本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法。
背景技术：
急性st段抬高型心肌梗死(st-segmentelevationmyocardialinfarction,stemi)为累及心肌全层的透壁性心肌梗死，在急性期的死亡率极高，危害性很大。stemi的发病机制是在冠状动脉粥样硬化的基础上斑块破裂，斑块下脂质、胶原暴露，使血小板激活、附着、聚集，并最终激活血小板糖蛋白受体，使血小板聚集并结合纤维蛋白而致血栓形成，导致急性血管闭塞，进而导致闭塞血管供血区域心肌坏死。由于血小板聚集和激活在冠状动脉粥样硬化斑块形成及斑块破裂形成血栓过程中具有重要作用，因此目前冠心病治疗的重要策略仍然是防止血栓事件的发生。
目前临床上常用的抗血小板药物主要包括阿司匹林(抑制血小板花生四烯酸代谢)、氯吡格雷(抑制二磷酸腺苷adpp2y12受体活性)、替罗非班(抑制血小板膜gpⅱb/ⅲa受体活性)和西洛他唑(抑制磷酸二脂酶活性)等。这些药物大多数为不可逆性抑制并且为单靶点作用的药物，虽然能抑制血小板活化过程中的某个作用靶点，但由于其作用机制单一，服用后仍能通过其它靶点通路引起血小板的活化，使其治疗效果被减弱。研究表明，4-30％人群对氯吡格雷的反应性低下或无反应，这部分患者发生心血管事件的风险明显增加，严重影响患者的治疗效果和临床预后，这种现象被称为氯吡格雷抵抗，氯吡格雷抵抗患者在优化抗血小板治疗后，仍然存在一定程度的血小板聚集和活化，即治疗后血小板高反应。2011年7月获美国fda批准上市的替格瑞洛是第一个口服可逆p2y12受体抑制剂。2012年11月29日，替格瑞洛(商品名为倍林达)通过我国国家食品药品监督管理局(sfda)审批，正式进入我国市场。替格瑞洛是一种环戊基三唑嘧啶类药物，能够选择性地拮抗二磷酸腺苷受体，可逆性地作用于血小板细胞上的嘌呤2受体亚型p2y12，且不引起后者构象的改变，是目前治疗急性冠状动脉综合征的新型药物。onset/offset研究显示其在口服后比氯吡格雷起效更加快速，血小板抑制程度更高，同时又因其是可逆性抑制p2y12受体，因此在停药后比氯吡格雷更快使血小板功能恢复至正常水平。由于替格瑞洛无需肝脏代谢，可直接转化为活性物质，因此能够很好的适用于氯吡格雷抵抗的患者。替格瑞洛较氯吡格雷有更好的血小板抑制作用及降低心血管病风险的作用，在急性冠状动脉血栓性疾病中应用范围更广。
然而在血小板抑制剂药物的研究中发现，部分患者在服用替格瑞洛早期的一段时间后仍然存在一定程度的血小板聚集，降低了临床常规抗血小板治疗效果及增加了血栓事件的发生。由于替格瑞洛对stemi的作用及活性存在这种早期疗效方面的个体差异，因此寻找一种新的方法检测替格瑞洛对stemi患者的治疗效果，为检测替格瑞洛药效提供新的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对目前临床上急性st段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后的用药效果存在个体差异，一部分患者服用替格瑞洛后不能获得很好的抗血小板治疗效果并从中收益，从而提出一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测替格瑞洛药效的试剂盒，该试剂盒含有两条引物、总dna、2×kapahifihotstartreadymix和去离子水，所述引物为5’-actcctacgggrsgcagcag-3’和5’-ggactacvvgggtatctaatc-3’。
所述引物是根据肠道菌属16srdna所设计，所述肠道菌属为葡萄球菌属和不动杆菌属。
一种检测替格瑞洛药效的检测方法，该检测方法包括如下步骤
步骤1：将研究对象进行分组；
步骤2：从研究对象粪便中提取肠道菌群dna样本并进行总dna质检；
步骤3：利用权利要求1所述的试剂盒对总dna进行pcr扩增和产物定量；
步骤4：根据葡萄球菌属和不动杆菌属在研究对象相对丰度差异，确定研究对象服用替格瑞洛的药效。
该检测方法步骤1中dna质检方法，是利用紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳进行。
该检测方法步骤3是以稀释5倍后的总dna为模板，使用高保真酶进行pcr。
一种检测替格瑞洛药动学的方法，该方法检测替格瑞洛及主要代谢产物ar-c124910xx的血药浓度，通过高效液相色谱串联质谱法进行检测，包括如下步骤：
步骤1：从研究对象采取静脉血浆并-80℃保存备用；
步骤2：设定色谱条件和质谱条件；
步骤3：对血浆样本处理。
