通过用含约10 μ M核苷酸的生理溶剂透析，去除变性剂等。例如，b)通过使用真核细胞、菌体等表达的不溶性重组蛋白质，如下溶解。b-Ι)通过例如，超声波破碎细胞或菌，和离心以分离不溶性级分并回收不溶性蛋白质。
b-2)用变性剂例如，4至8M尿素溶解回收的不溶性蛋白质。当沉淀不易溶解时， 加入还原剂例如，DTT、2ME等。b-3)实施层析系统进行纯化以获得靶蛋白质。可以使用任一层析系统，只要不影响溶剂、可以提取靶蛋白质即可，例如，优选的是使用蛋白质特异性抗体的亲和层析，或者当蛋白质包含组氨酸标签等时，优选的是镍亲和层析等。b-4)此外，当实施纯化时，可以根据所使用的靶蛋白的性质或溶剂，通过使用纯化方法纯化蛋白质，例如，分子排阻层析、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、离子交换层析等(所述层析可以与高效液相层析组合)。b-5)在纯化前、纯化期间或纯化后，将还原剂加入到蛋白质溶液中。在纯化后加入还原剂的情况下，在添加还原剂后，将溶液室温维持约1小时以发生还原反应。作为还原齐U，例如，优选的是DTT。b-6)通过使用不含还原剂的变性剂透析，去除过量的还原剂。b-7)优选地，加入氧化的谷胱甘肽(根据需要，还原的谷胱甘肽)等。b-8)加入核苷酸并室温维持1小时。优选地，以使得终浓度为0. 5mM至IOmM的量加入核苷酸。b-9)通过使用含有约10 μ M核苷酸的生理溶剂透析，去除变性剂。例如，c)不溶性的合成蛋白质如下溶解。C-1)从含氨基酸和随机结合肽片段的合成蛋白质溶液中通过例如高效液相层析回收靶不溶性蛋白质。c-2)用变性剂例如，4至8Μ尿素溶解回收的不溶性蛋白质。当不溶性蛋白质不易溶解时，可以加入还原剂，例如DTT、2ME等。c-3)当加入还原剂时，优选地加入氧化的谷胱甘肽等。c-4)在不溶性蛋白质用变性剂溶解的状态下，加入核苷酸。优选地，以使得终浓度为0. 5mM至IOmM的量加入核苷酸。c-5)通过使用含有约10 μ M核苷酸的生理溶剂透析，去除变性剂等。以这种方式在生理溶剂中溶解的蛋白质和/或肽不同于不溶性状态，并可以使用滤器进行灭菌，其可以作为疫苗施用给患者。关于用于将不溶性蛋白质转导入细胞的方法接下来，描述了根据本发明的用于将不溶性蛋白质转导入细胞的方法。通过例如， 电穿孔，将已经通过上述本发明加溶方法溶解的不溶性蛋白质转导入细胞的胞质和/或细胞内，产生抗原呈递细胞。根据上述本发明加溶方法，在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质。当在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质时，不易发生在导入蛋白质期间或之后由于溶剂的毒性杀死细胞的问题。在本发明的用于导入细胞的方法中，作为用于导入溶解于生理溶剂的不溶性蛋白质的方法，可以使用通常使用的多种方法。例如，可以应用电穿孔。在本发明的导入方法中，当通过电穿孔将溶解的不溶性蛋白质导入抗原呈递细胞 (例如，树突状细胞)时，导入的蛋白质和/或肽呈递给MHC I类，并可以诱导CTL。此外， 通过交叉呈递(cross presentation)，将肽的一部分呈递给MHC II类，并且其活化Th细胞。通过将抗原呈递给MHCII类活化Thl细胞，其产生对于细胞免疫所必需的细胞因子，并促进CTL的诱导。电穿孔是应用物理原理的导入方法，其中当将细胞暴露于电脉冲时，原核/真核细胞的膜短暂的破裂。例如，当在将抗原蛋白质等加入到细胞培养溶液中的状态下给予电脉冲时，从扩大的细胞膜的孔可以将溶解的蛋白质直接导入胞质中。将培养细胞的培养溶液用无血清培养基、PBS等替换，并制备成约1 X IO6个细胞/ mL。将蛋白质溶液加入到细胞悬浮液中，将细胞悬浮液放入小电极杯中，并将电极与电穿孔仪器主体连接。快速实施电脉冲，并回收于5倍体积或更多体积的培养基中。然后，培养至少1小时，并用于期望的应用。当在可药用溶剂(例如，生理盐水)中悬浮其中已经导入了溶解的蛋白质和/或肽的树突状细胞时，其可以作为树突状细胞疫苗施用给患者。接下来，描述了根据本发明的抗原呈递细胞的产生方法。在本发明的抗原呈递细胞的产生方法中，对所使用的生理溶剂不溶的抗原的实例包括，获自肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物的不溶性级分、获自感染了病毒的传染病细胞的破碎物的不溶性级分、获自病原性细菌的破碎物的不溶性级分、人工合成的不溶性蛋白质或肽等。