本发明涉及兽医传染病技术领域，具体地说，涉及一种变异的兔病毒性出血症病毒及其在制备灭活疫苗中的应用。
背景技术：
兔病毒性出血症为急性、败血性传染病，该病具有极高的发病率和病死率，俗称“兔瘟”。该病潜伏期短，仅为1～3天，病兔主要呈现急性肝炎，脾脏肿大，肺脏出血，气管环状出血，严重时出现肝脏坏死，实质脏器水肿、弥漫性出血等典型病变。1984年，该病第一次在中国江苏大规模爆发，随后迅速蔓延至全国，致死一亿四千多万只家兔，之后世界各地均有发生，形成全球范围内传播。本病常爆发性流行，给兔业养殖带来了巨大危害，是目前规模化兔场的主要传染病之一。近年，兔感染兔病毒性出血症偏幼龄化，且商品化疫苗免疫过的兔种常出现免疫失败的情况。
兔病毒性出血症病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus，rhdv)属杯状病毒科。本病毒不凝集马、牛、羊、犬、猪、鸡、鸭、兔、大鼠、豚鼠和仓鼠的红细胞，仅能凝集人的“o”型红细胞，并在一定范围内不受温度、ph值、有机溶剂及某些无机离子的影响，对外界抵抗力较强，但可以被rhdv抗血清特异性抑制。该病毒在病兔脏器和体液中分布广泛，其中以肝、脾、肾、肺以及血液中含量最高。目前该病毒尚不能在各种原代或传代细胞中培养繁殖。
目前最好的预防措施就是采取佐剂组织灭活疫苗进行免疫。加入佐剂后免疫效果显著提高，且维持时间长。如庄国宏等采用皮下注射方法免疫接种rhdv油乳剂疫苗，兔子免疫接种50天后产生抗体极显著高于组织灭活疫苗接种兔的抗体水平，免疫保护率高。张小飞等将兔瘟氢氧化铝佐剂疫苗与常规组织灭活苗进行对比试验发现，免疫接种氢氧化铝佐剂苗兔免疫接种60～90天后hi抗体效价达到10log2以上，疫苗保存时间由8个月增长到12个月，稳定性好，便于生产中使用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种变异的兔病毒性出血症病毒及其在制备灭活疫苗中的应用。本发明利用该变异株制备了一种兔病毒性出血症油乳灭活疫苗(sh17株)，以预防rhdv变异株感染造成的兔病毒性出血症的流行。该疫苗副作用小，且具有较好的免疫安全性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种兔病毒性出血症病毒，该毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏名称为兔病毒性出血症病毒变异株sh17株，保藏编号为：cctccno:v201806。
本发明中的兔病毒性出血症病毒变异株sh17株是发明人自浙江某养殖场疑似兔病毒性出血症的病死兔中分离的自然感染毒，从特异性、毒力、免疫原性等方面进行鉴定，筛选出的毒力强、免疫原性好的毒株。
第二方面，本发明提供了一种兔病毒性出血症病毒的分离方法，包括以下步骤：
a、无菌采集病死兔的肝脏，将含毒的肝脏组织研磨，离心后，取上清，并过滤得滤液；
b、将步骤a制备的滤液接种45～55日龄易感非免疫兔，采集接种后12～60h内发病死亡兔具有典型病理变化的肝脏组织，用含毒的肝脏组织悬液通过易感非免疫兔连续传代培育，筛选即得兔病毒性出血症病毒变异株sh17株。
优选地，步骤a中，所述研磨具体为采用加入5倍量的灭菌生理盐水进行研磨；所述离心条件为：4000-10000r/min离心10-30min；所述过滤器的滤孔直径为0.45μm。
优选地，步骤b中，所述滤液的接种量为易感非免疫兔的每只腿肌肉注射1ml。
第三方面，本发明提供了一种根据权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒在制备兔病毒性出血症油乳灭活疫苗中的应用。
第四方面，本发明提供了一种兔病毒性出血症油乳灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、以权利要求1所述兔病毒性出血症病毒变异株sh17株作为种毒，接种45～55日龄易感非免疫兔，无菌采集接种后12～60h内发病死亡兔的肝脏，并剔除肝脏的结缔组织；
s2、将剔除结缔组织的肝脏充分研磨，制备成匀浆；将匀浆冻融，然后加入双抗，离心，取上清，加入甲醛后摇床灭活，得灭活组织悬液；
s3、将步骤s2中得到的灭活组织悬液与白油佐剂混合，4℃保存备用。
优选地，步骤s2中，所述具体为采用加入5-10倍体积的灭菌生理盐水进行研磨；所述冻融次数为3次。