所述药动学为急性st段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后血浆中各时间点的替格瑞洛及其主要代谢产物ar-c124910xx的血药浓度，所述药效学为急性st段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后各时间点的adp诱导的血小板聚集率。所述串联质谱高效液相色谱法用0.1％甲酸水:乙腈＝3:7等度洗脱，流速为0.2ml/min；进样量为10μl。应用电喷雾电离源，多反应检测离子检测方式，离子源喷射电压为4500ev,源温度为450℃。
本发明包括以下有益效果：本发明提供了一种应用葡萄球菌属和不动杆菌属检测替格瑞洛的药动学和药效学的方法，通过肠道葡萄球菌属和不动杆菌属在stemi患者肠道中的相对丰度多少，能够检测患者服用替格瑞洛后的药物疗效，为临床指导药物调整及个体化抗血小板治疗提供了新的依据。
附图说明
图1：两组在门水平和属水平的物种相对丰度柱状图。(一)为两组在门水平的物种相对丰度柱状图；(二)为两组在属水平的物种相对丰度柱状图；a为正常反应组；b为高反应组。
图2：。正常反应组和高反应组alpha多样性分图。(一)为chao1指数多样性图；(二)为observed_species多样性指数图。
图3：正常反应组和高反应组服药前及服药后各时间点血小板聚集率检测。
图4：正常反应组和高反应组服药前后各时间点替格瑞洛血药浓度(ng/ml)。
图5：正常反应组和高反应组服药前后各时间点ar-c124910xx血药浓度(ng/ml)。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，下列附图和实施例仅用于说明本发明，但不以任何形式限制本发明。本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
实施例1
申请人收录了155例stemi患者，患者服用负荷剂量180mg替格瑞洛后2h后，根据光比浊法检测血小板聚集率(plateletaggregationrate，pa)，将pa≤59％患者分为血小板正常反应组(90例)，将pa＞59％患者分为血小板高反应组(65例)，通过检测两组患者服药后4h、6h、8h、12h和24h各时间点的血小板聚集率以及血浆中替格瑞洛和其主要代谢产物ar-c124910xx的血药浓度以阐明stemi患者服用替格瑞洛后的用药效果。并且通过检测两组患者的粪便样本中肠道菌群的16srdna测序及显著性差异分析研究，描述两组粪便微生物群落的差异，找出两组粪便样本中的差异菌属。
1、临床血液标本及粪便标本收集
155例于沈阳军区总医院心内科胸痛中心就诊并接受急诊冠脉介入治疗的stemi患者，对录入患者进行用药前评估肝肾功能，血糖血脂指标，基本情况如年龄、体重、吸烟、糖尿病、高血压、心肌梗死病史。录入患者病情诊断明确以及入院前评估完成后，给予首次180mg替格瑞洛负荷剂量以及90mg每日2次维持剂量进行治疗。留取两组患者服药前和服药后2h、4h、6h、8h、12h和24h静脉血样。并且共采集了60例st段抬高型心肌梗死患者的粪便样本(血小板正常反应组和高反应组各30例)，其中每个个体的新鲜粪便样本分成200mg/份，立即放入-80℃冰箱冻存。
2、一种肠道微生物16s多样性测序的检测方法，所述检测方法为：
应用qiaampdnastoolminikit试剂盒提取60例粪便样本中微生物基因组dna，提取完成后应用thermonanodrop2000紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳进行总dna质检。微生物16srdna扩增选择区域为v3-v4区域，使用引物为341f和806r。在通用引物的5’端加上适合hiseq2500pe250测序的index序列和接头序列，完成特异性引物的设计。
f：5’-actcctacgggrsgcagcag-3’(f341)
r：5’-ggactacvvgggtatctaatc-3’(r806)
同时，申请人制备一种检测替格瑞洛药效的试剂盒，该试剂盒含有两条引物、总dna、2×kapahifihotstartreadymix和去离子水，所述引物为5’-actcctacgggrsgcagcag-3’和5’-ggactacvvgggtatctaatc-3’。
以稀释5倍后的基因组dna为模版，使用高保真酶进行pcr，用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。
pcr反应条件：95℃预变性3mins；1个循环；98℃变性20sec，65℃退火15sec，72℃延伸45sec(共30个循环)，最后72℃终末延伸10mins，保存在4℃下。
pcr反应体系：40ul，如下表：
文库质检合格后，使用qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求进行相应比例的混合。最后使用illuminahiseq2500pe250进行测序。
3、根据葡萄球菌属和不动杆菌属在研究对象相对丰度差异，确定研究对象服用替格瑞洛的药效。
将序列完全一样的有效序列数(cleanreads)根据其丰度大小进行排序，利用usearch软件在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后得到用于物种分类的操作分类单元(out)，最后将所有有效序列数对比到操作分类单元上，将能比对上的操作分类单元的序列数提取出来，筛选的是操作分类单元中出现频数最高的序列作为out的代表序列。
对out代表序列进行物种的注释，并分别在门、纲、目、科、属水平统计各样本的群落组成。out的相对丰度用于主成份分析、物种聚类分析、组间差异分析，找出血小板正常反应组和高反应组的差异菌属。
结果：物种丰度分析显示：正常反应组和高反应组在门水平肠道菌群分布多为拟杆菌门、硬壁菌门和变形菌门；在属水平肠道菌群分布多为拟杆菌属、普氏菌属和巨单胞菌属，见图1。aplaha多样性分析是对单个样品中物种多样性的分析，包括chao1指数和observedspecies指数。aplaha多样性分析显示：chao1多样性指数在正常反应组和高反应组间分别为243.27和297.03；observedspecies多样性指数在正常反应组和高反应组间分别为198.27和235.35，且两指数的差异在两组间差异具有显著性统计学意义，p均＜0.001，见图2；因此两组间物种分布具有差异。组间差异分析显示：通过秩和检验，在正常反应组和高反应组间找出有明显差异(p＜0.001)的生物菌属，为葡萄球菌属和不动杆菌属，高反应组患者肠道分布明显多于正常反应组，见表1。
表1差异显著物种列表
在高反应组中，葡萄球菌属含量高于正常反应组475倍，不动杆菌属含量高于正常反应组155倍。结果表明葡萄球菌属和不动杆菌属在服用替格瑞洛的急性st段抬高型心肌梗死患者肠道中存在差异，葡萄球菌属和不动杆菌属在高反应组患者中含量明显高于正常反应组，可影响替格瑞洛对急性st段抬高型心肌梗死患者的治疗效果。
实施例2
一种检测替格瑞洛的药动学的方法，所述检测方法为：
从研究对象采取静脉血浆并-80℃保存备用。
应用高效液相色谱串联质谱法检测两组患者各时间点血浆中替格瑞洛及其主要代谢产物ar-c124910xx的浓度，主要步骤如下：两组患者各时间点静脉血经3000rpm离心10min，小心取出上清血浆200μl，并置于-80℃冰箱储存备用。色谱条件为：0.1％甲酸水:乙腈＝3:7，等度洗脱；流速：0.2ml/min；样量10μl。质谱条件为：应用电喷雾电离源，多反应检测离子检测方式，离子源喷射电压为4500ev,源温度为450℃。然后取待测血浆样品50μl置1.5ml离心管中，分别加入25μl内标溶液100ng/ml、25μl50％甲醇-水溶液，加入150μl甲醇，涡旋振荡30sec，12000rpm4℃离心10min，取上清10μl进行lc-ms/ms分析。
结果：两组患者一般临床资料见表2；两组血小板聚集率比较见图3；两组替格瑞洛血药浓度见图4，ar-c124910xx血药浓度见图5。和血小板正常反应组相比，血小板高反应组服药后4h、6h和8h各时间点血小板聚集率均明显高于正常反应组，且差异具有统计学意义(p＜0.05)。血小板高反应组检测的替格瑞洛及ar-c124910xx血药浓度服药后4h、6h和8h各时间点均低于正常反应组，且差异具有统计学意义(p＜0.05)。因此通过检测替格瑞洛的药代动力学和药效学指标发现，急性st段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后的药动学和药效学检测指标不一致，用药效果存在个体差异。结果表明，肠道葡萄球菌属和不动杆菌属丰度多的高反应组患者的替格瑞洛及其主要代谢产物ar-c124910xx的血药浓度在服药后早期(4h、6h和8h)明显低于正常反应组，由adp诱导的血小板聚集率在服药后早期(4h、6h和8h)明显高于正常反应组组。因此可以表明，肠道葡萄球菌属和不动杆菌属可以对急性st段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛的药动学和药效学进行预测，对部分替格瑞洛用药效果差的患者进行早期药物调整。
表2血小板正常反应组和高反应组一般临床资料
sequencelisting
<110>中国人民解放军沈阳军区总医院
<120>一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法
<130>2
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>引物
<400>1
actcctacgggrsgcagcag20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>引物
<400>2
ggactacvvgggtatctaatc21