特别地，获自肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物的不溶性级分、获自感染了病毒的传染病细胞的破碎物的不溶性级分、获自病原性细菌的破碎物的不溶性级分含有在肿瘤组织或肿瘤细胞中、在传染病细胞和病原性细菌中特异表达的不溶性蛋白质抗原。与仅用上清液诱导CTL的常规方法比较，当溶解此类不溶性级分并允许呈递抗原时，期望诱导了更高的抗肿瘤活性、抗(病毒)传染病活性、抗病原性细菌活性。在一种溶液中混合不溶性抗原和变性剂(例如，4至8M尿素)，以产生含不溶性抗原的溶液。根据需要，将DTT或2ME作为还原剂加入。然后，在含不溶性抗原的溶液中加入核苷酸。将含不溶性抗原的溶液替换为生理溶剂，从而去除变性剂。因此，可以获得含不溶性抗原的生理溶液。将含不溶性抗原的生理溶液转导入抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)中。对于转导方法，优选的是将不溶性抗原直接转导入胞质的方法，并例如，可以应用电穿孔。由于在如此产生的抗原呈递细胞中，转导的抗原在细胞中降解并呈递给MHC I类， 可以诱导对抗原特异的CTL。特别地，当转导了蛋白质时，由于呈递了序列中含有的多个表位，因此可以活化多种类型的对抗原特异的CTL。此外，由于也呈递了 MHC II类的表位，所以也活化了 Thl细胞，并可以进一步促进CTL的活化。因此，可以将如此产生的抗原呈递细胞用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法、诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂、用于预防或治疗癌症和/或传染病的方法和用于预防或治疗癌症和/或传染病的试剂。更特别地，例如，获取从收集自癌症患者的肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中获得的不溶性级分，或者从与来自患病毒传染病的患者相同的病毒的破碎物中获得的不溶性级分或者从与来自患病原性细菌传染病患者相同的病原性细菌的破碎物中获得的不溶性级分，并且将此类不溶性级分用于本发明的加溶方法并溶解，并将溶解的级分加入到抗原呈递细胞例如收集自相同患者的淋巴细胞或树突状细胞，并培养以诱导抗原呈递细胞，并且将诱导的抗原呈递细胞施用给相同的患者。由此，可以诱导对肿瘤细胞、病毒或病原性细菌特异的细胞毒性T淋巴细胞，从而可以预防或治疗疾病如癌症或病毒传染病。此外，将借助本发明加溶方法溶解重组蛋白质或者合成蛋白质获得的溶解蛋白质加入到抗原呈递细胞例如收集自患者的淋巴细胞或树突状细胞中，并培养以诱导抗原呈递细胞，并且将诱导的抗原呈递细胞施用给相同的患者。通过常规方法可以将诱导的抗原呈递细胞施用给患者，例如，可以保持原状施用给患者，或者可以以常规形式如注射施用给患者，并且可以作为常规疫苗制剂施用。此外，待施用的抗原呈递细胞的量可以根据患者疾病的症状或类型；以及在用于预防时，根据所预防的疾病和受试者的类型来任意地确定。此夕卜，通过使用产生的抗原呈递细胞，将收集自患者的淋巴细胞和抗原呈递细胞混合，并培养以体外诱导CTL。实施例1核苷酸有效性的研究将重组小鼠酪氨酸酶相关的蛋白质2 (在下文中，也称为“TRP-2”)用作为不溶性蛋白质，并研究了使用核苷酸的加溶方法。首先，制备包含在N末端添加了组氨酸标签(His-tag)的由遍在蛋白片段(在下文中，称为“^ ”)和TRP-2组成的重组融合蛋白(在下文中，称为“UT”)。W^i分离自编码 SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列的cDNA，并且TRP-2分离自编码基于在SWISS-PR0T数据库的AC No. P29812中所述的氨基酸序列的N末端第56个残基谷氨酸(E)到N末端第472 个残基的丝氨酸(S)的cDNA。将Ubi和TRP-2插入到pET19b载体(Novagen公司)中，以形成表达质粒(pET19b/UT)。当用 pET19b/UT 转化大肠杆菌(Rosetta_gami2 (DE3) pLysS Novagen, #71352-3)以表达重组蛋白质时，产生了具有序列NH2-His-Ubi-TRP-2_C02H(SEQ ID NO 2)的融合蛋白(UT蛋白质)，但其形成了包涵体(包含体)且是不溶的。在含蛋白酶抑制剂(CompleteEDTA-free, Roche, #04 693 132 001)的 PBS 中悬浮已经表达了 UT蛋白质的大肠杆菌，通过使用超声波装置破坏，通过使用M-XlOO离心机， TMP-Il转子(TOMY)在4°C在15100Xg进行离心1小时。将离心后不溶的级分(沉淀)悬浮于4M尿素/PBS (pH7. 4)，将悬浮液室温搅拌1 小时，并在4°C在15100Xg离心1小时。将离心后不溶的级分(沉淀)1)溶解于8M尿素/150mM NaCl/5mM DTT/20mM磷酸钠(pH8. 5)中，并将该溶液进行2)使用 AKTA Explorer 液相层析系统(Amersham Pharmasia Biotech)的镍亲和 (His Trap HP 柱，Amersham Pharmasia Biotech，#17-5247—01)，禾口3)用 6M 尿素 /150mM NaCl/5mM DTT/20mM 磷酸钠(pH8. 5)凝胶过滤层析 (Superosel2 HR 柱，Amersham Pharmasia Biotech，#17-0538-01)，以部分地纯化重组蛋白质。将DTT加入到已经经历了凝胶过滤纯化的样品中，以使浓度为5mM，并使混合物反应1小时，然后用6M尿素/150mM NaCl/20mM磷酸钠(pH8. 5)实施透析以去除未反应的DTT。使用上述方法，获得了蛋白质样品。然而，在上述方法中获得的蛋白质样品处于含有变性剂的状态。因此，对于转导入细胞，不能将该样品原样使用，并因此，必需将该溶剂用生理溶剂更换。然后，通过下述4至10的步骤，尝试将蛋白质溶解于生理溶剂(在下文中， 在生理溶剂中溶解蛋白质称为“加溶”)。添加精氨酸的方法是熟知的技术，并将其作为对照。4)将谷胱甘肽(GSSG)加入到3)中获得的蛋白质样品中，以实施氧化-还原反应。5)加入添加剂(精氨酸或dNTP)并使混合物在室温反应1小时。6)加入甘油(10%)。7)用生理溶剂(例如，PBS)实施透析。8)回收样品并在4°C在15100Xg离心1小时。9)将样品分离成上清液(可溶性级分)和沉淀(不溶性级分)，并回收它们。10)通过例如SDS-PAGE分析加溶有效性。详细地说明4至10的步骤。将2mM DTT加入到溶解于6M尿素/150mM NaCl/20mM 磷酸钠(PH8.5)的UT样品中，并将该溶液在室温维持1小时，然后用6M尿素/150mM NaCV20mM磷酸钠(pH8. 5)实施透析，以去除过量DTT。将样品分配成3个样品管(1)、O) 和(3)，并将2. 5mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)加入到每一管中(每一浓度为终浓度)。此外， 将精氨酸(L(+)精氨酸，Wako，#015-04617)只加入到管(3)中，使得终浓度为125mM。将全部管都维持1小时。然后，将10%甘油(终浓度)加入到已经添加了精氨酸的管C3)和加入到管O)中。用10%甘油/150mMNaCl/20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷(pH8. 4)分别透析这三种类型的反应溶液，从而替换溶剂。由于该透析操作产生了不溶性蛋白质，将不溶性蛋白质在10°C在15100Xg离心1小时，并分级成上清液和沉淀(没有溶解的蛋白质回收在沉淀中，且已经溶解的蛋白质回收在上清液中)。将2XSDS-PAGE 样品缓冲溶液(tris_SDS_2ME 样品处理溶液Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，#423437)加入到上清液中。将沉淀级分溶解于与上清液的量相同的 1XSDS-PAGE样品缓冲溶液中，将等同量的每一部分都进行SDS-PAGE。电泳后，将溶液用考马斯亮蓝G250染色溶液染色，并估计在每一上清液和沉淀中回收的蛋白质的量。如图1和表1的(1)、(2)和(3)中所示，蛋白质没有回收在任一可溶性级分中。从以下公式计算表 1中显示的加溶率，其中通过使用Gel Doc 2000 (BIO RAD)的C⑶照相机，将用考马斯亮蓝染色的凝胶拍照为图像，并将每一条带“a”和“b”的面积乘以浓度，以表示为数值(ν)。条带“b”是“a”的降解产物。加溶率(%) = S(ν) X 100/S(ν) +P(ν)S (ν):上清液的条带“a”的面积X浓度+上清液的条带“b”的面积X浓度P (ν)沉淀的条带“a”的面积X浓度+沉淀的条带“b”的面积X浓度使用溶解于6M尿素/150mM NaCl/20mM磷酸钠(pH8. 5)的相同蛋白质，在加入 dNTP (illustra dNTP Set, IOOmM Solutions, GE Healthcare, 27-2035-01)而不是精氨酸， 以使终浓度为12. 5mM的情况下进行加溶，并研究在加入12. 5mM dNTP和125mM精氨酸的情况下的加溶。其他操作与(1)至⑶中的那些操作相同。对应的结果显示于图1和表1 的⑷和(5)中。在加入了 dNTP的情况下，在上清液中观察到了明显的条带，并且比率为 50.8%。也在加入了 dNTP和精氨酸(Arg)的情况下，在上清液中观察到了明显的条带，但比率为20. 7%。表1当加入精氨酸或dNTP时，UT融合蛋白的加溶率
⑴(2) (3) (4) (5)
力口溶率(%) I 0 0 I 0 50.8 20.7(1)未添加(4) (2) +dNTP(2) 10% 甘油(5) (2) +Arg+dNTP(3) (2) +Arg从上述结果中发现，常规方法不能溶解的蛋白质可以通过添加dNTP溶解。此外， 认为加入了 dNTP时，不再需要添加精氨酸。实施例2核苷酸种类(碱基)的研究作为不溶性蛋白质的模型，使用重组小鼠TRP-2(rTRP-2 ；SEQ IDNO 3)。rTRP_2 分离自编码基于在SWISS-PR0T数据库的AC NO.P29812中所述的氨基酸序列的N末端第56个残基谷氨酸(E)到N末端第472个残基的丝氨酸⑶的cDNA，并插入到pET19b 载体(Novagen)中，以形成表达质粒(pET19b/mdT)。当用pET19b/mdT转化大肠杆菌 (Rosetta-gami2 (DE3) pLysS =Novagen, #71352-3)并表达重组时，获得了在N末端具有组氨酸标签(His-标签)的重组蛋白质。重组蛋白质形成了包涵体，并且是不溶的。将该不溶性级分溶于8M尿素/PBS/5mMDTT (pH8. 5)或8M尿素/PBS/10mM DTT (pH8. 0)，并通过使用 AKTAexplorer 液相层析系统(Amersham Pharmasia Biotech)的银亲禾口 (His Trap HP 柱， Amersham Pharmasia Biotech, #17-5247-01)和凝胶过滤层析(HiPr印 26/60Sephacryl S300HR 柱，Amersham Pharmasia Biotech，#17-1196-01)部分地纯化该溶液。为了用生理缓冲溶液替换纯化样品的溶剂，实施用PBS的透析，但几乎沉淀了全部量。在5个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mM DTT (pH8. 5)的rTRP_2。将2. 5mM还原的谷胱甘肽(GSH)和2. 5mM GSSG加入到所有管中。将dATP (dA，Sigma，#D6500)、dTTP(dT， Sigma, #D5288)、dCTP (dC, Sigma, #D4635)、dGTP (dG, Sigma, #D4010)或 dNTP 加入到各个管中，使得终浓度为10mM，并将所有管都维持1小时。之后，将10%甘油加入到每一管中。将这些溶液用10%甘油/PBS(pH8.0)分别透析，并替换溶剂。然后，在10°C在15100Xg离心该溶液1小时并分级成上清液和沉淀，并且将沉淀级分溶解于8M尿素/PBS (pH8. 0)。在下文中，类似于实施例1，用SDS-PAGE实施分析。如在图2中所示，当使用任一碱基时，证实rTRP-2回收在可溶性级分中。其中，当加入dT和dG时，几乎全部量的蛋白质都能溶解。实施例3核苷酸的种类(核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的研究在6个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mM DTT (pH8. 5)的rTRP_2，并将2. 5mM GSH和2. 5mM GSSG加入到所有管中。将GTP (Sigma, #G8877)或dGTP加入到各个管中，使得浓度为2mM、10mM或50mM，并将所有管都维持1小时。之后，将10%的甘油加入到各个管中。用10%甘油/PBS(pH8.0)实施透析，并替换溶剂。之后，在10°C在15100Xg离心该溶液1小时，并分级成上清液和沉淀，并然后类似于实施例1，通过SDS-PAGE实施分析。
如在图3中所示，在2至IOmM GTP和2至IOmM dGTP时，上清中溶解并回收了约 50%。然而，当GTP和dGTP的浓度达到50mM时，几乎所有量都是不溶的，并回收在沉淀级分中。从上所述，认为合适的是加入IOmM或更少的核苷酸。因此，其显示，构成核糖核酸的核苷酸和构成脱氧核糖核酸的核苷酸具有相同的效果。实施例4核苷酸的种类(单磷酸盐和三磷酸盐)的研究(鸟嘌呤的实例)在6个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mM DTT (pH8. 5)的rTRP_2 (与实施例3 中一样)，并将 2. 5mM GSH 和 2. 5mM GSSG 加入到所有管中。将 IOmM GMP (Sigma, #G8377)、 2mM GMP、0. 5mMGMP、10mM GTP、2mM GTP或0. 5mM GTP加入到各个管中，并将所有管都维持1 小时。之后，将10%甘油加入到每一管中。用10%甘油/PBS(pH8.0)实施透析，并替换溶齐U。之后，在10°C在15100 Xg离心该溶液1小时，分级成上清液和沉淀，并因此类似于实施例1，用SDS-PAGE实施分析。如在图4中所示，在加入0. 5至IOmM GMP和0. 5至2mM GTP的情况下，几乎全部量的TRP-2都是可溶的并回收在上清液中。在加入IOmM GTP的情况下，其以部分不溶的状态回收，但50%或更多都以可溶状态回收。从上所述表明，尽管GMP和GTP具有添加浓度的不同合适范围，但GMP和GTP 二者都具有等同的效果。实施例5核苷酸的种类(单磷酸盐和三磷酸盐)的研究(尿嘧啶的实例)该实施例举例了尿嘧啶的作用，其是对应于dTTP的构成核糖核酸的碱基，所述 dTTP的加溶效率在实施例2中是高的。类似于鸟嘌呤的实例，除使用UMP(Sigma，#TO375) 而不是GMP和使用UTP (Sigma，冊6625)而不是GTP外，与实施例4中一样。如在图5中所示，在加入0. 5至IOmM UMP和0. 5至2mM UTP的情况下，几乎全部量的rTRP-2都是溶解的并回收在上清液中。在加入IOmM UTP的情况下，rTRP_2以部分不溶的状态回收，但50%或更多的rTRP-2都以可溶状态回收。从上所述表明，尽管UMP和UTP 具有添加浓度的不同合适范围，但UMP和UTP 二者都具有等同的加溶作用。从实施例2中的研究和本实施例的研究中显示，可以使用核苷酸的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸二者， 其中磷酸的数目是不同的。实施例6pH的研究与实施例5相同，将rTRP-2溶解于已经加入了 IOmM UMP的6M尿素/PBS/5mM DTT (pH8. 5)，并制备没有加入IOmM UMP的rTRP_2，并且将它们反应1小时。然后，将已经加入了 UMP的rTRP-2分成两部分，并用10 μ M UMP/10%甘油/PBS (pH7. 4)或(pH8. 0)透析。 用10%甘油/PBS (pH7. 4)透析没有加入UMP的rTRP-2。在10°C在15100X g离心回收的样品1小时，并分级成上清液和沉淀。将沉淀级分溶解于8M尿素-PBS。在下文中，与实施例 1类似，实施通过SDS-PAGE的分析。结果如在图6中所示，其显示，在pH7. 4实施透析的情况下，当没有加入UMP时，在可溶性级分中没有检测到蛋白质，并且几乎所有蛋白质都是不溶的和沉淀的，但当加入了 UMP时，蛋白质也回收在可溶性级分中。此外，其显示，当pH达到8. 0时，加溶效率是增加的。
实施例7来源于细胞的天然不溶性蛋白质的定量将每一种人黑素瘤细胞系Malme_3M、Mewo和G-361培养在75cm2培养瓶中。当细胞覆盖了底部表面时，用PBS洗涤培养细胞三次。洗涤后，刮取细胞，并且在4°C在IOOOXg 离心5分钟并回收为沉淀。测量其湿重。对于每一湿重，再次将细胞悬浮于PBS中，使得细胞为400 μ L/IOOmgo之后，实施冷冻(_80°C )和融化(30°C )6次，并在4°C在15100Xg离心1小时(在下文中，将该离心操作简称为“离心”)，分级成上清液(可溶性级分S)和沉淀(不溶性级分P)。通过 BCA方法测量上清液中蛋白质的量，并将沉淀中的蛋白质溶解于与上清液相同体积的8M尿素-PBS后，通过Bradford方法测量沉淀中蛋白质的量。结果显示于表2中。在Malme_3M和G-361中，在沉淀中回收了 50%或更多的蛋白质，在Mewo中，在沉淀中回收了 47%的蛋白质。因此证实，用于制备裂解物脉冲 (Iysate-PUlse)DC的树突状细胞(DC)的常规处理方法中使用的可溶性蛋白质，占细胞中含有的蛋白质总量的约50%。表2冷冻和融化黑素瘤细胞系后，在上清液(sup)或沉淀(ppt)中含有的蛋白质的量
权利要求
1.用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，所述方法包括在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合，并溶解所述不溶性蛋白质和/ 或肽，从而形成所述不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤；将核苷酸加入所述溶液的步骤；和从所述溶液中去除变性剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中构成所述核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种，和加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中构成所述核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在将所述不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在从所述溶液中除去所述变性剂的步骤中，在用生理溶剂替换所述溶液时去除所述变性齐 ，并优选地，所述生理溶剂包含核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中在一种溶液中将所述不溶性蛋白质和/或肽与所述变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
12.用于将不溶性蛋白质和/或肽转导到细胞中的方法，所述方法包括在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合，并溶解所述不溶性蛋白质和/ 或肽，从而形成所述不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤；将核苷酸加入所述溶液的步骤；和在用生理溶剂替换所述溶液时去除所述变性剂，从而形成所述不溶性蛋白质和/或肽的生理溶液的步骤；和将所述生理溶液转导入目的细胞的细胞质或细胞内。
13.根据权利要求12所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
14.根据权利要求12或13所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中构成所述核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种；和加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中构成所述核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中在将所述不溶性蛋白质和/或肽与所述变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中用于替换所述蛋白质和/或肽的溶液的所述生理溶剂包含核苷酸。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述细胞是具有抗原呈递功能的细胞。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述具有抗原呈递功能的细胞是树突状细胞。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质或肽。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
23.根据权利要求12至22中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中在一种溶液中将所述不溶性蛋白质和/或肽与所述变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。
24.据权利要求12至23中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
25.根据权利要求12至M中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法，其中通过电穿孔将所述溶解的不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞质和/或细胞内。
26.用于产生呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在一种溶液中将所述不溶性抗原与变性剂混合，并溶解所述不溶性抗原，从而形成含所述不溶性抗原的溶液的步骤；将核苷酸加入所述溶液的步骤；在用生理溶剂替换所述溶液时去除所述变性剂，从而形成含所述不溶性抗原的生理溶液的步骤；和将含所述不溶性抗原的所述生理溶液转导入抗原呈递细胞的细胞质或细胞内。
27.根据权利要求沈所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
28.根据权利要求沈或27所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中构成所述核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种；和加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
29.根据权利要求沈至观中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中构成所述核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
30.根据权利要求沈至四中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中用于替换所述抗原的溶液的所述生理溶剂包含核苷酸。
31.根据权利要求沈至30中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是获自肿瘤细胞、肿瘤组织、传染病细胞或病原性细胞的破碎物的不溶性级分。
32.根据权利要求沈至31中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是蛋白质或肽。
33.根据权利要求沈至32中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
34.根据权利要求沈至33中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
35.根据权利要求沈至34中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
36.根据权利要求沈至35中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中在一种溶液中将所述不溶性蛋白质和/或肽与所述变性剂混合的步骤中，还加入还原剂。
37.根据权利要求沈至36中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
38.通过根据权利要求沈至37中任一项所述的产生方法产生的抗原呈递细胞。
39.用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法，所述方法包括将通过根据据权利要求沈至 37中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。
40.用于治疗或预防癌症和/或传染病的方法，所述方法包括将通过根据权利要求沈至37中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。
41.用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的组合物，所述组合物包含，作为活性成分的通过根据权利要求26至37中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。
42.用于治疗或预防癌症和/或传染病的组合物，所述组合物包含，作为活性成分的通过根据权利要求26至37中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。
全文摘要
公开了从通过变性剂的作用溶解的不溶性蛋白质和/或肽的溶液中去除变性剂时，通过将核苷酸加入到该溶液中，有效地加溶不溶性蛋白质和/或肽的方法。通过本发明的加溶方法可以溶解癌症、传染病等的疾病抗原蛋白质，并当将其转导入抗原呈递细胞中时，能够诱导疾病抗原特异的CTL。
文档编号C12N15/09GK102459308SQ20108002952
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月28日 优先权日2009年5月1日
发明者桑田惠里, 神原佳织, 野口活夫 申请人:迈世耐特股份公司