优选地，步骤s2中，所述双抗为青霉素和链霉素，青霉素和链霉素的加入量各为1000iu/ml；所述离心条件为：4000r/min离心30min。
优选地，步骤s2中，所述甲醛的终浓度为0.4％；所述摇床灭活的温度为37℃、灭活时间为48-72h。
第五方面，本发明提供了一种根据前述方法制备的兔病毒性出血症油乳灭活疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明所获得的兔病毒性出血症病毒变异株sh17株，与目前国内分离的兔病毒性出血症病毒序列比对差异较大，其中主要抗原基因的同源性仅80％。且该毒株感染兔偏幼龄化，当前的兔病毒性出血症疫苗对该毒株没有有效的保护作用。
本发明所获得的兔病毒性出血症病毒变异株sh17株能够在兔体内稳定传代，根据该毒株制备的油乳灭活疫苗针对该变异株具有良好的保护性。本发明所制备的兔病毒性出血症油乳灭活疫苗采用成熟稳定的制作方法，工艺简单，操作方便，且制备出的疫苗抗原性好，安全性高，容易通过安全评价。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明所述sh17株与rhdv的遗传进化树分析；
图2为实施例1的rt-pcr扩增结果；其中：m为dl2000marker；1为病料组织；2为阴性对照；
图3为实施例3中疫苗免疫效力试验的剖检观察结果；其中：图3a为试验组的气管；图3b为试验组的肺脏；图3c为试验组的肝脏；图3d为对照组的气管；图3e为对照组的肺脏；图3f为对照组的肝脏；
图4为实施例3中疫苗免疫效力试验的剖检观察结果；其中：图4a为第一组的气管；图4b为第一组的肺脏；图4c为第一组的肝脏；图4d为第二组的气管；图4e为第二组的肺脏；图4f为第二组的肝脏。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中的兔病毒性出血症病毒变异株是发明人自浙江某兔场疑似兔病毒性出血症的病死兔中分离的自然感染株。本次分离的变异株与传统毒株的抗原性差异较大，这可能是传统兔病毒性出血症病毒株灭活苗不能完全保护兔种抵抗变异株的原因。
本发明中涉及的兔病毒性出血症病毒sh17株是变异株，与国内以前报道的传统rhdv相比，它们之间序列差异性较大，其主要抗原基因(衣壳蛋白)的氨基酸同源性较低(表1)，进化树分析结果也显示，它与传统的rhdv流行株遗传距离较远，且不位于同一进化分支，而是形成一个独立分支(图1)。说明sh17与我国的一些传统rhdv处于不同拓扑群，证明sh17株是一株变异的rhdv分离株，试验结果进一步证明，现有的商品化兔病毒性出血症疫苗不能完全保护被rhdv变异株感染的兔(表2)。因此，本发明以rhdv变异株sh17株做疫苗用种毒，制备了一种可用于预防rhdv变异株感染的灭活疫苗。
表1sh17株与传统rhdv毒株衣壳蛋白的氨基酸序列同源性比对结果
实施例1
兔病毒性出血症病毒变异株sh17株的分离鉴定
采集病死兔的肝脏用灭菌生理盐水作5倍稀释研磨，10000r/min离心10min，取上清，并用0.45μm滤器过滤，得滤液，置于-20℃备用。
根据genbank上公布的rhdv的vp60核酸序列设计特异性引物，上游引物p1(seqidno.1)：5’—cgcacagcgccgcaaggcgaagc—3’，下游引物p2(seqidno.2)：5’—tcagacataagaaaagccattgg—3’，扩增rhdvvp60基因部分片段1725bp。用trizol法提取前述采集的发病兔肝组织的rna，并用m-mlv反转录成cdna，并用其作为模板进行rt-pcr扩增，反应条件为95℃预变性3min，94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min45s；30个循环，最后延伸10min。pcr结束后，1％琼脂糖凝胶电泳。结果显示在1700bp处出现一条特异性条带(图2)。经blast比对，扩增片段与国内分离的rhdv的vp60基因同源性仅有80％，因此初步判断该毒株是rhdv变异株。
稳定性试验及毒力鉴定
取4只健康易感非免疫试验兔，腿部肌肉注射前述步骤所得处理好的组织悬液(即前述的滤液)，每只1.0ml，采集死亡接种兔的肝脏病料；重复以上试验步骤，连续4次。结果表明：攻毒的兔100％死亡，且死亡时间在18～48h，说明获得了稳定的兔病毒性出血症病毒，并命名为sh17株，将其保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏名称为兔病毒性出血症病毒变异株sh17株，保藏编号为：cctccno:v201806(保藏日期：2018年1月24日，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)。死亡兔鼻孔出血，解剖观察可见气管环状出血，潮红，肝脏出血严重，说明该分离株具有很强的致病力，是强毒株。
兔病毒性出血症病毒变异株sh17株的传代培养
将保藏后的兔病毒性出血症病毒变异株sh17株用灭菌生理盐水作5倍稀释，接种于45～55日龄的健康易感非免疫兔。每只腿部肌肉注射1ml。无菌采集接种后12～60h内死亡的兔种，无菌采集具有典型病理变化的肝脏组织，并剔除其上的结缔组织作为毒种。
采用传4～10代的毒株sh17株接种，将剔除结缔组织的死亡兔的肝脏病理组织加生理盐水研磨过滤，肝脏病理组织与灭菌生理盐水的比例为1:5(w/v)。加入青霉素、链霉素各1000iu/ml，4000r/min离心30min，吸取上清液，-20℃中保存。
实施例2兔病毒性出血症组织悬液制备
将保藏后的兔病毒性出血症病毒变异株sh17株(即实施例1中经传代培养获得的上清液)用生理盐水作5倍稀释，接种于45～55日龄的健康易感非免疫兔。每只腿部肌肉注射1ml。无菌采集接种后12～60h内死亡的兔种，无菌采集具有典型病理变化的肝脏组织，并剔除其上的结缔组织作为毒种。
将前述的毒种传4-10代后接种至健康易感非免疫兔中，然后无机采集接种后12～60h内死亡的兔的肝脏，将剔除结缔组织的死亡兔的肝脏加生理盐水研磨过滤，肝脏病理组织与灭菌生理盐水的比例为1:5(w/v)，制备成匀浆。冻融3次，加入青霉素、链霉素各1000iu/ml，4000r/min离心30min，取上清即得组织悬液，按照组织悬液总量的0.4％加入甲醛溶液(终浓度0.4％)进行灭活，灭活条件为：在37℃摇床灭活48～72h。灭活结束后进行无菌检验、灭活检验。结果是没有细菌生长，且免疫的兔子未出现死亡。由此获得灭活组织悬液。
实施例3疫苗评价试验
灭活疫苗的制备
将实施例2中采用毒种的传4代sh17株制备灭活组织悬液与白油佐剂按1:1的比例混合，得灭活疫苗，于4℃保存备用。
疫苗安全性试验
购买15只spf新西兰兔，随机分三组，每组5只。第一组皮下接种1ml前述的灭活疫苗；第二组皮下超剂量接种2ml前述的灭活疫苗；第三组为对照组，皮下注射1ml灭菌生理盐水。每组试验兔均在隔离器中饲养，连续观察一周。结果，均未见不良反应，表明该灭活苗安全性好。
疫苗免疫效力试验
购买10只spf新西兰兔，随机分两组，每组5只。试验组每只皮下注射1.0ml第4代sh17株制备的灭活疫苗，另5只健康新西兰兔作为对照。免疫后3周，对两组新西兰兔进行攻毒，每只腿部肌肉注射实例1中制备的2倍致死量病毒液。每组试验兔均在隔离器中饲养，观察1周，试验组新西兰兔全部健活，对照组全部死亡。疫苗对兔病毒性出血症的保护率100％，对照组死亡率100％(表2)。将所有试验兔剖检观察，可见试验组的脏器未见明显病变；对照组的气管环状出血、肺脏和肝脏出血严重(图3)。由此可见本发明兔病毒性出血症油乳灭活疫苗(变异株)具有良好的免疫保护性。
购买15只spf新西兰兔，随机分三组，每组5只。第一组每只皮下接种1.0ml第4代sh17株制备的灭活疫苗，第二组每只接种1.0ml市售兔病毒性出血症病毒组织灭活苗，第三组作为空白对照。免疫后3周，对第一组和第二组新西兰兔进行攻毒，每只腿部肌肉注射2倍致死量病毒液。每组试验兔均在隔离器中饲养，观察1周，第一组新西兰兔全部健活，第二组全部发病。将试验兔剖检观察，可见第一组的脏器未见明显病变；第二组的气管环状出血、肺脏和肝脏出血严重，见图4。由此可见本发明兔病毒性出血症油乳灭活疫苗(变异株)较市售兔病毒性出血症病毒组织灭活苗更能保护兔种抵抗兔病毒性出血症病毒变异株的侵袭。
表2sh17株灭活疫苗与市售疫苗攻毒保护结果
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>一种变异的兔病毒性出血症病毒及其在制备灭活疫苗中的应用
<130>dag35763
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgcacagcgccgcaaggcgaagc23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcagacataagaaaagccattgg23